הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57547

⸱

16 באפריל 2018

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול אשר נועד לנתח את הגנום כולו הכריכה של הגורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 (Olig2) בתאי המוח בחריפות מטוהרים אוליגודנדרוציטים קודמן (OPCs) על-ידי ביצוע כרומטין נמוך-תא immunoprecipitation (ChIP) , ספריית הכנה, תפוקה גבוהה רצף וניתוח נתונים bioinformatic.

תקציר

בתרבית של תאים, שעתוק גנים מוסדר באופן ספציפי סוג התא על ידי פעולת הגומלין בין גורמים תעתיק עם הדנ א. גורמי שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין נחשבים ממלאים תפקידים חיוניים ב מפרט תא ובידול במהלך הפיתוח. שבב בשילוב עם רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) נעשה שימוש נרחב כדי לנתח אתרי קישור ברמת הגנום של גורמי שעתוק (או שלה מורכב משויכת) ל- DNA גנומי. עם זאת, מספר גדול של תאים נדרשים עבור אחד שבב התגובה השגרתית, מה שהופך את זה קשה ללמוד מספר מוגבל של התאים הראשי מבודד או אוכלוסיות תאים נדיר. כדי להבין את מנגנון רגולטורי של שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין אוליגודנדרוציטים מוצג גורם Olig2 העכבר בחריפות מטוהרים OPCs, שיטה מפורטת באמצעות שבב-seq לזהות את האתרים ברמת הגנום מחייב Olig2 (או Olig2 מורכבים). ראשית, הפרוטוקול מסביר כיצד לטהר את האלפא קולטן גורם גידול נגזר טסית דם (PDGFRα) OPCs חיובי מן מוח העכבר. בשלב הבא, נוגדן Olig2 מתווכת שבב, ספריית הבנייה מבוצעות. החלק האחרון מתאר את תוכנת bioinformatic של הליכים המשמשים לניתוח Olig2 שבב-seq. לסיכום, מאמר זה מדווח שיטה לנתח את איגודי ברמת הגנום של גנים ברמת השעתוק גורם Olig2 במוח בחריפות מטוהרים OPCs.

מבוא

חשוב ללמוד את החלבון (או החלבונים) ה-DNA כריכות, הסימנים epigenetic לבנות רשתות בקרה רגולטריות תעתיק המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים. במיוחד, איגודי גורמי שעתוק לדנ א הגנומי יכול לשחק תפקיד חשוב של הכונה, הבידול תא, לבין התפתחות רקמת. כלי רב עוצמה עבור הלומדים את תקנה תעתיק ואת מנגנוני epigenetic הוא immunoprecipitation כרומטין (ChIP). עקב התקדמות מהירה הטכנולוגיה רצף של הדור הבא, שבב בשילוב עם רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) משמש עבור הניתוחים של חלבון-DNA כריכות, סימני epigenetic1. עם זאת, פרוטוקול תקני seq שבב דורש כ-20 מיליון תאים לכל תגובה, מה שהופך את היישום של טכניקה זו קשה כאשר מספר התא מוגבל, כגון תאים בודדים ראשי אוכלוסיות תאים נדיר.

אוליגודנדרוציטים שושלת התאים כולל אוליגודנדרוציטים קודמן תאים (OPCs) ו אוליגודנדרוציטים מופצים באופן נרחב ברחבי המוח, הם חיוניים עבור ההתפתחות והתפקוד של המוח. כסוג של קודמן תאים, OPCs מסוגלים התחדשות עצמית והן בידול. OPCs לא רק לשמש אבות עבור oligodendrocytes להפוך אלא גם לשחק תפקיד חשוב הפצת אותות עצביים בהתקשרות עם סוגים אחרים של תאים במוח2. מחקרים קודמים הראו כי פיתוח אוליגודנדרוציטים מוסדר על ידי גורמי שעתוק שושלת היוחסין הספציפי כגון3,Olig2 ו- Sox104. גורמי שעתוק אלה נמצאו כדי לאגד האזורים יזם או שיפור של כמה גנים חיוניים כדי להשפיע על הביטוי שלהם במהלך אוליגודנדרוציטים מפרט ובידול. עם זאת, מאתגרות לזיהוי DNA קשירה של חלבון (או החלבונים) עניין בבחריפות מטוהרים OPCs ראשי עם מספר מאוד מצומצם של תאים.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור באופן שיטתי את immunoprecipitated דנ א גנומי על ידי Olig2 ב העכבר מטוהרים OPCs בקנה מידה הגנום כולו באמצעות שבב-seq טכניקה. OPCs של מוח העכבר היו בחריפות מטוהרת על-ידי immunopanning, המשמשים ניסוי שבב ללא התפשטות בתוך חוץ גופית. מספר מוגבל של OPCs יכולה להיות מושגת על ידי immunopanning, והוא די לניסויים שבב-seq סטנדרטי. במסמך זה, פרוטוקול שבב-seq נמוך-תא עם יהיה נמוך ככל 20 אלף תאים לכל שבב תגובה עבור גורמי שעתוק מתואר. בקצרה, צולבים התאים היו lysed, sonicated על ידי מכשיר sonication להטיה של כרומטין. כרומטין הוטו, נדגרה עם נוגדנים Olig2, כמו גם חלבון חרוזים מצופים A, כדי לזרז Olig2 נוגדנים מאוגד הדנ א. לאחר • תנאי של חרוזים מצופים של חלבון ו- cross-linking הפוכה, דנ א גנומי משהחמיר נוגדן Olig2 היה טהור על ידי מיצוי פנול-כלורופורם. המוצר הסופי היה לכמת, נתון T-עוקב, פריימר חישול החלפת תבנית והסיומת, התוספת של מתאמי, הגברה, בחירת גודל הספרייה, טיהור צעדים לבניית ספריה שבב-seq.

לאחר רצף, ניתחנו את איכות הקריאות raw המדגם שהוכנו עם נוגדן פקטור שעתוק Olig2 והן את דגימת הבקרה. באיכות נמוכה בסיסי זוגות, מתאם המכילה לקרוא קטעים נגזמו. קריאות הבא, החתוך היו המיושר הגנום הפניה העכבר. האזורים גנומית זה היו באופן משמעותי מועשר עבור קריאות שבב, לעומת הדגימה שליטה, אותרו כמו פסגות. פסגות משמעותית, המייצג אתרי קישור פקטור שעתוק פוטנציאליים, מסוננים, דמיינו בדפדפן הגנום.

ראוי לציין, השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה ניתן באופן כללי על שבב-seq גורמים אחרים תמלול עם כל סוג התא של מספרים מוגבלת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל שימוש בבעלי חיים והפרוטוקולים ניסיוני היו שבוצעה על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרה על ידי הוועדה המוסדית אבטחה חיה ועדת הרווחה-אוניברסיטת טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון.

1. טיהור של PDGFRα חיובי שושלת היוחסין אוליגודנדרוציטים תאים מהמוח העכבר (שונה immunopanning שתואר לעיל פרוטוקולים5,6,7)

  1. הכנת צלחת immunopanning PDGFRα תא חיובי הבחירה ו 2 לוחות עבור דלדול תאי אנדותל ואת מיקרוגלייה.
    הערה: שימו לב כי פטרי אבל לא תא תרבות מנות לעבוד לניסוי immunopanning; אם התאים מטוהרים ישמש עבור culturing, צעדים immunopanning צריך להתבצע באבטחה הקבינט
    1. מעיל 10 ס מ צלחת פטרי עם 30 µL עז אנטי חולדה IgG ב 10 מ"ל של pH 9.5, 50 מ מ טריס-HCl בן לילה ב 4 º C. להתסיס את הצלחת לוודא שהמשטחים של הלוחות באופן שווה ולא לגמרי מכוסים על-ידי הפתרון ציפוי.
    2. הכן PDGFRα נוגדן פתרון על ידי המדללת µL 40 של נוגדן anti-PDGFRα חולדה עם 12 מ ל תמיסת מלח של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS) המכילה BSA 0.2%.
    3. לאחר 3 שוטף של IgG מצופה צלחת עם 10 מ ל 1 x DPBS כל אחד, דגירה מצופים IgG צלחת עם פתרון נוגדן PDGFRα בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
    4. תשטוף הצלחת מצופים נוגדן anti-PDGFRα חולדה 3 פעמים עם 10 מ ל 1 x DPBS. להוסיף בעדינות DPBS פתרון לאורך הקיר בצד של הצלחת, נא לא להפריע את המשטחים מצופה.
    5. מעיל שתי צלחות פטרי חדש 15 ס מ עבור דלדול תאי אנדותל ואת מיקרוגלייה עם 20 מ של DPBS המכיל 2.3 µg/mL של Banderiaea simplicifolia לקטין 1 (BSL-1) כבר שעתיים.
    6. לשטוף ש-BSL-1 מצופה לוחות 3 פעמים עם 20 מ ל 1 x DPBS. בעדינות מוסיפים DPBS פתרון לאורך הקיר בצד של הלוחות, אל תפריעי משטחים מצופים.
  2. טיהור של PDGFRα חיובי אוליגודנדרוציטים שושלת היוחסין תאים שינוי שיטות שפורסמו בעבר6 , 7 , 8-
    1. לנתח הרקמות קורטיקלית 2 כמחנכת יום 7 (P7) העכבר מוח על פי בעבר פרוטוקולים שפורסמו5,6.
    2. מביצועם הרקמות ליצירת השעיה תא בודד עם רקמה עצבית דיסוציאציה קיט (P) על פי הוראות היצרן מפורט.
    3. בקצרה, לחתוך הרקמות קורטיקלית גזור לחתיכות עם איזמל, מעמיד אותם בפני עיכול אנזימטי ב 37 º C. לאחר עיכול, באופן ידני מביצועם החלקים עם זכוכית מלוטשים אש פסטר סיליקון להשעיה תא בודד.
    4. Centrifuge התליה תא בודד ב 300 גרם x 10 דקות בטמפרטורת החדר, להשהות צניפה התא באמצעות 15 מ"ל של מאגר immunopanning (מאגר immunopanning הוא DPBS עם BSA 0.02% ו- 5 אינסולין µg/mL).
    5. דגירה התליה תא בודד מן מוח העכבר 2 ברצף על שתי צלחות BSL-1 מצופה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין של צלחת כל 5 דקות כדי להבטיח של דלדול יותר מיקרוגלייה ותאי אנדותל.
    6. מערבולת בעדינות את הצלחת כדי לאסוף את התאים שאינם מחסידי ההשעיה תא דגירה אותם על הצלחת מצופים נוגדן חולדה-PDGFRα למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. לאחר הדגירה של התליה תא בצלחת מצופים נוגדן חולדה-PDGFRα, בעדינות מערבולת את הצלחת לאסוף התליה תא, ולשטוף את הצלחת 8 פעמים עם DPBS כדי להיפטר שאינם מחסידי תאים. בעדינות מוסיפים שטיפת פתרון לאורך הקיר בצד של הצלחת, להתסיס את הצלחת מספר פעמים כדי להיפטר שאינם מחסידי תאים.
    8. לנתק את התאים מהצלחת נוגדן מצופה חולדה-PDGFRα שימוש של mL 4 של התא ניתוק פתרון טיפול למשך 10 דקות ב 37 º C. לנער את הצלחת להוציא תאים חסיד.
    9. לאסוף את OPCs מטוהרת על ידי צנטריפוגה ב g 300 x בטמפרטורת החדר, להשעות בגדר תא 2 מ"ל OPC תא תרבות בינונית, ספירת התאים באמצעות trypan blue ו- hemocytometer (500 מ"ל תא תרבות בינוני הוא בינוני DMEM/F12 המכיל 5 מ ל פניצילין-סטרפטומיצין פתרון (P/S), 5 מ ל N2, 10 מ"ל B27, 5 אינסולין µg/mL, BSA 0.1%, 20 ng/mL bFGF ו 10 ננוגרם למ"ל PDGFRα).
  3. אימות של טוהר OPCs לאחר immunopanning.
    1. על מנת להעריך את העשרת של OPCs לאחר immunopanning, להשתמש בחלק OPCs מטוהרים לחילוץ RNA עם החילוץ thiocyanate מבוסס guanidium לפי הנחיות היצרן.
    2. לבצע PCR לרביעיית באמצעות מיקס מאסטר הפלורסנט ירוק לבדוק העשרת הביטוי PDGFRα ב OPCs מטוהרים לעומת תאי המוח חלופה מועדפת על פי חומרים שפורסמו בעבר4.
    3. בנוסף, זרע כמה OPCs מטוהרים לתוך פולי-D-ליזין מצופה 24 צלחות טוב immunostaining עם אנטי-NG2 כונדרויטין סולפט פרוטאוגליקן (NG2) נוגדן כאמור פרסמו חומרים9.

2. נמוך-תא שבב והכנה שבב בניית ספריה עבור רצף תפוקה גבוהה

  1. הכנה שבב נמוך-תא Olig2 עם מערכת זמינים מסחרית sonication ומספר תא נמוך זמינים מסחרית שבב קיט (ראה טבלה של חומרים) על-ידי ביצוע הפרוצדורות תקן מפורט של הוראות היצרן.
    1. לאחר ניתוק של האנטי-PDGFRα העכברוש צלחת מצופים נוגדן, התא סופר עם trypan blue ו- hemocytometer לשים OPCs מטוהרים 20,000 1 מ"ל OPC תא בינוני תרבות עבור כל תגובה שבב.
    2. הוסף µL 27 של 36.5% פורמלדהיד לתקן את הבולם תא 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      התראה: שימו לב כי פורמלדהיד חייב לשמש בשכונה fume כימי מטעמי בטיחות.
    3. לעצור את ה-DNA-חלבון cross-linking עם 50 µL גליצין 2.5 מטר על 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: כל השלבים צריך להתבצע על הקרח או בחדר קר 4 ° C מנקודה זו.
    4. לשטוף את כדורי תא צולבים עם 1 מ"ל של מאוזנת מלח פתרון (HBSS הנקס כקרח) עם מעכב פרוטאז קוקטייל ולקבל תאים מגורען על ידי צנטריפוגה טרום מקורר-300 גרם x-4 מעלות צלזיוס.
    5. Lyse בגדר תא 25 µL להשלים את פירוק מאגר עבור 5 דקות על קרח.
      הערה: להתסיס את הצינור להשעות את התאים במאגר פירוק.
    6. תוספת lysate עם קרח HBSS המכילה מעכב פרוטאז קוקטייל, הטיה כרומטין של תא lysate על ידי טרום מקורר sonication המערכת עם 5 מחזורים של 30 s ON 30 s OFF התוכנית 75 µL התא. תמיד sonicate 6 צינורות יחד וודא כי הצינורות האיזון מכילים 100 µL מים.
    7. לאחר, חיתוך צנטריפוגה ב g 14,000 x 10 דקות 4 ° C ולאסוף את תגובת שיקוע צינור חדש לאחר צנטריפוגה.
    8. לדלל µL 100 של כרומטין הוטו עם הנפח כקרח מאגר שבב להשלים עם מעכב פרוטאז שווה.
    9. שמור µL 20 של כרומטין הוטו מדולל הדגימה בקרת קלט.
      הערה: בקרת קלט לדוגמה נדרש גם כמו ההשוואה Olig2 מדגם immunoprecipitated לזיהוי נוגדנים Olig2 immunoprecipitated דנ א.
    10. להוסיף 1 µL של הארנב נוגדן anti-olig2 כדי µL 180 של מדולל לכסנתם כרומטין, דגירה הצינור התגובה על גלגל מסתובב במהירות של 40 סל ד עבור 16 h-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לבצע שלב זה בחדר קר.
    11. עבור כל תגובה שבב, לשטוף 11 µL חלבון מגנטי מצופה A חרוזים עם 55 µL חרוזים מאגר לשטוף ולשים החרוז הצניפה ב 11 µL חרוז שטיפת מאגר לאחר שוטף 2.
      הערה: לבצע שלב זה בחדר קר.
    12. עבור כל תגובה שבב, להוסיף 10 µL של חרוזים מצופים A חלבון טרום שטף שבב התגובה שפופרת. לבצע שלב זה בחדר קר.
    13. דגירה הצינור התגובה צ'יפ ב 4 ° C עבור עוד 2 h על גלגל מסתובב.
    14. שמכניסים את נקז התגובה שבב על מתלה מגנטי עבור 1 דקות.
      הערה: לבצע שלב זה בחדר קר.
    15. הסר את תגובת שיקוע ועוקרות לא בגדר חרוז.
    16. לשטוף בגדר חרוז עם 100 µL לכל מאגרי שטיפת 4 בהתאמה במשך 4 דקות על גלגל מסתובב ב 4 º C.
    17. לאחר שוטף, להוסיף 200 µL • תנאי מאגר בגדר חרוז, דגירה הצינור התגובה צ'יפ ב 65 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות להפוך קישור חלבון-DNA.
    18. בנוסף, להוסיף µL 180 • תנאי מאגר לדגימת פקד קלט µL 20, דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות להפוך קישור חלבון-DNA גם כן.
    19. להוסיף 200 µL 25:24:1 (וי/v) תערובת של אלכוהול פנול, כלורופורם, isoamyl כל שפופרת התגובה של השבב.
    20. מערבולת נמרצות עבור 1 דקות, צנטריפוגה ב 13,000 x g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את השלב העליון צינור חדש.
    21. להוסיף 40 µL 3 מ' סודיום אצטט פתרון, µL 1,000 של אתנול 100%, µL 2 של גליקוגן precipitant covalently מקושר הצבע הכחול כדי כל שפופרת התגובה שבב בן לילה ב-20 ° C.
    22. צנטריפוגה ב 13,000 x g כעשרים דקות ב 4 º C.
    23. למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף עם 500 µL קר 70% אתנול, צנטריפוגה-13,000 g x עבור 20 דקות ב 4 º C.
    24. למחוק את תגובת שיקוע, לשמור את האוויר צניפה להתייבש במשך 10 דקות, לפזר את גלולה עם מים µL 50.
  2. שבב בניית ספריה עבור רצף תפוקה גבוהה
    1. לנקות ולרכז את הדנ א שבב עם ערכת ניקיון בהתאם להנחיות היצרן.
    2. לכמת את הדגימה שבב על ידי פיקו-ירוקה על פי הוראות היצרן.
    3. להשתמש ערכת השבבים-seq עבור T-עוקב, שכפול, עוקב, החלפת תבנית, הרחבה, התוספת של מתאמי, הגברה, בחירת גודל הספרייה וטיהור על פי הוראות היצרן.
      1. לאחר דנטורציה של dsDNA, dephosphorylate 3' סוף ssDNA על ידי phosphatase אלקליין שרימפס, להוסיף זנב poly (T) ssDNA על ידי טרמינל deoxynucleotidyl טרנספראז.
      2. Anneal ומהצמיגים הדנ א פוליפוני (dA) על תבנית ssDNA עבור שכפול ה-DNA ותבנית מיתוג.
      3. לאחר החלפת תבנית, להגביר את הספרייה שבב-seq מאת PCR עם תחל ואחורה לצורך יצירת אינדקס.
      4. בחר ה-PCR מוגבר שבב-seq ספריה עם שברי החל 250 עד 500 bp מאת פאראמגנטיים חרוזים מאת אפשרות 2 לבחירה בגודל כפול.
      5. לבחון את האיכות של הספרייה שבב-seq שנבחרו משתמשים במכשיר אלקטרופורזה שבב-נימי microfluidic.

3. ניתוח נתונים

  1. להכין את מבנה הספריות.
    1. צור ספריה עבור ביצוע ניתוח הנתונים שבב-seq. בתוך הספריה החדשה שנוצרה, ליצור ספריות שש עם השמות הבאים: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis ודוחות.
  2. להכין נתונים ולבצע בקרת איכות ניתוח של נתוני רצף raw.
    1. לעבור הספריה "raw.files", להוריד את קבצי הנתונים שבב-seq.
    2. בדוק את שמות הקבצים. אם הרצף היה סוף-לזווג, יהיו 4 קבצים (שני לטיפול) ו-2 עבור קלט עם שמות הבסיס דומה: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq ו- PDGFRα_input.read2.fastq. אם שמות קבצים שונים, לשנות אותם באמצעות הפקודה "mv".
    3. להעביר הספריה "fastqc.output".
    4. השג מדדים בקרת איכות קריאות raw באמצעות תוכנה10בקרת איכות הקובץ fastq. השתמש בפקודה ב איור S1A כדי להפעיל את תהליך בקרת איכות בנפרד עבור כל קובץ fastq. התוכנה תציג במספר מדדים בקרת איכות בקובץ html.
    5. פתח את קובץ ה-html בקרת איכות, לברר את מספר הקריאות, קרא אורך, לפי איכות רצף הבסיס, לפי רצף איכות ציונים, רצף GC תוכן, רצף שכפול רמות, מתאם תוכן ותוכן kmer.
  3. חתוך קריאות באיכות נמוכה נגרר ותוכן מתאם.
    1. צפו את "לפי רצף הבסיס איכות" חלקות "מתאם תוכן". לקבוע את אורך חיתוך עבור הראש והן הזנב של כל קריאה. אורך נאותה עבור זמירה ואיפה האיכות הבסיס יורד מתחת 30 ראיות של מתאם תוכן.
    2. להעביר הספריה "raw.files".
    3. להוריד ולהתקין תוכנה עבור קריאות זמירה11. השתמש בפקודה S1B איור לקיטום הטיפול והן את הקלט בנפרד. הפרמטר 'חיתוך' מציין את אורך הקריאה הנותרים לאחר חיתוך בסיסים מקצה 'HEADCROP' מציין את מספר בסיסים צריכים להיות מסולקים מן ההתחלה של הקריאה.
    4. הפקודה ' חיתוך ' כולל גם את המינימום לקרוא אורך להתקבל לאחר סינון בפרמטר 'MINLEN'. אם קורא לפחות 50 bp, שימוש 35 bp כמו הסף אורך הקריאה.
    5. להעביר הספריה "fastqc.output".
    6. לבצע את הניתוח בקרת איכות הקובץ fastq לאחר זמירה את הקריאות. ודא כי הסוגיות בקרת איכות היה נפתר. השתמש בפקודה ב איור S1C כדי להשיג את המדדים בקרת איכות.
  4. ליישר יחיד-הסוף או סוף-לזווג שבב-seq מקריאה הגנום הפניה של העכבר.
    1. לעבור אל הספריה "bowtie.output" עבור המיפוי.
    2. הורד את הגנום הפניה GENCODE העכבר mm10. שנה הגנום הפניה של העכבר mm10 כמו "mm10.fa".
    3. הורד ממפה קריאה12 ולהתקין אותה במערכת.
    4. צור קובץ אינדקס של הגנום הפניה שהורדת באמצעות הפקודה באיור S2A. נוצרים באופן אוטומטי קבצים 6: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 ו- mm10.rev.2.bt2.
    5. השתמש בפקודה איור S2B כדי לבצע היישור ולהתאים את פרמטר "-p" על מספר ליבות עיבוד בהתאם להגדרות המערכת. אם מפעיל מצב סיום לזווג, הפרמטרים "-1" ו "-2" מציינים את שמות הקבצים fastq החתוך.
      הערה: המיפוי מתבצע בנפרד על הדגימות טיפול, קלט, פלט קבצי יומן רישום מטרי נוצרות עבור כל דגימה.
    6. הורד תוכנה לטיפול קבצי תבנית סאם13 ולהתקין אותה במערכת. המר את קובץ סאם מיושר לתוך קובץ באם באמצעות הפקודה באיור S2C.
  5. להשיג מדדים בקרת איכות הקריאות ממופה לפני שיא הקוראת טיפול לזווג-end בשתי דגימות הבקרה.
    1. אחד מדדים בקרת איכות הכי חשוב לכתובת הוא העומק רצף. לפתוח את הקבצים "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" ואת "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" בספריה bowtie.output, ודא מספר זוגות קריאה ממופה באופן ייחודי בכל מדגם גדול מ- 10 מיליון.
    2. להעביר הספריה "homer.output".
    3. הורד תוכנה עבור גילוי מוטיב של הדור הבא רצפי ניתוח14 ולהתקין אותה במערכת.
    4. צור תיקיה בשם "tagDir".
    5. כדי לוודא clonality תג, השתמש בפקודה מצטיירת דמות S3A. הפקודה "makeTagDirectory" יפיק ארבע בקרת איכות פלט files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt ו- tagLengthDistribution.txt.
    6. להעביר הספריה "tagDir".
    7. העתק את הקובץ "tagCountDistribution.txt" לתוך הספריה "דוחות".
    8. להעביר הספריה "דוחות".
    9. פתח את הקובץ tagCountDistribution.txt באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני וליצור בר מגרש של מספר תגים לכל עמדה גנומית. אחסן את קובץ היסטוגרמה עם השם "tag.clonality.xlsx".
    10. התקן R תכנות בשפה15 במערכת.
    11. בטרמינל, הקלד 'R' והקש על ENTER כדי לגשת סביבת תכנות של R.
    12. הורדה חבילת R לעיבוד נתונים שבב-seq16 ולהתקין אותה באמצעות הפקודה מצטיירת דמות S3B.
    13. להשתמש בתסריט R איור S3C כדי להתוות קרוס-המתאם strand.
  6. הזיהוי של פסגות באמצעות ממפה נקודות שיא.
    1. להעביר הספריה "macs2.output". הורד והתקן ממפה נקודות שיא17 במערכת שלך.
    2. השתמש בפונקציה "callpeak" עם הטיפול ושליטה באם הקבצים שנוצרו בשלב 3.4.6 הרעלה-הכרה.
      הערה: פרמטרים אחרים כוללים "-f" עבור תבנית קובץ הקלט, "-g" גודל הגנום, "-שם" עבור המציין את שם הבסיס של כל קבצי הפלט, ולא "-B" לאחסון את השרשרת מקטע בתבנית bedgraph. הפסגה מלאה מתקשר הפקודה נכללת באיור S4A. השתמש BEDPE עבור מדגמים מזווגים-end.
    3. ודא כי ממפה נקודות הקצה שיא להפיק קבצים 6: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. פתח קובץ PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls כדי להציג את הפסגות שנקרא, מיקום, אורך, מיקום הפסגה, השרשרת, ו מדדים העשרה שיא:-log10(pvalue), מקפלים העשרה, ו- log10(q-value).
  7. לסנן ומפרשות שנקרא פסגות.
    1. באמצעות הקובץ שנפתח בשלב הקודם, לסנן פסגות המתקבלת לפי את העשרת קיפול, ערך p ו/או את ערך ה-q. כדי להחליט ספי סינון הולם, להפוך מגרש היסטוגרמה לקביעת הצפיפות של כל מדד. לסנן ערכים מתחת לסף מסוים שנבחר כדי להשיג פסגות משמעותית.
    2. הורד לרשימה השחורה mm10 (אזורים ידועים אות גבוה באופן מלאכותי), מסנן השבב-seq פסגות שנמצאים בתוך כל אחד האזורים החפץ.
    3. צור קובץ מיטה עם הפסגות מסוננים המכילה את העמודות הבאות: כרומוזום, התחלה, סיום, peakID, ואימץ ו- strand. מלא את העמודה מעושה עם נקודה "-" מאז לא בשימוש. בעמודה סטרנד, להגדיר כל הערכים "+". שמור את הקובץ מיטה בשם "filtered.peakData2.bed".
    4. העתק את הקובץ "filtered.peakData2.bed" ספריה "דוחות".
    5. להעביר הספריה "דוחות".
    6. כדי להוסיף ביאורים פסגות מסוננים לאזור גנים ספציפיים, השתמש בפונקציה "annotatePeaks" עם מיטה הקובץ נוצר בשלב הקודם. הפקודה מוצג איור S5A.
    7. פתח את הקובץ "filtered.annotatedPeaks.txt" באמצעות תוכנה סטטיסטית.
    8. לסנן פסגות וכתוצאה מכך שוכבת בתוך אזור intergenic במרחק גדול מ- 5 kb מ TSS מוערת. השתמש את העמודה "מרחק כדי TSS" בקובץ כמרחק לסינון. אחסן את הפסגות מסוננים קובץ excel בשם "5kbup.geneBody.peakData.txt".
    9. חנות וכתוצאה מכך מסונן פסגות בקובץ bedGraph עם עמודות: כרומוזום, התחלה, סיום, ו- log10(q-value). שם הקובץ "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
  8. ליצור קבצי אישיות חשובה להמחשת דפדפן.
    1. להוריד ולהתקין תוכנה עבור חשבון הגנום18.
    2. הורד כלי להמרת bedgraph אישיות חשובה והתקן במערכת. הורד את הקובץ 'mm10.chrom.sizes'.
    3. השתמש בפקודה ב איור S6A ליצירת קובץ אישיות חשובה.
    4. להוריד ולהתקין את הדפדפן הגנום19 במערכת.
    5. פתח את הדפדפן הגנום, לטעון את הקובץ "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" כדי להמחיש את הפסגות משמעותי מסוננים ואת מיקומם ביחס הגנים הידועים.
  9. מוטיב חיפוש.
    1. להעביר הספריה "motif.analysis".
    2. הורדה של מוטיב דה נובו סריקה ותוכנית העשרה מוטיב ולהתקין אותה לתוך המערכת שלך20.
    3. להוריד את מסד נתונים של מוטיב מקיף הכולל מוטיבים של Olig2.
    4. להשיג את רצף גנומית של 500 אזורים bp מרוכז בכל פסגות שיא משמעותי. אחסן את רצפי כמו peak.sequences.txt. השתמש בפקודה ב איור S7 כדי לחפש מוטיבים Olig2 בתוך כל אחד מאזורי שיא 500 bp.
    5. לסנן את המוטיבים הנוצרת באמצעות E-ערך הולם (ברירת המחדל = 0.05).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נמוך-תא שבב-seq בוצעה, bioinformatic ניתוחים נעשו כדי לחקור את האינטראקציות פוטנציאלי של גנים ברמת השעתוק גורם Olig2 עם ה-DNA גנומי במוח בחריפות מטוהרים OPCs. איור 1 מראה כללי זרימת עבודה הן את ניסיוני והן ההליכים ניתוח נתונים. ב פרוטוקול זה, המוח עכברים כמחנכת היו הפומבית להשעיה תא בודד. לאחר רקמת הדיסוציאציה immunopanning בוצעה לטהר את OPCs באמצעות נוגדן PDGFRα. איור 2 מציג את העשרת משמעותית של PDGFRα, ביטוי קטן של נוירון סמן T...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ג'ין בתרבית של רגולציה רשתות הם מורכבים מאוד. שבב-seq היא שיטה חזקה לחקור אינטראקציות חלבון-DNA הגנום כולו. פרוטוקול זה כולל כיצד לבצע Olig2 שבב-seq באמצעות מספר נמוך של OPCs מטוהרים מוח העכבר (נמוך כמו 20 אלף תאים לכל תגובה). הצעד הראשון מפתח עבור פרוטוקול זה הוא הטיהור של OPCs של מוח העכבר על ידי immunopanning עם נוגדנים PDGFRα. עבור בחירת חיובי OPCs עם PDGFRα מצופה לוחות, לאגד PDGFRα לעיתים קרובות חלש OPCs מצופה לוחות. גם לאחר מספר שוטף, יש עדיין נותרו כמה תאים שאינם מחסידי. חשוב לבדוק שהתאים שאינם מחסידי לאחר כל D-PB...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

JQW, XD, RCDD ו- YY נתמכו על ידי מענקים נבחרת מוסדות של בריאות R01 NS088353; 1R21AR071583 גרנט NIH-01; קרן Staman אוגילבי קרן-אנדרטת הרמן; היוזמה המוח UTHealth ואת CTSA UL1 TR000371; מענק מן האוניברסיטה של טקסס מערכת מדעי המוח מכון המחקר Neurotechnology (גרנט #362469).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מגיב / ציוד
Banderiaea simplicifolia לקטין 1Vector Laboratories# L-1100
Rat anti-PDGFRa נוגדןBD Bioscience# 558774
ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
טכנולוגיותAccutase STEMCELL# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
אנטי-NG2 כונדרויטין סולפט פרוטאוגליקן נוגדןMillipore# AB5320
Bioruptor Pico מכשיר סוניקציהDiagenode# B01060001
ערכת MicroChIP אמיתיתדיאגנוד# C01010130
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1, v/v)תרמו Fisher# 15593031
ערכת ניקוי ג'ל ו-PCR של NucleoSpinMACHEREY-NAGEL# 740609-Quant-iT
PicoGreen dsDNA ערכת בדיקתThermo Fisher# P11496
ערכת DNA SMART ChIP-SeqClontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
פיקו-ירוקתרמו פישר# P11496
D-PBSתרמו פישר# 14190-144
SYBR תערובת מאסטר ירוקהמעבדות ביו-ראד# 1725124
DMEM / F12פישר סיינטיפיק# 11-320-033
פניצילין-סטרפטומיצין (P / S)פישר סיינטיפיק# 15140122
תוסף N-2Fisher Scientific# 17502048
תוסף B-27Fisher Scientific# 17504044
אינסוליןSigma# I6634הכן תמיסת אינסולין של 0.5 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 5 מ"ג אינסולין ב-10 מ"ל מים ו-50 μ l של 1 N HCl.
אלבומין סרום בקר, מתאים לתרבית תאים (BSA)Sigma# A4161הכן תמיסת BSA 4% על ידי המסת 4 גרם BSA ב-100 מ"ל D-PBS והתאם את ה-pH ל-7.4
חלבון בסיסי של גורם גדילה פיברובלסטים, רקומביננט אנושי (bFGF)EMD Millipore# GF003
HUMAN PDGF-AAVWR# 102061-188
פולי-D-ליזיןVWR# IC15017510הכן תמיסת פולי-D-ליזין של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 10 מ"ג פולי-D-ליזין ב-10 מ"ל מים ודלל 100 פעמים בעת השימוש.
כלי פטרי חד פעמיים של פלקון, סטריליים, קורנינג, 100x15 מ"מVWR# 25373-100
כלי פטרי חד פעמיים של פלקון, סטריליים, קורנינג, 150x15 מ"מVWR# 25373-187
HBSS, 10X, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדוםפישר מדעי# 14185-052
טריפן כחולטכנולוגיות תאי גזע# 07050
קוקטייל מעכב פרוטאזSigma# 11697498001
Software
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/השגת מדדי בקרת איכות של קריאות גולמיות וחתוכות
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomaticחיתוך וסינון קריאות
גולמיותGENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzגנום ייחוס לעכבר
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlיישור קורא לגנום ייחוס
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/המרת קובץ SAM לפורמט BAM
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/יצירת ספריית תגים והערות לאזורים גנומיים מועשרים עם סמלי גנים
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/תכנות סקריפטים ופונקציות ריצה
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/sppיצירת עלילת מתאם צולב גדיל
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACSמציאת אזורים של העשרת ChIP על גבי
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/אריתמטיקה גנומית
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/המרת קובץ bedGraph לדפדפן IGV bigwig
2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/הדמיה וגלישה של שיאים משמעותיים של ChIP-seq תוכנית
Microsoft ExcelSpreasheet
הרשימה השחורה של ENCODEhttps://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsסינון שיאים
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.המרת קובץ bedGraph למסד
הנתונים של המוטיבים של bigwig ENCODE[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/מסד נתונים מוטיבים מקיף הנדרש להעשרת מוטיבים
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.html ניתוחהעשרת מוטיבים וגילוי מוטיבים
שמות פריימרים המשמשים להעשרת מוטיבים <רצפי פריימר חזקים> המשמשים עבור qPCR
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:AGGCGGTTATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCCTCCTGCAAATCC
Mog-F:GGCTTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R:TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-FAGAGTACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACGGTACTCCT

מקורות

  1. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
  2. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
  3. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
  4. Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).
  5. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562(2007).
  6. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  7. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
  10. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  11. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  12. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  15. Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
  16. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
  17. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  18. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
  21. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  22. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  23. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  24. Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
  25. Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
  26. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  27. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  28. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
  29. Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
  30. Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
  31. Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
  32. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
  33. Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Olig2 ChIP seqPDGFR alphaImmunopanning
זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.