מאמר שיטה

מודל ב חוץ גופית כדי לחקור את ההשפעה של טיפול פוטודינמי 5-Aminolevulinic חומצה-מתווכת על Staphylococcus aureus Biofilm

7.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57604

⸱

16 באפריל 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה מיקרוביאלית של 5-aminolevulinic חומצה בתיווך טיפול פוטודינמי (ALA-PDT) על ממבנה biofilm Staphylococcus aureus . פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לפתח מודל במבחנה ללמוד לטיפול biofilms חיידקי עם PDT בעתיד.

תקציר

Staphylococcus aureus (S. aureus) הוא. חיידק אנושית נפוצה, הגורמת זיהומים pyogenic ומערכתית. S. aureus זיהומים קשים להשמיד לא רק בשל הופעתה של זנים עמידים לאנטיביוטיקה, אלא גם את יכולתו ליצור biofilms. לאחרונה, כבר ציינו פוטודינמי תרפיה (PDT) בתור אחד של טיפולים פוטנציאליים לשליטה biofilm זיהומים. עם זאת, בהמשך מחקרים נדרשים כדי לשפר את הידע שלנו על השפעתו על biofilms חיידקי, כמו גם את המנגנונים המשמשת כבסיס. כתב יד זה מתאר מודל בתוך חוץ גופית של PDT עם 5-aminolevulinic חומצה (5-ALA), הקדמה על פוטוסנסיטייזר בפועל, protoporphyrin התשיעי (PpIX). בקצרה, בוגר S. aureus biofilms היו מודגרות עם ALA, ואז נחשף לאור. לאחר מכן, השפעת אנטיבקטריאלי ALA-PDT על S. aureus biofilm לכמת על-ידי חישוב המושבה יוצרי יחידות (CFUs), דמיינו ידי הכדאיות פלורסנט מכתים באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM). התוצאות נציג הפגינו השפעה אנטי-בקטריאלי חזק של ALA-PDT על biofilms S. aureus . פרוטוקול זה הוא פשוט והוא יכול לשמש כדי לפתח מודל במבחנה ללמוד הטיפול של S. aureus biofilms עם ALA-PDT. בעתיד, זה יכול גם להיות הפניה במחקרים PDT ניצול אחרים photosensitizers עבור זני חיידקים שונים עם התאמות מינימליות.

מבוא

S. aureus הוא הפתוגן גראם חיובי חשוב זה והצנרות את העור ורירית של בני-אדם כפונדקאים. היכולת שלה ליצור biofilms נחשב היבט חשוב של פתוגנזה שלו1. Biofilms חיידקי הם קהילה של חיידקים בתוך מטריצה מתוצרת עצמית, המורכב משילוב של חומרים פולימריים חוץ-תאית, כולל רב-סוכר, ה-DNA של חלבון. מטריצה זו ממלאת תפקיד משמעותי ההתמדה של זיהומים חיידקיים, לתרום רמה גבוהה של עמידות מערכת החיסון האנושית, טיפולים אנטי מיקרוביאליים הנוכחי2. אנטיביוטיקה הם עדיין הטיפול העיקריים עבור זיהומים biofilm, למרות השפעת אנטיביוטיקה על biofilms מוגבלים. הוכח בעבר כי תאים biofilms הם 10 - 1,000 פעמים יותר עמידים בפני אנטיביוטיקה לעומת עמיתיהם פלנקטוניים שלהם3. לפיכך, אסטרטגיות אלטרנטיביות יש צורך לכבוש את הבעיה.

PDT, טיפול חלופי עבור זיהומים חיידקיים, משתמשת אור באורך גל המתאים כדי להפעיל את photosensitizers. זה מוביל לייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS), אשר קטלניים לתאי המטרה על ידי שיבוש דופן התא, inactivating אנזימים, ומזיק דנ א4. מאפיין מטרות מרובות זה מקשה על חיידקים לפתח עמידות לטיפול PDT.

השפעת מיקרוביאלית PDT על biofilms חיידקים ופטריות, עם photosensitizers מרובים, כגון טולדין כחול, אנילין ירוק, כחול מתילן, כלור e6 ו porphyrins, נחקרה הקודם דוחות5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, prodrug של פוטוסנסיטייזר בפועל, PpIX, מאופיין על ידי שלה קטן משקל מולקולרי, סיווג מהירה12,14. יתרונות אלה לתת פוטנציאל מרכזי ALA-PDT כיישום טיפולית. למרות ההשפעה של ALA-PDT על חיידקים פלנקטוניים נחקרה על ידי קבוצות רבות12, ההשפעה מיקרוביאלית של ALA-PDT על biofilms חיידקי יש לא ובכל זאת כבר מבואר. בינתיים, קשה להשוות את התוצאות בין מחקרים קודמים. אחת מהסיבות היא כי הפרוטוקולים השונים משמשים על ידי קבוצות מגוונות. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של מערכת ALA-PDT בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו15. ההשפעה של מודל זה אושר ע י חישוב CFU ואת הכדאיות מכתים עם CLSM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ביופילמים

  1. ביופילמים ב 96-ובכן microplates
    1. אחזר את המתח S. aureus USA300 וללחצים 3 להיוות biofilm קליניים (C1 - C3) המאוחסנים ב- 80 ° c
      הערה: היכולת של זנים קליניים כדי ליצור biofilms נקבע על ידי וזמינותו צלחת microtiter שתוארה לעיל15.
    2. לחסן החיידק מ ל טריפטון סויה מרק (TSB) בינוני, מטפחים בתוך אינקובטור ברעידות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לשלב נייח.
    3. Centrifuge התרבות חיידקי לילה ב g x 4,000 10 דקות 25 ° c ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend כדורי בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי ריכוז סופי של 2.0 x 109 CFU/mL.
      הערה: ריכוז החיידקים היה מוערך על ידי מדידת צפיפות אופטית, בהמשך נקבע לפי לוחית ספירה16, חושף את 1 OD600 של השעיה הכיל 1.5 x 108 CFU/mL.
    4. לדלל את המתלים בקטריאלי כדי 1:200 (1.0 x 107 CFU/mL) בתוך בינוני TSB המכילה 0.5% גלוקוז. לחסן µL 200 של השעיה חיידקיים לתוך כל טוב של התא-תרבות-מטופלים פוליסטירן 96-ובכן microplate.
    5. דגירה של microplate סטטית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה תחת סביבת טוב מחומצן.
      הערה: זמן דגירה ביופילמים בוגרים עשויים להשתנות עבור זני חיידקים שונים; זה צריך להיקבע לפני PDT הניסוי15.
    6. למחוק את המדיה הבארות, לשטוף את בארות microplate בעדינות עם PBS שלוש פעמים ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
      הערה: הצעד צריך להתבצע בעדינות כדי שלא להפריע למטופלים את biofilm במבנה תקין.
  2. ביופילמים במנות
    1. לחסן את המתח S. aureus USA300 לתוך 5 מיליליטר TSB בינוני, מטפחים בתוך אינקובטור ברעידות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לשלב נייח.
    2. Centrifuge התרבות חיידקי לילה ב g x 4,000 10 דקות 25 ° c ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend כדורי ב- PBS כדי ריכוז סופי של 2.0 x 109 CFU/mL. לאחר מכן, לדלל את המתלים בקטריאלי כדי 1:200 (1.0 x 107 CFU/mL) בתוך בינוני TSB המכילה 0.5% גלוקוז. לחסן 2 מ"ל של השעיה חיידקיים לתוך תבשיל תרבות איכות אופטית 35 מ מ התא התחתון זכוכית, דגירה סטטית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: ריכוז החיידקים הוערך על ידי מדידת צפיפות אופטית.
    3. תשאף התקשורת עם פיפטה, ואז לשטוף biofilms בצלחת בעדינות עם PBS שלוש פעמים ולאחר מכן, למחוק את תגובת שיקוע בקפידה.
      הערה: להימנע מלגעת הטיפ פיפטה לתחתית של המנה. הצעד 2.2 צריכה להתבצע מיד לאחר שלב זה כדי למנוע התייבשות biofilm בנוי.

2. אור הקרנה

  1. לאחסן במקרר 4 ° C 5-ALA. לפני הניסוי, לדלל 5-ALA תסיים עד 10 מ מ.
    הערה: 5-ALA פתרון צריך להיות טרי מוכן לפני הניסוי.
  2. בקבוצה ניסיוני, להוסיף 200 µL 10 מ מ ALA מכל קידוח של microplate או 2 מ"ל לצלחת תרבות. מכסים את הכלי/הצלחת עם רדיד אלומיניום, תקופת דגירה של 1 h. לאחר מכן, להאיר את המנה/הצלחת עם דיודות פולטות אור (LED) עם עוצמת האור של mW/cm 1002 ב 1 h להשיג מנה קלה של 360 J/cm2 אורך גל גדול של ± 10 633 ננומטר17.
    הערה: על מנת לאפשר את אנרגיית האור ביעילות, באותה מידה להישלח biofilm כל הכלים/הבארות, לתקן את המרחק מן הפסגה של מקור האור טוב/למנה של 6.0 ס מ ולאחר להגביל את האזור ניסיוני לאזור המרכזי הקרנה (10 ס מ x 8 ס מ)-על מנת להבטיח כי התוצאות הן לשחזור, הניסויים צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר אותו.
    בשלב הקרנה LED, כדי למנוע חשיפה ישירה של הצלחת מקורות אור אחרים, כגון אור השמש, תאורת החדר או המנורה, ה-LED הופעלה לפני העברת המנה/הצלחת לאזור הקרנה, האור היה מספיק פיקח כדי לסיים את הפעולה.
  3. להגדיר את קבוצות הבקרה (בשלוש קבוצות שליטה הוקמו בתוך הניסוי שלנו).
    1. עבור הפקד הראשון קבוצה (ALA - LED-), להוסיף µL 200 ל- PBS כל טוב של microplate או 2 מ למנה תרבות. מכסים את הכלי/הצלחת עם רדיד אלומיניום, דגירה זה כבר שעתיים.
    2. עבור קבוצת הביקורת השנייה (ALA + LED-), להוסיף 200 µL 10 מ מ ALA מכל קידוח של microplate או 2 מ"ל לצלחת תרבות. מכסים את הכלי/הצלחת עם רדיד אלומיניום, דגירה זה כבר שעתיים.
    3. עבור קבוצת הביקורת השלישית (ALA-LED +), להוסיף µL 200 ל- PBS כל טוב של microplate או 2 מ למנה תרבות. מכסים את הכלי/הצלחת עם רדיד אלומיניום, דגירה זה מאובטח. ואז חושפים את הצלחת אל ה-LED עם 360 J/cm2 אור הקרנה-אורך גל גדול של ± 10 633 ננומטר17.
      הערה: בשלב הקרנה LED, למנוע חשיפה ישירה של הצלחת מקורות אור אחרים, כגון אור השמש, תאורת החדר או הפנס שלי נתקל בקורה.

3. קביעת יעילותו של טיפול PDT

הערה: כדי לאשר את ההשפעה של ALA-PDT על biofilms S. aureus , הכדאיות של התאים עם או בלי ALA-PDT הוערך על ידי ספירת CFU, כמו גם על ידי צביעת הכדאיות.

  1. קביעה של תאים חיידקיים קיימא
    1. לאחר טיפול ALA-PDT, למחוק את המדיה הבארות, לשטוף את הבארות עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר את כל התאים שאינם מחסידי עבור שנינו ניסיוני ולשלוט קבוצות.
      הערה: שלב זה צריך להתבצע בעדינות.
    2. לגרד את תאי חיידקים חסיד ביסודיות מן הבארות עם קצה פיפטה ולאסוף את התאים צינורות חרוט.
    3. Centrifuge התליה חיידקי ב g x 4,000 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.
    4. Resuspend החיידק ב 1 מ"ל של האנזים pancreatin 0.25% ב- PBS, דגירה ב 37 ° C עבור 1.5 h.
    5. צנטריפוגה ב g x 4,000 10 דקות; למחוק את תגובת שיקוע ולאחר מכן resuspend בגדר ב- µL 200 ל- PBS.
    6. עושה 1:10 דילולים טורי של הפתרון תא עם PBS; לאחר מכן, הוסף 5 µL של כל מדגם טורי דילול על צלחת אגר (TSA) סויה טריפטון. דגירה לצלחת TSA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות; לאחר מכן, לספור (על-ידי בעין בלתי מזוינת) מספר מושבות חיידקים (CFU/mL).
  2. התבוננות S. aureus biofilms על ידי CLSM
    1. לאחר הקרנה בהיר, שטוף biofilms בצלחת תרבות עם PBS שלוש פעמים.
      הערה: שלב זה צריך להתבצע בעדינות.
    2. להוסיף 1 מ"ל של 1 מיקרומטר ירוק-פלורסנט גרעינית, כתם כרומוזום הוא חדיר לקרום התא prokaryotic (למשל, SYTO9), 1 מ"ל של יודיד propidium 1 מיקרומטר (PI) במשך 20 דקות להכתים את biofilm, כמו גם תאים מתים.
    3. להתבונן התאים קיימא (ירוק פלורסצנטיות, Ex / Em 485 nm/530 ננומטר) ותאים מתים (פלואורסצנטי אדום, Ex / Em 485 nm/630nm) תחת CLSM עם עדשה המטרה של שמן-טבילה 63 X 1.4-נה.
    4. ליצור תמונות באמצעות מיקרוסקופ תוכנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הכדאיות של החיידק ב biofilms ירדו לאחר הטיפול ALA-PDT בהשוואה הפקדים (ALA - LED-, ALA + LED - ולאחר ALA-LED +) USA300 והן קליניים שלושה זנים (איור 1).

כדי לאשר assay תוצאות CFU ולבחון את תכונות אנטיבקטריאליות ההשפעה של ALA-PDT על ה S. aureus biofilm בחיי עיר, USA300 biofilms היו דמיינו ידי CLSM עם הכדאיות מכתים. התאים קיימא ו מת היו מוכתמים ירוק ואדום פלורסצנטיות, בהתאמה. התמונה הר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

PDT מאז טיפול למד היטב לטיפול בסרטן היא הומצאה לפני יותר מ-100 שנה18. במהלך העשור האחרון, PDT הוחל כמו אסטרטגיית מיקרוביאלית, הראה יעילות נגד כמה חיידקים פתוגניים עמידים לאנטיביוטיקה12. בהשוואה למצב פלנקטוניים, biofilms חיידקי מופיעים להיות עמידים יותר בפני טיפול אנטיביוטי3, בעוד ההשפעה של ALA-PDT על biofilms לא מלא נחקר עדיין.

במאמר זה, מערכת ALA-PDT במבחנה תוארה, ההשפעה אנטיבקטריאלי של מודל זה על S. aureus <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף

תודות

עבודה זו מומן על ידי הלאומי הטבע מדעי היסוד של סין עבור חוקרים צעירים (מספר 81300810), רופא צעיר שנגחאי תוכנית אימונים (מספר 20141057) הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81671982, 81271791 ו- 81571955). ברצוננו להודות LetPub (www.letpub.com) על מתן סיוע לשוני במהלך הכנת כתב היד הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מרק סויה טריפטון (TSB)OXOIDCM0129B
טריפטון סויה אגר (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012ערכות כדאיות חיידקים LIVE/DEAD BacLight 
Propidium iodide (PI)Thermo Fisher ScientificL7012ערכות כדאיות חיידקים LIVE/DEAD BacLight 
PancreatinSigma-AldrichP3292
5-aminolevulinic acid (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus זן USA300//The Source of USA 300 הפניות " Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. ספטמבר 2009; 64(3):441-6".
Staphylococcus aureus זנים קליניים (C1-C3)//כל הזנים הקליניים בודדו מחולים עם רינוסינוסיטיס כרונית במחלקה לאף אוזן גרון-ניתוחי ראש וצוואר, בית החולים לעיניים ואף אוזן גרון של אוניברסיטת פודאן [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 מרץ; 12(3): e0174627].
96 בארות מיקרופלייטקורנינג בע"מ3599מיקרופלטות פוליסטירן שקופות עם תחתית שטוחה TC, עטופות בנפרד, עם מכסה,
סטרילית פלואורודישNEST ביוטכנולוגיה801001לא פירוגניים
, 1.5 מ"לאפנדורף0030120086
מיקרוצנטריפוגה אפנדורף 5417אפנדורףZ365998 |  SIGMA
IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 שייקרים אורביטליים ספסליים
דיודה פולטת אור (LED)ווהאן יאג טכניקה אופטית ואלקטרונית COLED-IB
Leica TCS SP8 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליLeica Microsystems
LAS תוכנת AFLeica Microsystems
IMARIS תוכנהBitplane
תחתית זכוכית, צינורות אפנדורף Leica

מקורות

  1. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
  2. Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
  5. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
  6. Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
  7. Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
  8. Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
  9. Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202(2015).
  10. Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
  11. De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).
  12. Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
  13. Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
  14. Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
  15. Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).
  16. Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863(2013).
  17. Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
  18. St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
  19. O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
  20. Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
  21. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  22. Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
  23. Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים