צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של Bacillus Mycoides תפוחי אדמה שחורה Exudates

סיכום

המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.

תקציר

הבקטריה צמח-הקשורים לשחק תפקיד חשוב בקידום הצמיחה ולמניעת מחלות בצמחים. היישום של הצמח הצמיחה וקידום rhizobacteria (PGPR) כסוכני biofertilizers או משולבת הפך חלופה יעילה לשימוש בדשנים קונבנציונלי ו יכולים להגביר את הפרודוקטיביות חיתוך במחיר נמוך. אינטראקציות צמח-חיידק תלויים אותות מופרש הצמח הפונדקאי ואת תגובת לכאן בזמן שנסעתי על ידי חיידקים הקשורים שלהם. עם זאת, המנגנון המולקולרי של חיידקים מועילים כיצד להגיב שלהם הקשורים הצמחי אותות אינם מובנים במלואם. הערכת התגובה transcriptomic של חיידקים השורש exudates היא גישה רב-עוצמה כדי לקבוע את ביטוי גנים חיידקיים ורגולציה בתנאים rhizospheric. ידע כזה יש צורך להבין את המנגנונים שבבסיס מעורב אינטראקציות צמח-חיידק. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ללמוד את התגובה transcriptomic של mycoides נולד ב- EC18, זן מבודד את endosphere תפוחי אדמה, כדי exudates שורש תפוח אדמה. בעזרת הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף האחרונות, פרוטוקול זה יכול להתבצע תוך מספר שבועות, התוצרת datasets מסיבית. ראשית, אנו אוספים את exudates שורש בתנאים סטריליים, לאחר מכן הם מתווספים mycoides דרב תרבויות. הרנ א מהתרביות האלה היא מבודדת באמצעות שיטה פנול/כלורופורם בשילוב עם ערכת מסחרי ונחשפו בקרת איכות על ידי כלי נגינה אוטומטיות אלקטרופורזה. לאחר רצף, ניתוח נתונים מתבצע באמצעות הצינור T-REx מבוססת-אינטרנט, קבוצה של גנים ביטוי באופן שונה מזוהה. שיטה זו היא כלי שימושי כדי להקל על תגליות חדשות על גנים חיידקיים מעורב אינטראקציות צמח-חיידק.

מבוא

צמחים מאי תפליט עד 20% של פחמן קבוע בעת ההטמעה דרך השורשים של rhizosphere¹, כלומר, אזור צר של אדמה בקרבת השורשים. בשל הזמינות מזין גבוה, rhizosphere הוא גידול מתאימים עבור מיקרואורגניזמים מגוונים, כולל צמחים-צמיחה קידום חיידקים. Exudates שורש להכיל מגוון של חומרים אורגניים נדיפים כמו יונים, חומצות אנאורגניות, חמצן ומים. עם זאת, הרוב המכריע של exudates הבסיס נוצר על ידי חומרים אורגניים, אשר ניתן לחלק תרכובות משקל מולקולרי נמוך, משקל מולקולרי גבוה תרכובות. תרכובות משקל מולקולרי נמוך כולל חומצות אמינו, חומצות אורגניות, סוכרים, תרכובות בעל תאים פנוליים, חומצות שומן, ושורה של מטבוליטים משניים. תרכובות משקל מולקולרי גבוה מורכב^2,mucilage, חלבונים³. Rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשתמש בחלק תרכובות אלו כמקור אנרגיה לצמיחה ופיתוח. Exudates שורש תפקיד חשוב בעיצוב הקהילה rhizobacterial מאז המיוצר במפעל תרכובות של exudates יכולים להשפיע על ההתנהגות של חיידקים rhizosphere-הקשורים על ידי המשפיעים על הביטוי של גנים ספציפיים.

הבנת התגובה חיידקי השורש exudates היא צעד המפתח בפענוח מנגנוני אינטראקציה צמח-חיידק. כמו התגובה חיידקי אינטראקציות צמח-חיידק הוא התוצר של ביטוי גנים דיפרנציאלית, זה ניתן יהיה ללמוד על ידי ניתוח transcriptome. באמצעות שיטה זו, מחקרים קודמים זיהו מספר חשוב גנים המעורבים באינטראקציה צמח-חיידק. ב- Pseudomonas aeruginosa, גנים המעורבים חילוף החומרים, כימוטקסיס וסוג II הפרשת הוצגו להגיב exudates שורש סלק סוכר⁴. מאוורר ואח. ⁵ חקר את פרופיל transcriptomic של amyloliquefaciens נולד ב- FZB42 בתגובה exudates שורש תירס. התוצאות שלהם מראים כי של גנים חריפה הנגרמת על ידי exudates השורש, מספר קבוצות מעורבים מסלולים מטבוליים הנוגעים ניצול מזין, כימוטקסיס, תנועתיות ו- 30s ריבוזומלי סינתזה של פפטידים מיקרוביאלית ו- polyketides.

הדיוק של מחקרים אלה מסתמך על האוסף של השורש exudates. למרות מספר שיטות תיארו את האוסף של שורש exudates למטרות שונות, הם דורשים מכשירים מתוחכמים או לא יבוצעו ב תנאים מבוקרים היטב-^6,-^7,-⁸. יתר על כן, עיכוב rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע על שורש תפליט הרכב על ידי המשפיעים על חדירות קרום התא צמח ופגיעה ברקמות שורש, במיוחד במקרה של קונסורציומים של מיקרואורגניזמים⁹. כאשר חוקרים התגובה מיקרוביאלי שורש exudates, חשוב להשתמש בתנאים מוגדרים היטב על מנת למנוע שינוי של תרכובות על-ידי מיקרואורגניזמים¹⁰. יתר על כן, ה-RNA באיכות גבוהה נדרש עבור ה-RNA-seq המבוסס על מחקרים transcriptome. עם זאת, בעת התמודדות עם זנים שאינם-מודל-בקטריאלי, פרוטוקולים סטנדרטיים או קיטים מסחריים יש בדרך כלל של יעילות נמוכה עקב גורמים לא ידועים או מאפייני צמיחה מיוחד.

הפרוטוקול המתואר כאן אומתה באמצעות mycoides דרב, אשר הוא חיידק גראם חיובי, יוצרי ספורה של שלקרוא Firmicute. . זה נמצא בכל מקום, rhizosphere של מיני צמחים שונים. גידול צמח מספר מאפיינים קידום דווחו על מין זה, לרבות אינדוקציה ההתנגדות שיטתית (ISR) סלק סוכר¹¹, עיכוב של המתלים-off המחלה Pythium מלפפון¹², כמו גם חנקן קיבוע חמניות rhizosphere¹³. עם זאת, המנגנון המולקולרי של ביחסיו עם צמח המארח לא טוב נלמדים.

המטרה של הניסויים המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere דרב mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. בקיצור, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: ראשית, לאסוף תפוחי אדמה exudates שורש בתנאים סטריליים. לאחר מכן, לחלץ RNA באיכות גבוהה מתאים חיידקיים שטופלו exudates השורש. השלב הסופי הוא ניתוח נתונים תוך שימוש באינטרנט T-REx צינור¹⁴. פרוטוקול זה שימש לזיהוי גנים mycoides דרב הצג את משמרת ברמות הביטוי בעת מגע עם שורש-exudates, ובכך עלול לשחק תפקיד חשוב ב אינטראקציות צמח-חיידק.

פרוטוקול

1. הנבטת תפוחי אדמה בתנאים מעוקר

1. יש לשטוף את פני השטח של תפוחי אדמה עם מים סטריליים. לטבול את תפוחי האדמה ב-70% אתנול, ולאחר מכן ב 3% נתרן תת-כלורי, למשך 5 דקות. לשטוף את זה שוב עם מים סטריליים כדי להסיר כל נתרן הנותרים תת-כלורי.
2. להכין את החומרים הדרושים הנבטת וגדל פקעות תפוחי אדמה; לחטא את הסירים פלסטיק, engraftment סלים, ורמיקוליט, ומים על ידי autoclaving אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   הערה: ודא כל החומרים המשמשים autoclavable. אחרת, השתמש בשיטות אחרות לחיטוי.
3. מכניסים את תפוחי האדמה לעקר השטח הסל engraftment, המקום הזה סיר בלוק המכיל ורמיקוליט רטוב.
4. לשמור את הסיר בתוך תא האקלים ב 24 מעלות צלזיוס במשך שלושה שבועות. להגדיר אותו על מחזורים של 16 שעות של אור (120 µmol ז^-2s^-1) ו- 8 שעות החושך. כדי להימנע מציג מיקרוביאלי, להשתמש בתיבת סיבי זכוכית גדול כדי לכסות את הסיר.

2. איסוף תפוחי אדמה שחורה Exudates

1. כאשר נצרי נבט, העברת הסל עם תפוחי אדמה שלם לתוך גביע סטיריליים מלא 150 מ ל מים יונים בלוק, עם תפוחי אדמה פקעות ממוקמים מעל פני המים ואת השורשים שקוע במים (ראה איור 1). לשמור שתיל בתא האקלים, להשתמש באותן הגדרות כמו קודם [24 ° C; מחזורי h 16 אור (120 µmol ז^-2s^-1), 8 שעות החושך].
2. ביום השני על, איסוף של מים המכילים את exudates, למלא את. הספל עם מים יונים סטרילי. לבצע הדגימה כל יום עד יום השביעי לאחר העברת שתיל.
3. לאחסן כל מדגם בנפרד ב 4 º C. עבור כל דגימה, להפיץ µL 100-לוריא-Bertani (ליברות; 1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 0.5% NaCl) צלחת אגר כדי לבדוק אם מציג מיקרוביאלי. למחוק את הדגימות מזוהמים.
4. לשלב את הדגימות שנאספו של שתיל אחד, לרכז אותם על ידי ליופיליזציה אותם ב-40 ° C עד נפח סופי של 150 מ.

3. גידול חיידקים

1. פסים זן mycoides דרב מ-80 מעלות צלזיוס גליצרול מניה על גבי צלחת אגר ליברות, דגירה את הצלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. לחסן בינוני נוזלי ליברות עם מושבה בודדת מהצלחת ולהגדיל את התרבות ב חממה חזק ב rpm 200 בן לילה ב 30 º C.

4. טיפול ודגימה של חיידקים

1. כדי להשוות בין עקומת גידול של חיידקים שטופלו exudates שורש לפקד שלילי, מכינים סדרת מבחנות המכילות 50 מ של המדיום הנוזלי ליברות. להוסיף 0.5 מ"ל של התרבות חיידקי לילה כל צלוחיות, ולהוסיף או 0%, 5%, 10%, 15% (v/v) שורש תפליט או במים סטריליים יונים המדיום, בהתאמה.
2. להשתמש תרבות עם מים יונים במקום exudates שורש פקד. מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD₆₀₀) כל h 1 לאחר מכן. יוצרות עקומת גדילה ידי הערכים₆₀₀ OD נגד הזמן.
   הערה: ראינו כי 10% exudates הבסיס לא השפיע על צמיחת mycoides דרב (ראה איור 2); יחס זה שימש לניסויים RNA-seq.
3. לדלל תרבות mycoides דרב לילה עם 90 מיליליטר מראש ומחוממת LB בינוניים עד ה OD הראשונית₆₀₀ של ~ 0.05 בבקבוקון 300 מ ל. להוסיף 10 מ של exudates הבסיס לתרבות, דגירה זה ב 30 ° C עבור 1 h.
4. להשתמש טיפול במים סטריליים יונים 10 מ"ל פקד. איסוף תאים מתרבות על ידי צנטריפוגה ב g x 9,000 למשך 2 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, מיד להקפיא בגדר של חנקן נוזלי ואז לאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.

5. RNA בידוד

הערה: לפני שמתחילים את הבידוד, להכין עבודה, שעליו מונחים, ארונות תקשורת, פיפטות על-ידי ניקוי אותם עם פתרון טיהור RNase (ראה טבלה של חומרים). ללבוש כפפות בכל עת, ודא כי כל צינורות, עצות ופתרונות הם נטולי RNase. תמיד לשמור את הדוגמאות על קרח במידת האפשר.

1. להוסיף מים הנדסה גנטית (100 µL של DEPC לכל פתרון 100 מ ל) מ- 0.1% (v/v) diethyl pyrocarbonate (DEPC), מערבבים אותו היטב, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך הלילה. אוטוקלב התערובת כדי להשבית את DEPC לאחר טיפול לילה. שימוש זה שטופלו DEPC מים הנדסה גנטית כדי להכין המאגר טה [10 מ מ טריס-HCl (pH = 8); 1 מ"מ EDTA] ו 10% הפתרון מרחביות (w/v).
2. להפשיר את כדורי תא על הקרח, להשעות את כל µL 400 מאגר TE (DEPC). להעביר את המתלים לתוך צינורות פקקי בורג 2 מ"ל.
3. Premix µL 300 באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1 v/v) ו- 300 µL של פנול (חומצה פנול, כיתה ה-RNA), ולאפשר את התערובת לעמוד במשך 5 דקות. קח µL 500 השלב העליון אורגני כדי להוסיף התאים resuspended. לאחר מכן להוסיף 50 µL למען חברה דמוקרטית 10% וכ -0.5 גר' חרוזי זכוכית (0.5 מיקרומטר) לתוך הצינור.
4. לסגור את הפקק בחוזקה ולמקם את הצינורית מהמגן חרוז-מיל (ראה טבלה של חומרים). ביצוע של s 3 × 45 הדופק המגון עם מרווח 1 דקות על קרח.
5. Centrifuge את הדגימות 10 דקות ב 11,000 x g (4 ° C), ולהעביר את השלב העליון צינור חדש.
6. להוסיף 500 µL באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1) השלב העליון מ שלב 5.5, centrifuge את התערובת למשך 5 דקות ב x 11,000 g (4 ° C).
   הערה: השלבים הבאים ששונו של הוראת היצרן מסחרי זכוכית סיבים מבוסס מסנן ה-RNA בידוד קיט (ראה טבלה של חומרים).
7. µL 500 השלב העליון להעביר צינור טריים, להוסיף 2 כרכים (1 מ"ל) של מאגר פירוק/איגוד ולערבב אותו על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
8. לשלב את הצינורות מסנן ואוסף (מתוך ערכת בידוד ה-RNA), pipette את התערובת מהשלב 5.7 הצינור מסנן. Centrifuge צינורות 15 s ב- 8,000-g ולהשליך הזרימה דרך.
9. להכין 1.5 mL microcentrifuge צינורות עם µL 100 DNase מאגר, 10 µL של DNase ואני µL 5 של מעכב RNase (ראה טבלה של חומרים). הוסף את התמהיל פתרון מוכן מסנן של הצינור מסנן, דגירה זה למשך 20-30 דקות ב- 15-25 מעלות צלזיוס.
10. בצע את השלבים כביסה לפי הוראות היצרן. השתמש µL 50 של מאגר • תנאי כדי elute את הרנ א.
11. להציל את הרנ א eluted ב-80 מעלות צלזיוס, לשים סרט פרפין פלסטיק מסביבו. במקביל, להעביר כמה microliters של המדגם צינור microcentrifuge 1.5 mL לבצע בדיקת איכות '.

6. בדיקת האיכות RNA ורצף

1. בררו את הרנ א ספקטרופוטומטרים microvolume.
   הערה: ספיגת יחס-260/280 צריך להיות מעל 1.8, יחסי-260/230 צריך להיות מעל 1.8 לפחות, רצוי מעל 2.0.
2. הפעל הרנ א מטוהרים בכלי נגינה אלקטרופורזה אוטומטית באמצעות הניתוח RNA להמליץ קיט (ראה טבלה של חומרים); המספר שלמות RNA (RIN) חייב להיות לפחות מעל 7 כדי להמשיך.
3. שימוש בסכום כולל של µg 3 של RNA לדגימה ליצירת ספריות עם הכנה ספריה RNA-Seq קיט (ראה טבלה של חומרים) בעקבות ההמלצות של היצרן.
   הערה: ההכנות הספרייה היו וסודרו על פלטפורמה רצף תפוקה גבוהה, קריאות לזווג-end נוצרו.

7. נתוני ניתוח באמצעות צינור מבוסס-אינטרנט של T-REx

1. ביצוע איכות סינון באמצעות FASTX-ערכת הכלים גירסה 0.0.13 (Phred איכות עשרות > 20). חתוך את קריאות RNA-Seq raw של הרצפים מתאם עם הכלי Trimmomatic.
   הערה: כל הבדיקות במורד הזרם התבססו על נתונים נקי עם איכות גבוהה.
2. הורדת הנתונים הגנום של בקרת האוויר 6462 NCBI mycoides דרב (ההצטרפות NCBI מס: CP009692.1) ולהשתמש בו בתור גנום הפניה למיפוי את קריאות נקי באמצעות Bowtie2/2.2.3.
3. שימוש v0.6.1 HTSeq לספור את המספרים קריאות למפות כל הגן, הקריאות לכל kilobase של התעתיק לפי קריאות ממופה מיליון (RPKM) של כל הגנים המבוססת על האורך של הרוזן ג'ין וקורא שמופו אל הגן הזה.
4. לניתוח של הנתונים על-ידי הצבר. טי-רקס, היעזר בטבלה RPKM קלט, וכן שלושה קבצים תיאורי: (i) קובץ גורמים כדי לתאר את הניסוי גורמים, (ii) קובץ ניגודים להגדיר אילו גורמים יושוו על ביטוי גנים דיפרנציאלית , וכן (iii) קובץ בכיתה לתיאור קבוצות של גנים של עניין.
   הערה: קבצי תיאורית נמצאים בתבנית in.txt. דוגמאות ניתן למצוא באתר האינטרנט של טי-רקס (http://genome2d.molgenrug.nl/). הוראה מפורטת לניתוח נתונים באמצעות T-REx ניתן למצוא בפרסום הקודם על ידי דה יונג. et al. ¹⁴.

תוצאות

צמח-הקשורים מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע באופן חיובי על צימוח ובריאות. עם זאת, המנגנון של אינטראקציות מורכבות בין צמחים שלהם אנחנו חיים איתם בסמביוזה חיידקים הם אינה מובנת במלואה. שורש exudates יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות rhizobacterial של התנהגות, זה בדרך כלל הוא שמהווה הקולוניזציה מיקרוביאלית של שורשים יוזם עם האטרקציה של חיידקים כדי exudates השורש. מטרת עבודה זו היה לחקור את התגובה transcriptomic של rhizobacterial דרב mycoides כדי exudates שורש תפוח אדמה. כדי ליישם את זה, פק...

דיון

אינטראקציות צמח-חיידק יש כבר שיערו להיקבע על-ידי שיווי משקל משומנת בין חיידקים וצמחים. אינטראקציות כאלה הם מורכבים מאוד, קשה ללמוד במערכת טבעית, אשר כוללת מגוון מינים מיקרוביאלי, כגורם העלול קונסורציומים. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוטה ללמוד את חיידקי בתגובה שורש exudates בתנאים מבוקרים היטב. הפרופיל transcriptome של rhizobacteria, בתגובה לחשיפה שורש exudates, מספק מידע מפורט על חיידקי ההסתגלות הגומחה rhizosphere. פרוטוקול אוסף זה שורש exudates אינו מצריך פרוצדורות מסובכות, ציוד מיוחד. אולם, כל הפרוצדורות צריך להתבצע בתנאים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן היפוכלוריט	סיגמא	CAS: 7681-52-9	10-15%  כלור פעיל
Luria-Bertani (LB) מרק
incubater	ניו ברונסוויק Scientific	Innova 4000
ספקטרופוטומטר	Thermo Fisher Scientific	Genesys 20
חרוזי זכוכית חנקן
	Sigma	G8893	0.5 µ
צינור m 2.0 מ"ל עם מכסה			ללא RNase
1.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל צינור			ללא RNase
הומוגנייזר טחנת חרוזים	BioSpec	607
צנטריפוגה	Mini_beadbeater Eppendorf	5430
דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)	סיגמה	CAS: 1609-47-8
נתרן דודציל סולפט (SDS)	סיגמא	CAS: 151-21-3	תמיסה של 10% שהוכנה עם מי MQ שטופלו על ידי DEPC
בופר			10 מ"מ Tris-HCl; 1 מ"מ EDTA, pH = 8
פנול	סיגמא		בדרגת RNA
			הכן 24:1 של כלורופורם: אלכוהול איזואמיל, אחסן בטמפרטורת החדר
ערכת בידוד RNA טהורה גבוהה	Roche	11828665001
RNase Decure Solution	Invitrogen	AM9780	RNase-Zap
מכשיר אלקטרופורזה אוטומטי	Agilent	2100	Bioanalyzer
ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח	Thermo Fisher Scientific	RNA Nanodrop ND-1000
	ערכת ננו RNA 6000 Agilent
מעכב RNase	תרמו פישר מדעי	RiboLock
ספריית RNA כיוונית ערכת הכנה	NEB	Ultra	עבור Illumina

נוזלי בורג אפנדורף TE אלכוהול כלורופורם-איזואמיל ערכת ניתוח איכות