Method Article

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

DOI:

10.3791/57543

⸱

May 21st, 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבידוד יעיל וחזק והתרבות של ראשי oligodendrocytes להפוך (OLs) הוא כלי בעל ערך לצורך המחקר במבחנה של הפיתוח של oligodendroglia, כמו גם הביולוגיה של אונים כגון טרשת נפוצה, Pelizaeus-Merzbacher-כמו מחלה (PMLD). כאן, אנו מציגים פשוטה, בחירה יעילה שיטת הבידוד immunomagnetic של שלב O4 3+ preoligodendrocytes תאים מן הגורים עכברים neonatal. מאז ילדותי OL מהווים יותר מ 80% של החומר הלבן מכרסם-מוח ביום כמחנכת 7 (P7) שיטה זו בידוד לא רק מבטיחה תשואה גבוהה הסלולר, אלא גם הבידוד ספציפי של OLs כבר מחויבים השושלת oligodendroglial, להקטין אפשרות לבודד תאים מזהמים כגון האסטרוציטים ותאים אחרים מהמוח העכבר. בשיטה זו הוא שינוי של טכניקות שדווחו בעבר, ומספק אוליגודנדרוציטים טוהר הכנה מעל 80% בכ-4 שעות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocytes להפוך (OLs) הם תאים myelinating של מערכת העצבים המרכזית (CNS)1. הבידוד והתרבות של ראשי oligodendrocytes להפוך בסביבה בחוזקה מוסדר הוא כלי בעל ערך לצורך המחקר במבחנה של הפיתוח של oligodendroglia, כמו גם הביולוגיה של אונים כגון טרשת נפוצה2 . פעולה זו דורשת יעיל וחזק אוליגודנדרוציטים בידוד ותרבות שיטה3. במחקר זה, ניצלנו הביטוי של סמן משטח תא אוליגודנדרוציטים ייחודי ליישם טכניקה בידוד ששונה הוא מהיר ולא ספציפי.

ארבעה שלבים של התבגרות אוליגודנדרוציטים זוהו, כל אחד מאופיין על-ידי הביטוי של סמני פני שטח התא ייחודי עבור כל שלב התפתחותי (איור 1). סמנים אלה פני שטח התא ניתן לזהות על ידי נוגדנים ספציפיים4,5, והוא יכול לשמש כדי לבודד OLs בשלבים מסוימים. בשלב הראשון, אוליגודנדרוציטים קודמן תאים (OPCs) יש את היכולת להתרבות, להעביר, במיוחד לבטא פקטורי גדילה נגזר טסית קולטן (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, פרוטאוגליקן NG27,8 , polysialic חומצה-עצבי תא אדהזיה מולקולה9 ושומן-חומצה-מחייב חלבון 7 (FABP7)10. OPCs יש מורפולוגיה דו קוטבי עם כמה תהליכים קצר שמקורם הפולנים מנוגדות בגוף התא, אשר מאפיינת של תאים עצביים קודמן11.

דיאגרמת התבגרות אוליגודנדרוציטים; שלבים עם סמנים: OPC, Preoligodendrocyte, לא בוגר, בוגר.
איור 1: ביטוי של סמני פני שטח התא במהלך ההתפתחות אוליגודנדרוציטים העכבר. OLs תא סמני פני שטח כגון A2B5, GalC (נתיבים1), NG2, O4 ו PDGF-Rα ניתן לבודד oligodendrocytes להפוך בשלב התפתחותי מסוים ספציפי באמצעות נוגדנים ייחודיים.   אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בשלב השני, OPCs להצמיח preoligodendrocytes ולבטא את קרום התא לא רק סמנים OPC, אלא גם את sulfatide (sulfated galactolipid) מזוהה על-ידי O4 נוגדן12,13, את החלבון GPR1714, להתקיים עד השלב אוליגודנדרוציטים ילדותי (OL). בשלב זה, preoligodendrocytes להרחיב תהליכים קצר multipolar. Preoligodendrocytes הם השלב OL הגדולות ביום כמחנכת 2 (P2) בחומר הלבן במוח של עכבר ועכבר עם אוכלוסיה קטנה של OLs לא בוגר15.

בשלב השלישי, OLs ילדותי להמשיך אקספרס O4, לאבד את הביטוי של סמנים A2B5 ו- NG2, להביע את galactocerebroside C16. בשלב זה, מחויבים השושלת oligodendroglial וחקירות להפוך לתאי mitotic פוסט עם סניפים זמן כחוד17,18. לא בוגר OL מהווים יותר מ- 80% של החומר הלבן מכרסמים-P7, בשלב זה התאים MBP+ הראשון הם נצפו15,19,20,21. לכן, בידוד של OLs-P7 יכול להבטיח תשואה גבוהה הסלולר.

בשלב הסופי והרביעית של פיתוח OL, בוגר OLs חלבונים myelinating אקספרס (חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), חלבון proteolipid (פיפ), המיאלין הקשורים גליקופרוטאין (מג) ו המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א)22,23 ,24,25,26. בשלב זה, בוגרת להרחיב ממברנות הזה קומפקטי טופס enwrapping מעילי פרווה סביב האקסונים וחקירות מסוגלים שעוטף. זה עולה בקנה אחד עם התצפית כי במוח החולדה, העכבר, תאים MBP+ הופכים יותר ויותר שופע P1419,20,21.

מאז הבידוד הראשון של אוליגודנדרוציטים על ידי Fewster ועמיתיו בשנת 196727, יושמו מספר שיטות עבור בידוד של OLs מ למכרסמים CNS כולל28,immunopanning29,30, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניצול תא השטח הספציפי אנטיגנים28,31, צנטריפוגה הדרגתיות דיפרנציאלית32,33,34,35 שיטה חזק המבוסס על הדבקות דיפרנציאלית של CNS שונה עכשיו, דונלד36,37. עם זאת, קיימות שיטות יש מגבלות, במיוחד במונחים של טוהר, תשואה, הזמן הנדרש כדי לבצע את ההליכים38. לכן, שיטות בידוד יעיל יותר oligodendrocytes להפוך נדרשים.

בנייר זה, אנו מציגים פשוטה, בחירה יעילה שיטת הבידוד immunomagnetic של שלב O4 3+ preoligodendrocytes תאים מן הגורים עכברים neonatal. בשיטה זו הוא שינוי של טכניקות שדווחו על-ידי אמרי. et al. 39 ו. Dincman et al. 40 ומספק של טוהר הכנה אוליגודנדרוציטים מעל 80% בכ-4 שעות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העכברים השתמשו במחקר זה היו מטופלים בהתאם לקווים המנחים של המספר פרוטוקול SUNY Downstate רפואי מרכז חלוקה של מעבדה חיה משאבים (DLAR) 15-10492.

הערה: oligodendrocytes להפוך הראשי הם בודדו אותנו מהמתרחש neonatal (P5-P7 פראי-סוג C57Bl/6N) עכברים. בשלב זה, לא בשלה OLs מהווים יותר מ- 80% של החומר הלבן מכרסמים הבטחת תשואה גבוהה הסלולר. כל מאגר של יצירות ריאגנט זמינים בסוף הטבלה של חומרים.

1. Coverslips הכנה

הערה: פוליפוני-D-ליזין (PDL) / coverslips laminin מצופה להיות מוכנים לפני OL בידוד.

  1. המקום #1 גרמנית זכוכית coverslips לתוך צינור חרוטי 50-mL ולהוסיף 35 מ ל 70% EtOH כדי לנקות אותם.
  2. סגור את הצינור, למקם אותו במיקסר nutating, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות תוך בעדינות נדנדה. יכול להיות מודגרות Coverslips בן לילה.
  3. למחוק את EtOH 70%.
  4. לשטוף את coverslips 3 פעמים עם מים יונים, להסיר את המים בכל פעם עם השאיפה ואקום.
  5. להוסיף 30-35 מ ל PDL 50 µg/mL coverslips בצינור 50-mL, מספיק כדי לכסות על coverslips.
  6. מקם את הצינור 50-mL המכיל את coverslips על מיקסר nutating, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות תוך נדנדה בעדינות.
  7. לשטוף את coverslips 3 פעמים עם מים יונים, הסרת את המים בכל פעם עם השאיפה ואקום.
  8. להעביר את coverslips 60 מ מ פטרי המכילות מים יונים.
  9. השתמש טיפ פיפטה P200 כדי לארגן את coverslips כשכבה מכסה את כל פני השטח של הפטרי.
  10. . בזהירות, הסר את המים הכלים עם שאיפה ואקום.
  11. להסיר את המים סביב coverslips ולתת להן להתייבש למשך הלילה עם מכסה פתוח, תחת אולטרא סגול בשכונה.
    הערה: PDL מצופה coverslips זכוכית דקה ניתן לאחסן ב 4 ° C בפטרי סטריליות עד שלושה חודשים.
  12. מקם את coverslips לוחות 24-. ובכן, אחד לכל טוב, באמצעות מלקחיים בסדר.
  13. להעביר את coverslips מרכז טוב מוודא שהקצוות אל תיגע בקיר של הבאר.
  14. להוסיף 100 µL של 10 µg/mL laminin מעורבבת עם B27NBMA (ראה טבלה של חומרים) מתחיל במרכז של כל coverslip והעברתו בצורה מעגלית, לכיוון הקצוות כדי לכסות את כל האזור.
    הערה: כיוון laminin מעורב OL תחזוקה ומקדם בידול לתוך OLs בוגרת, היא גורם חשוב של הישרדות OL in vitro לקשרי תרבות41,42,43,44.
  15. דגירה על צלחת 37 ° C החממה ב- 5% CO2 לפחות שעה או עד OLs מוכנים ציפוי.

2. העכבר דיסוציאציה קליפת המוח

  1. להקריב כמחנכת 5-7-יום הישן C57Bl/6N העכבר הגורים ע י עריפת ראשו מהירה עם מספריים בעבר נוקה ב-70% אתנול.
    הערה: מוחי cortices מ- 5-6 עכברים neonatal הגורים שימשו כל הכנה. בממוצע, מוח העכבר אחת מניבה 1-1.5 x 106 OLs.
  2. לחתוך את העור בקרקפת לאורך הקו האמצעי עם מספריים קטנות ויבתר ומשכו לחשוף את הגולגולת.
  3. לחתוך את הגולגולת בקפידה לאורך הקו האמצעי החל מפתיחת מאחורי הגולגולת לכיוון האזור חזיתית, מרימים עם המספריים כדי למנוע נזק למוח. לאחר מכן, באמצעות פתיחת מאחורי הגולגולת לחתוך לכיוון כל ארובת העין לאורך הבסיס של הגולגולת.
  4. השתמש בסדר מלקחיים בעדינות להקניט את cortices מן המוח האמצעי ולהעביר אותם לצלחת תרבות רקמות 60 מ מ המכיל 7 מ של B27NBMA. חזור על הצעדים 2.2 דרך 2.4 כל המוח, צירוף של cortices גזור.
  5. להעביר את cortices תבשיל תרביות רקמה 60 מ מ חדש המכיל 5 מיליליטר דיסוציאציה מאגר (B27NBMA, פפאין U/mL 20-30 ו- 2,500 U DNase אני).
  6. חותכים לקוביות את cortices לחתיכות קטנות של 1 מ מ3 באמצעות סכין #15 אזמל, תקופת דגירה של 20 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.
  7. להוסיף 1 מ"ל בסרום הצמיחה שור (מביע רק) כדי לעצור את התגובה אנזימטיות.
  8. להעביר את cortices יחד עם כלי התקשורת דיסוציאציה צינור חרוטי 15-mL באמצעות pipet סרולוגית 10 מ.
  9. בעדינות נתחיל לנתק את רקמת המוח על-ידי pipetting לאט לאט למעלה, למטה 6 - 8 פעמים באמצעות pipet סרולוגית 10-mL, באמצעות טיפול למזער את בועות.
  10. לאפשר את חתיכות רקמה להתפשר על 2-3 דקות ולהעביר את תגובת שיקוע ל צינור טריים.
  11. להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/2500 U DNase I הרקמה גלולה.
  12. השתמש פיפטה סרולוגית 5 מ ל לנתק בעדינות על רקמת המוח בזמן pipetting למעלה ולמטה 6 - 8 פעמים. להיות זהירים כדי למזער את בועות.
  13. לאפשר את חתיכות רקמה להתפשר על 2-3 דקות.
  14. להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים. להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase I הרקמה גלולה.
  15. בעדינות מביצועם על רקמת המוח באמצעות טיפ pipet P1000, תוך pipetting את המיקס של מדיה, במוח רקמות למעלה ולמטה. חזור על השלבים 2.13 ו 2.14 עד אין נתחים גדולים של רקמות להישאר או עד B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase מוטשת, מה שיבוא קודם. להיות זהירים כדי למזער את בועות.
  16. ההשעיה תא בריכה עם supernatants הקודם.
  17. מניחים מסננת תא 70-מיקרומטר בשפופרת 50-mL. שימוש pipet סרולוגית 10-mL, להעביר את התליה תא במאגר בעדינות מסננת תא 70-מיקרומטר.
  18. לשטוף את מסננת תא על-ידי הוספת 1 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase אני.
  19. למחוק את מסננת התא. להביא את אמצעי האחסון 30-mL עם B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase אני.
  20. העברה התליה תא שני צינורות חרוט 15-mL. Centrifuge התליה תא 10 דקות ב- 200 x g.
  21. הסר את תגובת שיקוע מבלי להשאיר את התאים ייחשף לאוויר. תגובת שיקוע יהיה מעונן בגלל שאריות תאים. להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק כדי בגדר.
  22. בזהירות מביצועם בגדר התא באמצעות pipet של P1000. להביא את אמצעי האחסון 15 מ"ל עם B27NBMA המכיל 10% BGS.
  23. לעבור התליה תא מעל מסננת תא מיקרומטר 40 טריים.
  24. לשטוף את מסננת תא על-ידי הוספת 1 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% BGS. למחוק את מסננת התא.
  25. להביא את אמצעי האחסון 30 מ עם B27NBMA המכיל 10% BGS.
  26. העברה התליה תא צינורות חרוט 2 x 15-mL. Centrifuge התליה תא 10 דקות ב- 200 x g.
  27. להסיר את מרבית תגובת שיקוע מבלי להשאיר את התאים ייחשף לאוויר. Resuspend תא כדורי ב 5 מ של תא מגנטי קר קרח, מיון מאגר (MCS).

3. קביעת ספירת התאים ואת הכדאיות

  1. לדלל µL 100 של התליה תא עם 400 µL של פתרון Trypan Blue צינור 1.5-mL microcentrifuge כדי להשיג לדילול 1:5 ב- 0.4% (w/v).
  2. מרכז זכוכית מכסה מעל hemocytometer קאמרית, מילוי התאים שני עם µL 10 של דילול תאים באמצעות פיפטה P10 והימנעות תמלא יותר מדי. הפתרון יעברו תחת הזכוכית המכסה על ידי נימיות.
  3. מניחים את hemocytometer על הבמה מיקרוסקופ והתאימו את המוקד באמצעות הגדלה X 40.
    הערה: תא ספירת נרשמים באמצעות מונה ידניים בכל חמש משבצות (ארבע הפינות, מרכז אחד). רק כלכלית תאים סופגים את צבען ומופיעים כחול, בעוד בשידור חי, תאים בריאים מופיעים עגול, השבירה, אינם סופגים לצבוע בצבע כחול, המאפשר קביעת מספר התאים הכולל ובר קיימא למיליליטר.

4. בידוד של O4+ oligodendrocytes להפוך

  1. Centrifuge התליה תא ב 200 g x 10 דקות.
  2. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע באמצעות שאיפה ואקום, הימנעות מחשיפה של תאי האוויר.
  3. Resuspend בגדר ב 90 µL מאגר תקליטנים לכל עונה 1 פרק 107 הכולל תאים ואחריו התוספת של 10 µL של אנטי-O4 חרוזים לכל עונה 1 פרק 107 תאים.
  4. מערבבים את התא ההשעיה, חרוזים על ידי מצליף בעדינות את הצינור 15-mL חרוט עם האצבע 4 - 5 פעמים.
  5. דגירה לערבב למשך 15 דקות ב 4 ° C, מצליף הצינור חרוט 15-mL עם האצבע timesevery 4-5 5 דקות.
  6. לשטוף את התערובת על-ידי הוספת בעדינות 2 מ של מאגר תקליטנים לכל עונה 1 פרק 107 תאים הצינור. Centrifuge את המיקס ב 200 g x 10 דקות.
  7. למחוק את תגובת שיקוע באמצעות בקפידה השאיפה ואקום, הימנעות מחשיפה של תאי האוויר. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL MCS מאגר עבור כל התאים7 עונה 1 פרק 10.
  8. לצרף מפריד מגנטי עמדה הפרדה מגנטית. לצרף עמודת בחירה במפריד מגנטי ומניחים על מסננת תא 40 µm יוליאנוס. מקום שני 15-mL או שפופרת אחת של חרוט 50-mL מתחת לעמודת ההפרדה כדי לאסוף את הזרימה.
  9. מראש יש לשטוף את 40-מיקרומטר תא מסננת והפרדה העמודה עם 3 מ"ל של מאגר תקליטנים ותנו המאגר לרוץ דרך העמודה מבלי לתת לו להתייבש.
  10. הוסף את התמהיל של הבולם תא וחרוזים מסננת את התא, לתוך עמודת בחירה.
  11. לשטוף את מסננת תא 40 מיקרומטר עם 1 מ"ל של מאגר תקליטנים.
  12. למחוק את מסננת תא ולתת את התמהיל של תאים, חרוזים, מאגר לרוץ דרך העמודה מבלי לתת לו להתייבש.
  13. לשטוף את העמודה ההפרדה 3 פעמים עם 3 מ"ל של MCS מאגר זמן 1 עם OL תפוצת המדיה.
  14. הסר את העמודה ההפרדה המפריד מגנטי, במהירות למקם אותו לתוך צינור חרוטי 15-mL ולהוסיף מיד 5 מיליליטר OL תפוצת המדיה.
  15. במקום פומפה על גבי העמודה ולדחוף בחוזקה כדי לשטוף את התאים שכותרתו לתוך הצינור חרוט 15-mL.
  16. הסר µL 100 של השעיה תא לקבוע ספירת התאים ואת הכדאיות באמצעות Trypan Blue ו- hemocytometer כמצוין בסעיף 3.
    הערה: תא הכדאיות מעל 80% נחשב מקובל להמשיך עם התרבות של OLs, אך הכדאיות גדול מ- 90% היא אופטימלית.

5. ציפוי של O4 מבודד+ oligodendrocytes להפוך

  1. לדלל התליה תא התשוקה יופיצ צפיפות (5 x 105 תאים לכל coverslip) באמצעות מדיה התפשטות OL.
    הערה: OL זריעה צפיפות הוא מאוד חשוב, אז צפיפות תאים מתאים יש לאשר באמצעות מיקרוסקופ תרביות רקמה לפני שתמשיך. זריעה צפיפות מתחת 10,000 תאים/coverslips עלול להוביל הישרדות cell המסכן. -ציפוי צפיפות-OL 10,000 כדי 25,000, בידול מורפולוגי הוא איטי45. אנחנו צלחת OLs-צפיפות זריעה לפחות 50,000 תאים coverslips כדי להבטיח הישרדות cell.
  2. הזז את הצלחות 24-ובכן המכיל coverslips מצופה laminin של חממה מכסה המנוע תרביות רקמה.
  3. הסר laminin של כל coverslip ולהחליף אותו עם µL 100 של השעיה OL.
  4. דגירה OLs בחממה 37 °C/5% CO2 לתקופה מקסימלית של 45 דקות על מנת לקדם OL הדבקה על coverslips.
  5. לאחר דגירה, הסר את הצלחות 24-ובכן החממה. להציף את כל טוב של צלחת 24-ובכן עם 500 µL OL תפוצת המדיה.
  6. מקם את OLs בחזרה בחממה 37 °C/5% CO2 עבור 24 שעות נוספות.
  7. 24 שעות לאחר ציפוי של OLs, להסיר את תפוצת המדיה, תחליף עם OL מדיה בידול כדי ליצור בידול.
  8. למקם את OLs בחזרה בחממה, אל תסיר עד התאים מוכן עבור קיבעון.
    הערה: שינויים ב- pH פוגמים עבור OLs ו להקטין את הכדאיות התא, ולכן יש להימנע מיותר הסרה של תרבויות OLs מתוך החממה.

6. immunofluorescence מכתים

  1. איתור תא סמני פני השטח (NG2, O1 ו- O4) להסיר לתקשורת מן הבארות.
  2. להוסיף 250 µL של העכבר ליפידים supernatants המכיל נוגדנים ראשי O1 (מדולל)13 ו- O4 (מדולל)13 , ארנב polyclonal נגד NG2 (1:150 מעורבבת עם B27NBMA).
    הערה: אם נוגדנים anti-O1 ו- anti-O4 זמינים מסחרית כדי לשמש, מומלץ לנצל את דילולים שהוצעה על ידי היצרן.
  3. דגירה התאים עם נוגדן ראשוני למשך 45 דקות מקסימום בחממה2 37 °C/5% CO.
  4. לשטוף פעמיים עם 0.05% Tween-20/1 X PBS. לתקן את התאים paraformaldehyde 4% (4% PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  6. לדלל עז מצומדת אלקסה 488 אנטי עכבר IgM או ארנב אנטי איג משני נוגדנים (1:400) ב- B27NBMA.
  7. הסר 0.05% ל- PBS Tween-20/1 X coverslips. דגירה התאים עם נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
  8. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  9. זוגי מכתים איתור סמנים פנימית (GFAP), להסיר 0.05% Tween-20/1 X PBS התאים ו- permeabilize/בלוק עם בלוק/permeabilization מאגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. אחרת המשך לשלב 6.17.
  10. להסיר לחסום/permeabilization מאגר ולהוסיף 250 µL עוף אנטי-GFAP (1: 100) מדולל במאגר בלוק/permeabilization.
  11. דגירה התאים עם אנטי-GFAP לשעה בטמפרטורת החדר. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  12. לדלל עז מצומדת אלקסה 594 עוף אנטי איג משני נוגדנים (1:400) ב- B27NBMA.
  13. הסר 0.05% ל- PBS Tween-20/1 X coverslips. דגירה התאים עם נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
  14. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Counterstain עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) והר התאים עם antifade הרכבה המדיה המכילה דאפי.
  16. תן coverslips לרפא בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר.
  17. תמונה התאים ויטראז'ים עם מיקרוסקופ epifluorescence.
    הערה: ב פרוטוקול זה, התאים היו עם תמונה בהגדלה X 40 באמצעות זמן חשיפה אחידה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מחקר זה היתה להקים שיטה בידוד משופר עבור O4+ העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך הדורשים מניפולציה שפחות של תאי היעד. ההליך כולו של המתת חסד של הגורים ציפוי של התאים coverslips לוקח כ 4 שעות, הנתונים המוצגים כאן מייצגים 3 ניסויים עצמאית. לאחר רקמת דיסוציאציה, ממוצע של 4.3 ± 0.46 x 107 תאים היו מבודדים עבור ניסוי עצמאית, עם יכולת הקיום של 91% ± 5.6%. לאחר בידוד immunomagnetic באמצעות אנטי-O4 מתויג גרגרי מגנטי ממוצע של ± 0.38 x 10 6.96 OLs התקבלו (1-1.5 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקשורת זו, אנו מציגים שיטת הבידוד יעיל של תרבויות אוליגודנדרוציטים עכבר לא בוגר נקיים במיוחד. לעומת פרוטוקולים שפורסמו בעבר39,40, שיטה זו הניבה טוהר גבוהה יותר עם רמה נמוכה יותר של GFAP-חיוביות האסטרוציטים ואחוז נמוך מאוד של תאים אחרים שאינם מאופיין. חשוב לציין שאלו הן ילדותי OLs ביצע כבר לשושלת oligodendroglial. לפיכך, תאים אלה לא יהיה שימושי עבור חקר השלבים המוקדמים של בידול.

אחד השינויים מכל פרוטוקול Dincman40

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין גילויים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מן האגודה לטרשת נפוצה הלאומית (RG4591A1/2) של מכון הבריאות הלאומי (R03NS06740402). המחברים מודים ד ר איוון הרננדז ואנשי המעבדה שלו על מתן שטח, ציוד וייעוץ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 מ"ל פיפטים סרולוגייםפישר סיינטיפיק13-676-10J
מזרק 10 מ"ל Luer-Loc tipBD, Becton Dickinson309604
צינורות חרוטיים 15 מ"לFalcon352097
צלחות תרבית רקמות 24 בארותFalcon353935
40µ מסננת תאים mפישר סיינטיפיק22368547
צינורות חרוטיים 50 מ"לפלקון352098
5 מ"ל פיפטים סרולוגייםפישר סיינטיפיק13-676-10H
60 מ"מ צלחות תרבית רקמותפלקון353002
70 ומיקרו; מסננת תאים MFisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משניInvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgM (H+L) נוגדן משניInvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgM (H+L) נוגדן משניInvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 עיזים נגד עוף IgG (H+L) נוגדן משניInvitrogenA11042
Anti-O4 חרוזים- Anti-O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Apo-Transferrin HumanSigmaT1147
Autofil מכלול מסנן בקבוק עליון שלם, מסנן 0.22um, 250 מ"לUSA Scientific6032-1101
Autofil מסנן בקבוק שלם הרכבה, מסנן 0.22um, 250 מ"לארה"ב Scientific6032-1102
B27 תוסףInvitrogen17504-044
חומצה בוריתSigmaB7660
סרום צמיחת בקר (BGS)GE Healthcare Life SciencesSH30541.03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-ביוטיןSigmaB4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I)וורת'ינגטוןLS002007
EDTAFisher ScientificS311
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מצלמת Olympus DP70OlympusBx51
אזמל חד פעמי נוצהAndwin ScientificEF7281C
ForskolinSigmaF6886
כיסויי זכוכית גרמניים, עובי #1, קוטר 12 מ"מ עגולNeuVitroGG-12-oz
GFAP נוגדןAvesGFAP
גלוקוזפישר מדעיD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
אינסוליןInvitrogen12585-014
מעמד מפריד מגנטי - MACS multistandMiltenyi Biotec130-042-303
מפריד מגנטי-מפריד MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0.22& יחידת מסנן mMilliporeSLG033RS
מדיית הרכבה- להאריך זהב עם DAPIThermo FisherP36930
N-אצטיל-ציסטאין (NAC)SigmaA8199
למינין עכבר טבעיInvitrogen23017-015
מדיום נוירובזאלי AInvitrogen10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)Peprotech450-03
NG2 נוגדןMilliporeAB5320
פפאיןוורת'ינגטוןLS003126
PBS ללא Ca2+ ו-Mg2+SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
צלחות פטריפלקון351029
פולי-D-ליזיןסיגמאP6407
פרימוציןInvivogenant-pm-2
פרוגסטרוןסיגמאP8783
פוטרסיןסיגמאP5780
עמודת בחירה-עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401
נתרן סלניטסיגמאS5261
יסודות קורט Bקורנינג25-000-CI
Triiodothyronine (T3)SigmaT6397
Triton-XSigmaT8787
Trypan Blue SolutionCorning25-900-CI
Tween 20SigmaP1379
B27NBMA487.75 מ"ל נוירובזאלי בינוני A; תוסף B27 של 10 מ"ל; 1 מ"ל פרימוצין; 1.25 מ"ל גלוטמקס; מסננים, מעקרים ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד השימוש.
B27NBMA + 10% BGS27 מ"ל B27NBMA; 3 מ"ל סרום צמיחת בקר
מלאי תמיסת CNTF (10 ומיקרו; גרם/מ"ל; 1000X)הזמנה מפפרוטק (450-50). איפור ב-0.1 עד 1 מ"ג/מ"ל לפי היצרן הוראות (עשוי להשתנות מאצווה לאצווה) במאגר (למשל DPBS + 0.2% BSA). אחסן בטמפרטורה של -80 & מעלות צלזיוס < br / > פתרון עבודה (10 ומיקרו; גרם/מ"ל, 1000X)
1. יש לבצע 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) בתמיסת DPBS ולעקר מסנן.
2. לדלל מלאי ראשי aliquot ל-10µ גרם/מ"ל בסטרילי, צונן 0.2% BSA/DPBS.
3. אליקוט (20&מיקרו; l/tube) ולהקפיא בחנקן נוזלי.
4. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
תמיסת מלאי d-ביוטין (50 ומיקרו; גרם/מ"ל; 5000X)השעיית d-ביוטין (Sigma-B4639) ב-H2O מזוקק כפול ב-50 מיקרו; גרם/מ"ל (למשל 2.5 מ"ג ב-50 מ"ל של ddH2O). השעיה מחדש עשויה לדרוש כמות נכבדה של תסיסה/מערבולת, או התחממות קלה לזמן קצר ב-37 מעלות צלזיוס. אם ה-d-ביוטין עדיין לא מסיס, זה בסדר להרכיב פחות מרוכז (למשל 10µ גרם/מ"ל), וכדי להוסיף נפח גבוה יותר ל-B27NBMA (1/1000), במקום 1/5000). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
מלאי DNase I1. ממיסים ב 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml ב- HBSS צונן על קרח.
2. מסננים לעקר על קרח
3. Aliquot ב-200 ומיקרו; l ולהקפיא למשך הלילה ב -20 מעלות צלזיוס < br / > 4. אחסן את המינון בטמפרטורה של -20 עד -30 מעלות צלזיוס.
דולבקו s תמיסת מלח חוצצת פוספט (ללא Ca2+ ו-Mg2+)ממיסים את השקית בליטר מים כדי להניב 1 ליטר מדיום ב-9.6 גרם אבקה לליטר מדיום. יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
תמיסת מלאי פורסקולין (4.2 מ"ג/מ"ל; 1000X)הוסף 1 מ"ל של DMSO סטרילי ל-50 מ"ג פורסקולין בבקבוק (Sigma-F6886) ופיפטה עד להשעיה מחדש. מעבירים לשפופרת צנטריפוגה של 15 מ"ל ומוסיפים 11 מ"ל של DMSO סטרילי כדי להביא ל-4.2 מ"ג/מ"ל. Aliquot (למשל 20 µ l) ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
האנק' מלחים מאוזנים (HBSS) (סיגמא1. למדוד 900 מ"ל מים (טמפרטורה 15-20 ודג; ג) בגליל ומערבבים בעדינות.
2. מוסיפים את העוצמה ומערבבים עד להמסה.
3. יש לשטוף את האריזה המקורית בכמות קטנה של מים כדי להסיר את כל שאריות האבקה.
4. הוסף לפתרון בשלב 2.
5. הוסף 0.35 גרם נתרן ביקרבונט (7.5% משקל/נפח) עבור כל ליטר של נפח סופי.
6. ממשיכים לערבב עד להמסה.
7. התאם את ה-pH של המאגר תוך כדי ערבוב ל-0.1-0.3 יחידות מתחת ל-pH= 7.4 מכיוון שהוא עלול לעלות במהלך הסינון. מומלץ להשתמש ב-1N HCl או 1N NaOH כדי להתאים את ה-pH.
8. הוסף מים נוספים כדי להביא את הנפח הסופי ל-1L.
9. יש לעקר על ידי סינון באמצעות ממברנה בעלת נקבוביות של 0.22 מיקרון.
10. יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
תמיסת מלאי אינסולין (4000 ומיקרו; גרם/מ"ל)להפשיר את הבקבוק ולקבל 25 & מיקרו; l לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
תמיסתהפשרה איטית של למינין בקור (2& מעלות; C עד 8° ג) כדי למנוע היווצרות ג'ל. לאחר מכן, מכניסים לצינורות פוליפרופילן. יש לאחסן ב-5&00 מעלות; C עד -20° C במכסים (למשל 20 ומיקרו; l) ואין להקפיא/להפשיר שוב ושוב. ניתן לאחסן למינין בטמפרטורות אלה עד שישה חודשים.
מיון תאים מגנטי (MCS)הכן את התמיסה המכילה תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS), pH 7.2 ו-0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA), 0.5 מ"מ EDTA, 5& גרם/מ"ל אינסולין, 1 גרם/ליטר גלוקוז. עיקור והסרת גז על ידי סינון המאגר על ידי העברתו דרך 0.22 ומיקרו; מ פילטר מילקס. אחסן את המאגר ב-4° C עד לשימוש
בתמיסת מלאי N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC) (5 מ"ג/מ"ל; 1000X)יש להמיס N-אצטיל-L-ציסטאין (Sigma-A8199) במינון של 5 מ"ג/מ"ל ב-DMEM (למשל 50 מ"ג NAC ב-10 מ"ל B27NBMA). לסנן לעקר ולעקר (למשל 20 ומיקרו; l). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
פתרון מלאי NT3 (1 ומיקרו; גרם/מ"ל; 1000X)מלאי ראשי:
הזמנה מפפרוטק (450-03). איפור ב-0.1 עד 1 מ"ג/מ"ל לפי היצרן הוראות (עשויות להשתנות מאצווה לאצווה), במאגר (למשל DPBS + 0.2% BSA). אחסן ב-80°C.

מלאי עבודה (1µ גרם/מ"ל; 1000X):
1. יש לבצע 0.2% BSA בתמיסת DPBS ולעקר מסנן.
2. לדלל מלאי מאסטר aliquot ל-1 µ גרם/מ"ל בסטרילי, צונן 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (למשל 20µ l/tube) ולהקפיא בחנקן נוזלי.
4. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
פתרון מלאי PDGF (10 ומיקרו; גרם/מ"ל; 1000X)מלאי ראשי:
הזמנה מפפרוטק (100-13A). איפור ב-0.1 עד 1 מ"ג/מ"ל לפי היצרן הוראות (עשויות להשתנות מאצווה לאצווה) במאגר (למשל DPBS) + 0.2% BSA). אחסן ב-80°C.

מלאי עבודה (1µ גרם/מ"ל; 1000X):
1. יש לבצע 0.2% BSA בתמיסת DPBS ולעקר מסנן.
2. לדלל מלאי מאסטר aliquot ל-1µ גרם/מ"ל בסטרילי, צונן 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (למשל 20µ l/tube) ולהקפיא בחנקן נוזלי.
4. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
פולי-D-ליזין (1 מ"ג/מ"ל; 100X)השהה מחדש פולי-D-ליזין, משקל מולקולרי 70-150 kD (Sigma P6407) ב-0.5 מ"ג/מ"ל ב-0.15M חומצה בורית pH 8.4 (למשל 50 מ"ג במאגר בוראט 50 מ"ל). סינון, עיקור וסימון (למשל 100µ l/tube). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, יש לדלל את ציר ה-100X (1 מ"ג/מ"ל) ל-50 ומיקרו; גרם/מ"ל במים סטריליים.
התפשטות אוליגודנדרוציטיםראה טבלה משלימה 1
מדייתראה טבלה משלימה 1
תוספת סאטו (100X)ראה טבלה משלימה 1
הפניות: רשימת הריאגנטים והמתכונים אומצה מהפרוטוקולים שתוארו בעבר על ידי Emery et al. 2013 (Emery, B. & דוגאס, ג'יי סי טיהור תאי שושלת אוליגודנדרוציטים מקליפת העכבר על ידי אימונופאנינג. קולד ספרינג הארב פרוטוק. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) ו-Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. בידוד של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים של עכבר קליפת המוח. J שיטות נוירושי. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))
פתרון למינין מאגר מצע התמיינות אוליגודנדרוציטים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oligodendrocyte IsolationImmunomagnetic SeparationO4 Positive CellsPrimary OligodendrocytesNeonatal Mouse PupsMagnetic Cell SortingCell Strainer FiltrationCentrifugation ProtocolOligodendrocyte ProliferationImmunofluorescence Staining

Related Articles