ניתוח כמותי מיקרו-CT Aortopathy במודל של עכברים של β-aminopropionitrile-induced מפרצת אבי העורקים, דיסקציה

Summary

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט של שימוש של גומי סיליקון עופרת ריתוך perfuse את להערכת מאתר על קוטר אבי העורקים כימות במודל של עכברים של מפרצת אבי העורקים, לנתיחה.

Abstract

מפרצת אבי העורקים דיסקציה מזוהה עם תחלואה משמעותית ותמותה באוכלוסיה ואת יכולה להיות קטלנית. אמנם קיימים מודלים חייתיים של מחלות אבי העורקים, ויוו הדמיה של להערכת הוגבלה. בשנים האחרונות התפתחה טומוגרפיה ממוחשבת-מיקרו (מיקרו-CT) כמו מודאליות המועדפת הדמיה כלי שיט גדולים וקטנים כאחד ויוו ו- ex-vivo. בשילוב עם שיטת הליהוק וסקולרית, אנחנו משתמשים בהצלחה מיקרו-CT כדי לאפיין את תדירות והפצה של אבי העורקים פתולוגיה בעכברים C57/Bl6 β-aminopropionitrile-מטופלים. מגבלות טכניות של שיטה זו לכלול וריאציות איכות זלוף שהוצגו על ידי הכנת בעלי חיים המסכן ביישום מתודולוגיות נאותה על כימות גודל הספינה, את הלא-השרידות של הליך זה. מאמר זה מפרט מתודולוגיה זלוף קרישה תוך-כלית של קונדום הסיליקון בלייזר עופרת עבור אפיון aortopathy במודל של עכברים של מפרצת, ניתוח כמותי. בנוסף להמחיש פתולוגיה של אבי העורקים, שיטה זו עשוי לשמש לבחינת אחרים מיטות נימי הדם ויוו או של כלי הדם מיטות הוסר פוסט-מורטם.

Introduction

השכיחות של דיסקציה של אבי העורקים הוא 3 מקרים לכל 100,000 לכל שנה¹. דיסקציה של אבי העורקים ומחלות aneurysmal בחשבון מעל 10,000 מקרי מוות בארצות הברית בכל שנה, החשבונאי 1-2% ממקרי המוות כל מדינות המערב². דיסקציה של אבי העורקים הוא שיזם קרע בשכבה intimal של כלי השיט עם התפשטות של דם דרך השכבות של הקיר אבי העורקים תחת לחצים הפיזיולוגיות. לחצים מוגברות הדופק החולה המשויכים שכיחות מוגברת של דיסקציה וסיבוכים. קיר מוגברת גזירה מזוהה עם הרחבת אבי העורקים קיר המוביל היווצרות מפרצת^3,4. ההשלכות של דיסקציה של אבי העורקים כוללים את חסימה של זרימת דם לאיברים מרוחקים, כולל המוח, הכליות, המעיים, ואת הגפיים, היווצרות של מפרצות כרונית, קרע או מוות^5,6,7.

בזמן הנוכחי, תהליכים ביוכימיים וסלולריות מעורב החניכה, התקדמות של מפרצת אבי העורקים, והניתוחים הם הבינו עדיין כהלכה. לשחזור מודלים חייתיים של מפרצת אבי העורקים, דיסקציה הם המפתח להבנת פתופסיולוגיה שלהם. Β-aminopropionitrile (BAPN) הוא אוקסידאז lysyl, אשר מונע את cross-linking של אלסטין וקולגן, הוכח לשנות משמעותית את המבנה של מטריצה חוץ-תאית קיר את כלי השיט שלה תקינות biomechanical^{6, 8}. מכרסמים שטופלו BAPN כבר נעזרו כמודל בעלי חיים משותפים של מפרצת אבי העורקים, דיסקציה^9,10.

שיטות הדמיה כלי הדם הם סייעה בזיהוי פתולוגיה וסקולרית, המאשר כלי patency, והערכת איברים זלוף. לאחרונה, מיקרו-שחושב טומוגרפיה (מיקרו-CT) יש כבר מנוצל כדי ללמוד את להערכת של עכברים וחיות באופן דומה בגודל. בניגוד העצם, ההדמיה של כלי דם על ידי טומוגרפיה צירית היא מוגבלת, שכן intraluminal הדם הוא מטבעו יחסית radiolucent. בשילוב עם סוכנים בניגוד קרישה תוך-כלית, עם זאת, מיקרו-CT מאפשר שחזורים תלת מימדי מפורט של vasculatures בעלי חיים לצורך המחקר של מאקרו-אנטומי פתולוגיה וסקולרית¹¹.

הסוכן ניגודיות שנבחר (ראה את הטבלה של חומרים) הוא ברווז גומי סיליקון ריתוך המכיל עופרת כרומט ו עופרת סולפט. על זלוף בנוכחות זרז, במהירות מתקשה לגבש גבס של להערכת עם שינויים מינימליים באדריכלות כלי הדם, שהופך את להערכת מאוד בלייזר לעומת הרקמות רקע אנטומי-מאקרו כאשר בחן radiographically. הסוכן הניגוד הזה הוא יתרון כי זה הוא קל לטפל ומונעת את רקמת השפלה ואובדן כלי עקב שבירה קשורה לעיתים קרובות עם קורוזיה יצוקה כלי הדם. בזמן תהליך הייבוש עם התכווצות מינימלית¹², כלי נקי מדם נשארים פטנטים וגם מאפשרים הערכה מדויקת של המאקרו-להערכת בעלי חיים בניסויים ההישרדות. העבודות הקודמות השתמשה בהצלחה ניגודיות גומי סיליקון ריתוך במגוון של מחקרים שנעשו בבעלי חיים. באופן ספציפי, הוכח הישימות ב להמחיש את עורק glomerular, היפרדות, ואת מוחי circulations^{11,12,13,14,15} . בנייר זה, אנחנו פירוט המתודולוגיה של ניקוב שמאל-חדרית פתוח עבור זלוף קרישה תוך-כלית של גומי סיליקון ריתוך עופרת לאפיין באופן כמותי BAPN-induced פתולוגיה אבי העורקים במודל של עכברים על ידי מיקרו-טי

Protocol

הפרוטוקולים עבור טיפול בבעלי חיים היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועד של אוניברסיטת מרילנד, בולטימור (פרוטוקול בעלי חיים מס ' 0116024), מתנהל בהתאם לסטנדרטים בינלאומיים AAALAC.

1. הכנת נוגדנים

1. הפארין
   1. לדלל 250 µL של 1000 U/mL הפרין סולפאט ב 50 מ של פוספט buffered תמיסת מלח כדי להפוך ריכוז הסופי של 5 U/mL.
   2. לחמם את heparinized (5 U/mL) פוספט buffered תמיסת מלח, אשר יחליף את הדם להערכת באמבט מים מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס.
   3. להכין את משאבת לחץ מבוקר על-ידי חיבור הצנרת חובה ולרוקן 2 מזרקים 10-mL, 1 עבור מאגר מלוחים heparinized ו- 1 עבור הסוכן חדות.
   4. למלא את הצנרור עם מלוחים חמים פוספט heparinized buffered ולהסיר את בועות האוויר הצנרת של לחץ המשאבה.
2. הסוכן ניגודיות
   הערה: נא לפנות השולחן של חומרים עבור המרכיבים של ערכת סוכן חדות.
   1. מערבבים תרכובת פיגמנט עם diluent להשגת צבע 1:6 יחס diluent.
   2. מייד לפני השימוש (שלב 2.3.12), הוסף 200 µL של סוכן ריפוי כדי לכל aliquot 5-mL של המתחם פיגמנט מדולל, לערבב אותם היטב (4% לפי נפח).
      הערה: היצרן דיווח על שזמן העבודה הוא 40 דקות. כמו סוכן ניגודיות של גומי סיליקון מתחיל פולימריזציה 20 דקות לאחר התוספת של הסוכן ריפוי, חשוב להכין את הפתרון מייד לפני העירוי שלה.
3. BAPN שתייה
   1. להמיס β-aminopropionitrile (BAPN) במי השתייה כדי ליצור ריכוז סופי של דור 3/L (הותאם מן הפרוטוקולים שתואר קודם לכן בספרות)^9,16,17.
   2. ניהול המים לשתייה המכילות BAPN לקבוצה של עכברים פעם אחת הם גיל עד זלוף לסי-מיקרו 4 שבועות

2. ניתוח

1. הכנת בעלי חיים
   1. לגמול העכברים רוב בגיל 3 שבועות, לשמור אותם על 12 שעות אור/12 h מחזור כהה, להאכיל אותם תקן האוכל מכרסמים. עבור קבוצת שטופלו BAPN, לנהל BAPN שתייה טרייה עבור 16-26 שבועות ad libitum. מספקים שבעלי שליטה רגיל לשתות מים ad libitum.
2. טכניקת הרדמה
   הערה: 24 שעןת לפני הניתוח של CT, ההליך הבא מתבצע. ניתוחים שקטות להתכונן הדגימה זלוף intracardiac לאחר המוות.
   1. זירוז של הרדמה דרך מיכל אינדוקציה עם 100% O₂ ו- 3% איזופלוריין מועברת באמצעות מכשיר אידוי דיוק. לאחר אינדוקציה הרדמה, להפסיק את איזופלוריין ו לרוקן את המיכל עם O₂. לשמור על ההרדמה עם 2-2.5% איזופלוריין ו- 1 ליטר/דקה של O₂ באמצעות קונוס האף.
   2. לצרף את התא אינדוקציה והן את facemask מנבלות פחם עבור גז פסולת ספיחה כדי להגן על העובדים. ודא מטוס הרדמה נאותה על ידי הפגנת שיש אין תגובה לגירויים רעילים (הבוהן צביטה).
   3. להכין את שדה פעיל הכוללת מגש כירורגי, מכשירי הניתוח הדרוש.
   4. העברת החיה לשדה כירורגי ומקם אותה ב- recumbency הגבי.
3. טכניקת פעיל
   1. בעזרת מספריים, לבצע חתך קו האמצע דרך העור ורקמות רכות באמצע הדרך בין הערווה symphysis אל החריץ בחזה ובצלעות, הרחבת דרך העור ורקמות רכות המכסים את עצם החזה.
   2. בעזרת מספריים, ליצור חור הסרעפת על הסרעפת כדי להזין את חלל בית החזה.
   3. להשתמש במספריים לנתח את הסרעפת של הקיר החזה הגחון, בשני הצדדים.
   4. לחתוך הסחוסים costal להפריד את הצלעות לעצם החזה בגבול ישר בחזה ובצלעות.
   5. החל מלחציים hemostatic בסדר עד הקצה של עצם החזה (ליד הסרעפת), להזיז את עוצר דימום cranially כך ממוקם מעל ראשה של העכבר. זה יהיה לסגת את בלוטת התימוס ועל עצם החזה מן הלב, לחשוף את הלב ואת כלי נהדר עבור עוד מניפולציה.
   6. בחדות לנתח קבצים מצורפים כלשהם בין הלב לבין קיר החזה.
   7. להתחבר המחט צנתר הרביעי 27-מד מזרק טעון מראש עם 10 מ ל תמיסת פוספט heparinized buffered (5 U/mL) ולמלא כל צינורות עם המאגר כדי להסיר את בועות האוויר מן הצינורות של לחץ המשאבה.
   8. פעל בזהירות בעת הכנת הנוזל כמו בועות מילוי נוזל עשוי לעכב את המילוי של כלי קטן יותר. להגביל את מספר כי ניזוקו במהלך הכנת בעלי חיים, כלי כמו זה יגרום את הסוכן ניגודיות לדלוף החוצה כלי הדם קטועה, לשנות את אמצעי האחסון הדרושים עבור סתימה מוחלטת של החדרת חפצים ההדמיה הסופי.
   9. לנקב החדר השמאלי עם מחט 27-מד זה התייצב עם מלחציים מאונכים. מיד פצעים וחתכים החדר הימני או הכלילי התחתון כדי לנקז את הפתרון הפארין דם.
      הערה: הפארין משמש בתור נוגדת קרישה כדי למנוע את הדם לקרישה בכלי לאחר מותו של בעל החיים.
   10. Perfuse החיה בקצב קבוע של 2 מ לדקה באמצעות משאבה המזרק. הערה על בישול לעין לבן של האיברים. המשך זלוף עד perfusate ניקוז מהמחזור ורידים ללא דם (בערך 5-6 מ"ל). עוצרים את המשאבה.
   11. נתק את הצנרור צנתר הרביעי של המזרק 10-mL, מקפיד לא לשבש את מיקום המחט החדר השמאלי.
   12. מיד לאחר דימום למוות השלם, להפריד בין הפתרון הסוכן חדות לתוך 5-mL aliquots ולהוסיף את הסוכן ריפוי בשלב זה (ראה שלב 1.2). מערבבים אותם היטב. לצייר את 5 מ של המיקס הסוכן חדות לתוך מזרק 10-mL, perfuse החיה עם זה.
   13. עבור סתימה מוחלטת של כלי (העורקים והוורידים), ממשיכים את העירוי. התנגשות מעבר לנקודה כאשר ניתן לראות יציאה הפתרון ורידים. תחפשו סימנים זלוף מוצלח כולל הפריט החזותי של סוכן הליהוק העורקים הכליליים, עורקי הריאה, המעי, וכן להערכת בכבד.
   14. הסוכן ניגודיות ירפא לאחר כ 20 דקות בטמפרטורת החדר. על ריפוי, להוציא את האיברים בודדים, בהתאם לצורך, ותקן אותן בפורמלין במאגר נייטרלי 10%. לתקן את כל הגוויות אם הדגימות לא משמשים עבור מיקרו-CT סריקה ביום המחרת. אם הגוויות ישמש ביום שלאחר מכן, למקם אותם על מגש מתכת ומניחים במקרר ב 4 ° C כדי לרפא בן לילה.

3. מיקרו-סריקת CT ופרמטרים

הערה: הפרמטרים רכישה מסוים בתמונה יהיו תלויים המכונה בשימוש.

1. רוכשים טומוגרפיה הממחושבת תמונות טומוגרפיה של העכבר בכל למחרת את זלוף משתמש בסורק מיקרו-CT באמצעות מתח של שפופרת רנטגן של 55 kVp, זרם של 150 μA, פקטור ההגדלה מערכת של 2.19 CCD מצלמה פיקסל binning פקטור של 2. זה מניב גודל של פיקסל אפקטיבי של 29 מיקרומטר.
   1. להניח את הגווייה העכבר פרקדן על השולחן לסורק מיקרו-CT והשג סייר סריקת רנטגן.
   2. מתמקדים גלאי שדה הראייה של 57.4 מ"מ (מפוח) x מ מ 37.1 (transaxial) הגוף לשיקוף באורך מלא של אבי העורקים.
   3. רוכשים 180 תחזיות תמונה עם תוספת קבועה הסיבוב של 2 מעלות וזמן לכל תחזית של 2800 ms.
2. לשחזר את התמונות באמצעות אלגוריתם Feldkamp ששונה; הגודל voxel המשוחזרת הוא 29 x 29 x מיקרומטר 29³ (פורסים בעובי = 29 מיקרומטר) בעזרת את לוויזואליזציה תלת-ממדית עם מודאלים מרובים plug-in של התוכנה המשמש כאן.

4. עיבוד דפוס ובעיבוד

1. להמיר את הנתונים CT תבנית DICOM באמצעות תוכנה מתאימה.
2. לנתח את התמונות כדי לזהות אם מפרצת היה נוכח. למדוד את קוטר ציר קטין בנקודה הרחבה ביותר של קשת אבי העורקים, יורד באב העורקים החזי, ותיאר העורק הראשי כפי שצוין בעבר¹⁸ (איור 1).
   הערה: במחקר שלנו, תמונות נותחו על ידי שני משקיפים עצמאיים (אחד עיוור) ניצול הצופה DICOM לזהות אם מפרצת היה נוכח. קוטר ציר קטין נמדדה בנקודה הרחבה ביותר של קשת אבי העורקים, יורד באב העורקים החזי, העורק הראשי כפי שתואר לעיל¹⁹ (איור 1). כלומר-aneurysmal העורקים מקטעים של עכברים לא מטופל BAPN נוסדה קטרים נורמלי כלי הגשה לערכי הפקד מתאימים לגיל.
3. מפרצות מוגדרים של התרחבות מקומי או ' מאטום לשקוף ' של המקטעים אבי העורקים כדי קטרים גדול מ-50% מקוטר הפניה. אתר אלה בהתבסס על המדידות לעיל.

Results

על מנת להעריך פרוטוקול זה, 20 עכברים בוגרים זכר, רקע מעורב כמו שתואר לעיל¹⁹ ו 20-30 שבועות של גיל, עם או בלי טיפול BAPN, היו perfused עם גומי סיליקון ריתוך עופרת (ראה את טבלה של חומרים ) באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל. שעברו סריקה מיקרו-CT למחרת (איור 1 , איור 2). היו אין הבדלים משמעותיים הגילאים של העכברים בקרב כל הקבוצות בהשוואה.

Discussion

מיקרו-CT הדמיה יכול לשמש כדי לספק שחזורים מאוד מפורט, תלת מימדי של פתולוגיה וסקולרית במודלים של בעלי חיים. באמצעות מדיה משופרת ניגודיות קרישה תוך-כלית, שאינם משופרת רקמות רכות, כגון לומן של כלי דם, ניתן להבחין מאלה הם שיפור. בזמן לייזר דופלר, microangiography, תהודה מגנטית מסתמים, היסטולוגיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, או שני הפוטונים עשוי לשמש כדי להעריך מיטות כלי הדם, הם בדרך כלל מתמקדים שטח מוגבל של המחקר ו/או מוגבלות להערכות דו-ממדית. מיקרו-CT מספק אמצעים חסכוניים קבלת הדמיה מפורטת של מבנים כלי דם, אשר יכולים לסייע ברכישת...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	Flow Tech, Inc	MV-122	אנו משתמשים בצהוב, ניתן להזמין צבע אחר כרצונך. הערכה כוללת תרכובת MV, מדלל MV וחומר ריפוי MV.
הפרין (1000 U/mL)	Sagent Pharmaceuticals	25021-400-10
פוספט חוצץ	מלח קורנינג	21-031-CV
Isoflurane	Vet One, MWI	502017
3-Aminopropionitrile fumarate מלח	סיגמא-אולדריץ'	A3134
משאבת מזרק יחיד	פישר סיינטיפיק	14-831-200
27-gauge סט ורידים בקרקפת מחט	Exel Int	26709	27G x 3/4 ", 12 "צינור
Inveon סורק מיקרו-CT	סימנס פתרונות
Osirix MD	Pimxmeo SARL		גרסה 8.0.2
Inveon מחקר מקום עבודה	סימנס פתרונות		גרסה 4.2
מכרסם צ'או	הרלן טקלד	2018sx