הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פילוח GPC3 נוגדן Bispecific, GPC3-S-חיובי, עם חזק Cytotoxicity

8.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57588

⸱

12 ביולי 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, 2Center for Cellular & Structural Biology, Sun Yat-Sen University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר נוגדן bispecific GPC3-S-Fab ב Escherichia coli. GPC3-S-Fab מטוהרים יש cytotoxicity חזק נגד תאי סרטן הכבד חיובי GPC3.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה ואת מחקרים פונקציונלי של נוגדן bispecific (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs יכול לזהות שתי epitopes שונות דרך שלהם שתי זרועות שונות. bsAbs נחקרו באופן פעיל בשל יכולתן לגייס תאים חיסוניים כדי להרוג תאים סרטניים ישירות. כיום, הרוב המכריע של bsAbs מיוצרים בצורה של חומרים, או כמו bsAbs המכילים Fc או נגזרות bsAb קטן יותר ללא אזור Fc. במחקר זה, GPC3-S-Fab, נוגדן bispecific מבוסס נוגדן פרגמנט (חיובי), תוכנן על-ידי קישור של Fab של נוגדן anti-GPC3 GC33 עם נוגדן anti-CD16 מחשבים בודדת. יכול להיות לידי ביטוי Escherichia coli , מטוהרת על-ידי שני זיקה chromatographies GPC3-S-Fab. GPC3-S-Fab מטוהרים ניתן לאגד, במיוחד להרוג תאים סרטניים בכבד חיובי GPC3 על-ידי גיוס תאים רוצח טבעי, רומז על פוטנציאל היישום של GPC3-S-Fab בטיפול בסרטן הכבד.

מבוא

נוגדנים חד-שבטיים המשמשים כיום בהרחבה עבור סרטן טיפול1. בשל הגמישות של נוגדנים, בפורמטים שונים נוגדן מבוססי נחקרו באופן פעיל. לעומת נוגדנים חד-שבטיים, bsAbs יש שני מודולים איגוד אנטיגן שונים, המאפשרים להם לזהות שתי מטרות שונות בו זמנית וביעילות לעורר הגיוס של תאים חיסוניים אפקטור למטרה ולהרוג תאים סרטניים2.

תבניות bsAb רקומביננטי הנוכחי ניתן להקצות באופן כללי שתי מחלקות: bsAbs המכילים Fc ו- bsAbs ללא אזור Fc. בהשוואה לתבניות Fc המכילים בעיקר המיוצרים בתאי יונקים, bsAbs ללא אזור Fc יש היתרונות בגדלים קטנים יותר, בקלות רבה יותר מיוצרים במערכות ביטוי מיקרואורגניזם, והוא יכול לחדור רקמות הגידול ביעילות רבה יותר 3.

bsAbs ללא אזור Fc נוצרות בדרך כלל על-ידי קישור moieties איגוד בודדים, כגון שברים משתנה יחיד-שרשרת (scFvs) או פאבס3. ללא ייצוב התחומים, bsAbs מבוסס על שברי scFv לעיתים קרובות חשף יציבות תרמית, המסיסות נמוכה או הפוטנציאל מוגברת של צבירת4,5. לעומת זאת, מבוססת-חיובי bsAbs יציבים יותר בשל heterodimerization של CH1 ו- CL ב4,moiety Fab יליד6.

תחום משתנה של נוגדנים כבד שרשרת-בלבד (VHHs, המכונה גם נוגדנים מחשבים בודדת) הם הרסיס אנטיגן מחייב פעיל של נוגדנים טבעיים שרשרת כבדה7. VHHs יש את המאפיינים של זיקה גבוהה, ירידה לפרטים של IgGs המקובלת8, immunogenicity נמוך, תפוקה גבוהה חיידקי הביטוי9. לעומת Fv שברי, VHHs יש יציבות תרמית גבוהה10 לעומת Fab moieties, VHHs יש בגדלים קטנים יותר בשל היעדר CH1 ו- CL. לפיכך, S-Fab, התבנית bsAb שהושגו על-ידי קישור של Fab עם נוגדן מחשבים בודדת, VHH, היה מתוכנן ולמד אפקטים אנטי הגידול שלה,11,12.

במחקר זה, תוארה הקמת GPC3-S-Fab על-ידי קישור של Fab של hGC3313 עם VHH anti-CD16a14 . GPC3-S-Fab יכול להיות מיוצר באופן יעיל על-ידי periplasmic ביטוי Escherichia coli (e. coli). מחקרים פונקציונלי של GPC3-S-Fab הציע כי GPC3-S-Fab היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול בסרטן הכבד. לפיכך, היתרונות של GPC3-S-Fab על טכניקות חלופיות בנתונים החלים על מחקרים קודמים כוללים ייצור קל טיהור, ואת bsAbs יציב יותר.

הביטוי יונקים ומערכות ביטוי prokaryotic שימשו כדי לבטא בפורמטים שונים של BsAbs. בניגוד ביטוי בתרבית של מערכות, e. coli-מערכות ביטוי חלבון מבוסס יש יתרונות רבים, כולל תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה, חוסך עבודה, להקל על מניפולציות גנטיות ו- יעילות המרה גבוהה15. להבעה bsAbs e. coli, ישנן שתי אסטרטגיות בסיסיות: ביטוי ציטופלזמה, ביטוי periplasm בין ציטופלזמה החיצוני של קרום התא15. לעומת הסביבה תוך צמצום של הציטופלסמה, periplasm הוא סביבה, המקדם את הקיפול הנכון יותר חמצון, שותף ביטוי של חלבונים16. קיפול הנכון ממלא תפקיד מפתח בדור מסיסות, יציבות ותפקוד של bsAbs. לכן, נוספה pelB רצף האות N-הסופית של S-Fab לכוון הפרשת כדי periplasm e. coli17. כדי להבטיח הנכון קיפול, המסיסות, יציבות תרמית, יציבות הסתגלותי, להפחית את המורכבות ואת הגודל של נוגדן הוא לעתים קרובות מועסקים16. התבנית S-Fab מורכב Fab אחד אחד VHH, הבאה לידי ביטוי היטב ככל הנראה בגלל מבנה פשוט של גודל קטן חיידקי מערכות.

GPC3 נבחרה תבנית נוגדן bispecific זו GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) הוא חבר של המשפחה פרוטאוגליקן סולפט (HS) הפארין מעוגנת השטח תא דרך glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 הוא overexpressed ב-70% מהמקרים (HCC) קרצינומה hepatocellular, באיזה חשבון עבור הרוב המכריע של סרטן הכבד19,20,21,22. כי GPC3 מתבטאת לעיתים רחוקות רקמות רגילה, GPC3 הוצע כמטרה פוטנציאלית עבור HCC. MAbs בעכבר מרובים הופקו נגד GPC3. עם זאת, רק GC33 הציג פעילות אנטי הגידול מוגבל 22, והוא נכשל להפגין יעילות קלינית בחולים. במחקר זה, GPC3-S-Fab הוצגה היכולת לגייס תאי NK כדי להרוג תאים סרטניים GPC314.

לגייס תאי NK, שימש VHH אנטי-CD16. CD16a הוא קולטן IgG זיקה נמוכה, באה לידי ביטוי בעיקר על תאים הרוצח הטבעיים (NK), מקרופאגים, ומונוציטים ו תתי כמה סוגים של תאי T. זה מעורב נוגדנים תלויי תא cytotoxicity (ADCC) על ידי תאי NK23. תאי NK אדם יכולים להיות מסווגים לשני סוגים, CD56 - CD16 + ו CD56 + CD16-. בניגוד תאי NK CD56 + CD16−, CD56-תאי NK CD16 + יכול לשחרר רמות גבוהות יותר של perforin granzyme B, ובכך להציג cytotoxicity חזקה של24. תאים Kupffer (kcs ב), לבטא CD16a, הם המקרופאגים תושב בכבד. תאים Kupffer תפקיד חשוב בדיכוי סרטן הכבד25. לפיכך, ייתכן bsAbs מיקוד CD16a אסטרטגיה מבטיח יותר מאשר עיסוק ותאי T כנגד סרטן הכבד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים לרבות איסוף דם אנושי אושרו על ידי ועדת האתיקה סון יאט-סן אוניברסיטת.

1. GPC3-S-Fab דיזיין

  1. עיצוב GPC3-S-Fab על-ידי קישור של Fab של אנטי-GPC3 (humanized GC3313) עם אנטי-CD16 VHH14 (איור 1).
  2. לסנתז, לשכפל את VH-CH1-CD16-VHH ו- VL-CL לתוך הווקטורים pET26b ו- pET21a כמו שדווחה בעבר12.

2. שינוי, תרבות

  1. להוסיף 100 ננוגרם של pET26b המכילה VH-CH1-CD16 (איור 1 א') ל- 100 ננוגרם של pET21a המכילה VL-קלרנית (איור 1 א') לתוך µL 100 של BL21 המוסמכת תאים (DE3). מערבבים היטב ו דגירה על קרח במשך 30 דקות Incubate באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45-90 s, העברה, דגירה על קרח למשך 3-5 דקות.
  2. להוסיף 500 µL בינוני מרק (ליברות) lysogeny לתוך צינור המכילים BL21 (DE3) תאים, ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 150 סל ד במשך 45-60 דק 100 להפיץ את µL של BL21 (DE3) תאים על LB-אגר צלחות המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 של אמפיצילין , ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
    1. להכין lysogeny מרק (LB) בינוני: טריפטון wt/vol 1%, תמצית שמרים wt/כרך 0.5%, 1% wt/כרך NaCl.
  3. לחסן תאים שמושבה בודדת לתוך מ ל מרק סופר (SB) בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין, והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד, בין לילה. לאחר מכן, לחסן 1 מ"ל של תרבות לתוך 100 מ של SB בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד במשך 4 שעות. לאחר מכן, להעביר 10 מ"ל של התרבות 1 ליטר של SB בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד.
    1. להכין מרק סופר בינוני: 3.2% wt/כרך טריפטון, תמצית שמרים 2% wt/vol, 0.5% wt/כרך NaCl.
  4. כאשר ה OD600 מגיע 0.6 - 0.8, להוסיף איזופרופיל-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ריכוז סופי של 0.2 מ מ. תרבות-16 ° C, סל ד 180 במשך 36-48 שעות עבור ביטוי periplasmic.

3. GPC3-S-Fab טיהור Periplasmic

  1. שבר periplasmic הכנה
    1. איסוף תאים על ידי צריך שתוציאו ב g 4,000 x, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, למחוק את המדיום, שוקל את התאים.
    2. Resuspend התאים ביסודיות 4 מ"ל של פתרון סוכרוז כקרח (20 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 25% (wt/כרך) סוכרוז ו- 1 מ מ EDTA) לגרם של תאים, דגירה על קרח למשך 15 דקות.
    3. צנטריפוגה ב g 8,500 x (צנטריפוגה מלמעלה בטבלה, זווית קבועה רוטור), 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות להסיר את תגובת שיקוע (השבר סוכרוז), שמור את זה על קרח.
    4. Resuspend כדורי תערובת של קרח 5 מ"מ של MgCl2 ו- 1 מ מ PMSF (4 מ"ל לכל התאים גרם). הוסף µL 40 של המניה ליזוזים (15 מ"ג/מ"ל) לגרם, דגירה על קרח למשך 30 דקות.
    5. צנטריפוגה ב g 8,500 x (מלמעלה בטבלה צנטריפוגה, קבוע זווית רוטור), 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות להעביר תגובת שיקוע (השבר periplasmic) ולשמור אותו בקרח.
    6. לשלב סוכרוז שבר על שבר periplasmic, צנטריפוגה ב g 30,000 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להסיר את תגובת שיקוע, שמור את זה 50 מ ל צינור חרוט על קרח.
  2. טיהור זיקה Ni-נ
    1. Resuspend 1 מ"ל של ני-נ agarose על ידי ערבוב ביסודיות כדי להשיג השעיה הומוגנית, להסיר 1 מ"ל של ני-נ agarose על צינור חרוטי טריים 15 מ"ל ולהוסיף 10 טור אמצעי אחסון (CV) equilibration מאגר (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 1 מ' של NaCl) כדי equilibrate.
    2. צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות והסר את תגובת שיקוע בקפידה. לאחר מכן, להוסיף את agarose Ni-נ לתוך הצינור 50 מ ל המכיל סוכרוז שבר על שבר periplasmic. רוק ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
    3. Centrifuge את התערובת ב 400 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק הסר בזהירות את תגובת שיקוע אחר צניעותו כקרח טריים כמו השבר לא מאוגד. להעביר את agarose Ni-נ לעמודה הכבידה.
    4. להוסיף 10 שטיפה מאגר קורות חיים (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 1 מ' של NaCl; 20 מ מ, מ מ 30 או 40 מ מ של imidazole) טור ו לאסוף elute כמו השבר כביסה.
      הערה: יש להוסיף הפתרונות הבאים לפי סדר של ריכוז imidazole.
    5. להוסיף 3 קורות חיים • תנאי מאגר (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 300 מ מ NaCl; 100 מ מ, 200 מ מ, מ מ 300 או 400 מ מ imidazole) אל העמודה ולאסוף את elute כמו שבר • תנאי 1, 2, 3 ו- 4.
      הערה: יש להוסיף הפתרונות הבאים לפי סדר של ריכוז imidazole.
    6. דיאליזה שברים eluted ב 2 ל' ל- PBS (137 מ מ של NaCl, 2.7 מ"מ של אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, 2 מ מ של2פו ח'4, pH 7.4) באמצעות דיאליזה אבובים (12.4 kDa) ב 4 ° C עבור ה 2 לבדוק הנוכחות של GPC3-S-Fab ב-12 אחוז מרחביות-דף ולאחר מכן לפי Coomassie כחול מכתים.
  3. CH1 אג זיקה טיהור
    1. העברת 1 מ"ל של IgG-CH1 זיקה שרף לתוך צינור חרוטי 50 מ ל, לשטוף את החרוזים עם PBS קודם. לאחר מכן, הוסף את הפתרון dialyzed המכיל GPC3-S-Fab לאחר שלב 3.2.6. רוק ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
    2. צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע עוד טרי צניעותו קר כקרח, ולהעביר השרף עמודה הכבידה.
    3. להוסיף 10 קורות חיים של כביסה מאגר (PBS) לעמודה, ולאסוף • על תנאי כמו השבר לשטוף.
    4. הכינו את צינורות איסוף על-ידי הוספת 1 מ' של טריס pH 9.0 (0.1 מ"ל לכל מיליליטר כל שבר eluted). Elute עם קורות חיים 3 • תנאי מאגר (0.1 M של גליצין-HCl, pH 2.7), ולאסוף את השבר eluted; חזור על 3 פעמים.
    5. דיאליזה שברים eluted ב 2 ל' ל- PBS באמצעות דיאליזה אבובים (12.4 kDa) ב 4 ° C עבור ה 2 חוזר פעמיים.
    6. לקבוע ריכוז החלבון על ידי ultramicrospectrophotometer (הכחדה טוחנת מקדם: 91105. א 1280 = 0.69 mg/L).

4. מרחביות-דף וניתוח סופג-ווסטרן

  1. לקחת את µL 10 המדגם 5 x מרחביות טעינת מאגר ומערבבים היטב. מרתיחים את התערובת חלבון ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    1. להכין 5 x מרחביות טעינת מאגר: 250 מ מ של טריס-HCl, pH 6.8, 10% wt/כרך מרחביות, 0.5% wt/כרך bromophenol כחול, גליצרול vol/כרך 50%, 5% vol/כרך בטא-mercaptoethanol.
  2. הכן של ג'ל מרחביות-דף עם טעינת ג'ל (5%), ההפרדה ג'ל (12%) כפי שתואר לעיל26,27,28.
  3. טען µL 10 של תערובת חלבונים מבושלים, סמן חלבון, והשתמש מרחביות-הדף.
  4. כתם הג'ל ע י ניעור כעשרים דקות עם פתרון כחול מבריק Coomassie, ולאחר מכן לבצע destaining.
  5. עבור סופג המערבי, לאחר העברת קרום PVDF, לחסום את הקרום עם TBST (20 מ מ של טריס-HCl, 150 מ מ של NaCl, 0.1% vol/כרך Tween 20) + 5% wt/vol. וקפה לשעה בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול.
  6. דגירה הקרום עם נוגדנים הראשי (אנטי-שלו או אנטי-דגל) מדולל 1:2,000 TBST + 5% חלב רזה לשעה.
  7. לשטוף עם TBST למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, וחזור על 3 פעמים.
  8. דגירה הקרום של נוגדנים משניים (מקושר HRP העכבר אנטי Fc נוגדנים) מדולל 1:2,000 TBST + 5% חלב רזה לשעה.
  9. לשטוף עם TBST למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, וחזור על 3 פעמים.
  10. להוסיף 1 מ"ל של מצע HPR לכל הסרט, ולפתח תמונות.

5. ג'ל סינון ניתוח

  1. להשתמש בעמודה הבאה: עמודה נפח של 24 mL; Equilibration מאגר של PBS pH 7.4; קצב הזרימה של 0.5 mL/min בחדר ממוזג; נפח דגימה של 200 µL.
  2. השתמש ריכוז ונפח חלבון הבאים: 500 µL של 1.2 מ"ג/מ"ל GPC3-S-Fab. צנטריפוגה ב g 20,000 x למשך 30 דקות, ולקחת µL 200 כדי לטעון.
  3. החלבון הסמן ריכוז ונפח, סעו µL 100 של ציטוכרום C (2 מ"ג/מ"ל, 12.4 kDa), 140 µL של אנהידראז (3 מ"ג/מ"ל, 29 kDa), 140 µL של אלבומין (10 מ"ג/מ"ל, 66 kDa) µL 200 של אלכוהול דהידרוגנאז (5 מ"ג/מ"ל, 150 kDa) לתוך שפופרת אחת. צנטריפוגה ב g 20,000 x למשך 30 דקות, ולקחת µL 200 כדי לטעון.
  4. לפני כל הפעלה, לשטוף עם פחות 2 קורות חיים של מים מזוקקים בספיקה של 0.5 mL/min.
  5. Equilibrate את העמודה עם פחות 2 קורות חיים equilibration מאגר (PBS, pH 7.4) בספיקה של 0.5 mL/min.
  6. באופן אוטומטי להזריק את הדגימה ב- 0.5 מ ל/דקה כדי לטעון את הדגימה.
  7. Elute עם equilibration מאגר ב 0.5 mL/min ולגלות -280, 215 ננומטר.

6. לזרום Cytometry ניתוח

  1. תרבות של HepG2 (GPC3 חיובי), Hep3B (GPC3 חיובי), Huh7 (GPC3 חיובי), ותאים MHCC - 97H (GPC3 שלילי) במנות פלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ המכיל DMEM בינוני עם 10% סרום שור עוברית (FBS), פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 ° C, 5% CO2.
  2. תרבות צ'ו (GPC3 שלילי) תאים ותאים צ'ו/GPC3 מסתירים את באורך מלא האנושי GPC3 cDNA (GPC3 חיובי) במנות פלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ המכיל RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  3. תרבות NK92/CD16 מחסה באורך מלא של האדם CD16 cDNA (CD16 חיובי) ב 25 ס מ2 בקבוק המכיל RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  4. כאשר התאים confluent 70-90%, ביטול המדיום ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל ל- PBS. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות (או עד התאים נתחיל לנתק מעל פני השטח). להוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול מלאה כדי לנטרל את טריפסין והשהה מחדש את התאים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
  5. לספור את מספרי הטלפון הנייד באמצעות hemocytometer נויבאואר ולגלות את הכדאיות תא על-ידי Trypan Blue.
  6. לאסוף 3 x 106 תאים עבור כל קו תא. להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA להשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר פעמיים.
  7. הוסף mL 0.3 של PBS + 0.2% BSA להשעות מחדש את התאים, להעביר כל שפופרת סיבוב המדרגה פוליסטירן מ ל 100 µL (כ 1 מיליון).
    הערה: נא ודא כי בכל הצעדים מכאן הצינורות צריכים להישמר קר על קרח. כאשר הנוגדן הוא איגוד אנטיגן פני שטח התא, המתחם יתחילו להפנים. על ידי שמירה זה קר, התהליך הוא האט באופן משמעותי.
  8. להוסיף 10 µL של נוגדנים הראשי (GPC3-S-Fab או IgG1 אנושי, ריכוז סופי 5 µg/mL) כל שפופרת, דגירה על קרח לשעה.
  9. להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA כדי לשטוף, צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר שלוש פעמים.
  10. להשעות מחדש ב- 100 µL של PBS + 0.2% BSA, ואז להוסיף 0.5 µL של נוגדנים משניים (אנטי-האדם ריכוז IgG(H+L)-488, גמר 10 µg/mL), דגירה על קרח על ה 1 הערה: מהשלב הזה, בבקשה להשאיר את התאים מן האור.
  11. להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA כדי לשטוף, צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר שלוש פעמים.
  12. לנתח את התאים על ידי זרימת cytometer על פי הנוהל המקובל29. רוכשים תאים עם 488 ננומטר לייזר עבור עירור.

7. מבחני ציטוטוקסיות

  1. להכין תאים סרטניים.
    1. תרבות HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H וצ'ו תא קווים כמתואר בצעדים 6.1-6.5.
    2. לדלל לתאים 0.5 × 105/mL, לוחית רישוי תאים µL 100 (5,000 תאים לכל טוב) על צלחות 96-ובכן. תרבות 6-8 h כדי לאפשר את התאים לצרף.
  2. להכין את תאי תאי דם היקפיים אנושי (PBMCs).
    1. לדלל דם טרי מוכן עם אמצעי אחסון שווה ל- PBS צינור חרוטי 50 מ. לדוגמה, לדלל 10 מ"ל של דם עם 10 מ"ל ל- PBS.
    2. לקחת 15 מ"ל של לימפוציטים הפרדה בינוני לתוך צינור חרוטי מ"ל. להעביר את הדם מדולל על המדיום ההפרדה לימפוציט לאורך הצד צינור לאט.
      הערה: לשמור את הצינור אנכי. אינם מפרים את פני השטח של המדיום ההפרדה לימפוציטים.
    3. צנטריפוגה ב 400 x g למשך 35 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם חופש.
    4. אט-אט להסיר את השכבה העליונה פלזמה, ולקחת את שכבת דם לבן המכיל PBMCs-הממשק בינונית של ההפרדה פלזמה-לימפוציטים.
    5. לדלל את PBMCs עם נפח כפול של PBS + 2% FBS. צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות.
    6. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS + 2% FBS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דק ספירת המספרים תא כפי שמתואר בשלב 6.5.
  3. להכין את תאי NK.
    1. המתלה PBMCs-ריכוז של 5 x 107 תאים למ"ל PBS + 2% FBS, ובמקום להכין אותם פנימה צינור עגול-התחתון פוליסטירן מ ל.
    2. להוסיף לתא NK האנושי העשרה קוקטייל µL 50/mL של תאים. מערבבים היטב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    3. Resuspend החלקיקים המגנטיים מן התא NK העשרה קיט, לערבב היטב כדי להבטיח שהם מושעים בצורה אחידה על-ידי pipetting למעלה ולמטה נמרצות יותר מ 5 פעמים. להעביר את החלקיקים מגנטי resuspended-100 µL/mL התליה תא. מערבבים היטב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    4. להביא התליה תא עד הנפח הכולל של 2.5 מ על-ידי הוספת PBS + 2% FBS. לערבב את התאים בצינור על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים. מקם את הצינור (ללא כובע) לתוך המגנט. תן beads מגנטי את תירגע 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הסר את המגנט. בתנועה רציפה אחת, היפוך ברכבת התחתית, לשפוך את התליה תא מועשר לתוך צינור חדש.
    6. ספירת המספרים תא כפי שמתואר בשלב 6.5.
  4. להגדיר את התגובה ציטוטוקסיות.
    1. לדלל תאי NK כדי 5 × 105 תאים למ"ל תוך שימוש באמצעי תרבות המתאים. להוסיף 100 µL של השעיה התא NK לתאי הגידול מצופה על צלחת 96-ובכן.
    2. להוסיף 10 µL של GPC3-S-Fab בריכוזים שונים, עם המינון הגבוה ביותר-ריכוז סופי של 30 µg/mL, דילול 3-fold, נקודה 9 (שלושה משכפל).
    3. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ב 72 h.
    4. לאחר 72 h של דגירה, להסיר את המדיום, להוסיף 100 µL בינוני DMEM המכיל 10 µL של ריאגנט CCK8 כדי מכל קידוח ב 96-ובכן צלחות ואני ואז דגירה ב 37 º C.
    5. לקרוא את הצלחת ב 450 nm ב 1, 2, 3 ו- 4 שעות לאחר הוספת הכימית CCK8.
    6. לנתח את הנתונים. לחשב את שיעור ההישרדות (OD450 GPC3-S-Fab + אפקטור + גידול - OD450 בינוני) / (OD450 הגידול - OD450 בינוני) × 100% ו (OD450 GPC3-S-Fab + גידול - OD450 בינוני) / (OD450 הגידול - OD450 בינוני) × 100%. התאים אפקטור הם תאי NK.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

GPC3-S-Fab טיהור

GPC3-S-Fab היה טהור של e. coli על ידי טיהור זיקה שני שלבים, הראשון עם Ni-נ-agarose, ואחריו IgG-CH1 זיקה טיהור. לאחר הטיהור זיקה בשני שלבים, GPC3-S-Fab היה טהור עד הומוגניות עם שתי השרשראות קרוב 1:1 (איור 2 א). הנוכחות של polypeptides VHH VH-CH1-CD16 ו- VL-CL ניתן לזהות באמצעות תגיות C-מסופים נפרדים שלהם, אנטי שלו עבור VL-CL כ 25 kDa וכן נגד דגל עבור kDa VH-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, אנו מציגים אסטרטגיה לבנות פורמט חדש של bsAbs, GPC3-S-Fab, אשר יכול לגייס תאי NK מיקוד תאי גידול חיובי GPC3. S-Fab מבוסס על Fab טבעי תבנית על-ידי הוספת11,VHH anti-CD1612. לעומת אזור Fc המכיל bsAbs, GPC3-S-Fab יכול בקלות להיות מיוצר את periplasm של חיידקים בקנה מידה גדול.

באמצעות האסטרטגיה ביטוי וטיהור תיאר בפרוטוקול, השגנו מסיסים ופונקציונלי GPC3-S-Fab בכמויות גדולות. כדי להקל על הביטוי periplasmic, pelB רצף האות הוסיפו את קצה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי R & D תוכנית של בפרובינצית גואנג-דונג (סין) (2016A050503028).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חממת טלטולתרמו פישרMAXQ 4000
חממת טלטולZhichengZWYR-D2402
צנטריפוגהCenceGL-10MD
צנטריפוגהבקמן קולטרAvanti j-26S XPI
צנטריפוגהeppendorf5810R
ספקטרופוטומטר אולטרה סגולתרמו פישרNanodrop
מכשיר אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד אנליטיMini-PROTEAN® TetraBio-rad
Trans-blotApparatus CriterionBio-rad
Imaging SystemBio-radChemidoc tm XRS+
Fast Protein Chromatogram Liquid ChromatogramGE HealthcareAKTA avant
GFcolumn GE Healthcare28-9909-44 Superdex 200 הגדל 10/300 GL
Flow Cytometerבקמן קולטרFC500
צנטריפוגהeppendorf5702R
קורא צלחת חזוןTECANאינסופי F50
אנטי His-tageBioscience14-6657-82
נגד דגל-תגSigmaF1804
אנטי אנושי (H& L)-488A11013Invitrogen
אנטי עכבר IgG HRP מקושר נוגדןאיתות תאים7076S
Ni-NTA-AgaroseTribioscienceTBS9202-100
IgG-CH1 שרף זיקהתרמו פישר194320005
Ficoll-Plaque PlusGE Healthcare17-1440-03
ערכת העשרת תאים NKגזע19055
ערכת מגנטStemcell18000
CCK8DojindoCK04
DMEMGibcoC11995500CP
RPMI-1640GibcoC11875500CP
סרום בקר עוברי (FBS)SigmaF2442
TrypsinGibco15050-057
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122תרבית תאים
סמן סטנדרטיסיגמא אולדריץ'MWGF200סינון ג'ל
איזופרופיל-b-D-תיו-גלקטופירנוזיד (IPTG)כימיקלים VWRVWRC0487-100G
צינורות דיאליזהסיגמא אולדריץ'D0655-100FT
KnanamycineVWRVWRC0408-100G
AmpicillinVWRVWRC0339-100 גרם
טריפטוןתרמו פישרLP0042B
תמצית שמריםתרמו פישרLP0021B
NaClסנגון ביוטקA100241
בסיס טריזמהסיגמא אולדריץ'T6791-1KG
EDTAסיגמא אולדריץ'V900106
גליציןאלאדיןA110752-500 גרם
KClאלאדיןP112134-500 גרם
MgClSigma AldrichV900020
AgarSangon BiotechA505255-0250
אשלגן פוספט, חד-בסיסי נטול מים (KH2PO4)VWR7778-77-0
נתרן פוספט, דו-בסיסי, נטול מים (Na2HPO4)VWR7558-79-4
2-מרקפטואתנולVWR60-24-2
פנילמתיל סולפוניל פלואוריד (PMSF)VWR329-98-6
LysozymeSigma AldrichL6876-25G
Coomassie Brilliant Blue R250VWRVWRC0472-50G
ברומופנול כחולסנגון ביוטקA500922-25G
סרום בקר אלבומין (BSA)VWRVWRC0332-100G
גליצרולסיגמא אולדריץ'V900122
צלחת פלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ צלחתקורנינג430167
25 ס"מקורנינג
96 בארות אשכול תרבית תאיםקורנינג3599
סוכרוזסנגון ביוטקA610498-0005
CHOאוסף תרבות הסוג של האקדמיה הסינית למדעיםGNHa 3
MHCC-97Hאוסף תרבות הסוג של האקדמיה הסינית למדעיםSCSP-528
HepG2אוסף תרבות הסוג של האקדמיה הסינית למדעיםTCHu 72
Huh7אוסף תרבות הסוג של האקדמיה הסינית למדעיםTCHu182
Hep3Bאוסף תרבות הסוג של האקדמיה הסינית למדעיםTCHu106
NK92ATCCCRL2408
תא בקבוק 430639

מקורות

  1. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  2. Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
  3. Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
  4. Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
  5. Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
  6. Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
  7. Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
  8. Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
  9. Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977(2017).
  10. Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653(2017).
  11. Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
  12. Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32(2016).
  13. Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
  14. Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
  15. Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
  16. Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
  17. Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
  18. Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
  19. Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
  20. Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
  21. Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
  22. Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
  23. Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
  24. Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
  25. Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
  26. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  27. Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
  28. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  29. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי ב-E.coliניקוי באמצעות Nickel-NTAתאי NKבדיקת ציטוטוקסיותפראיפלזמיבידוד PBMCקישור ל-GPC3כרומטוגרפיית זיקה
פילוח GPC3 נוגדן Bispecific, GPC3-S-חיובי, עם חזק Cytotoxicity
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.