מאמר שיטה

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

DOI:

10.3791/57615

⸱

15 ביולי 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום במהלך רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים עדיין בעיה גדולה. כאן, אנו מראים שיטה רצף הגנום של דובוני מים מן להצטננות עם עמוד 50 קטנה כמו של ה-DNA גנומי ללא הגברה הגנום כולו כדי למזער את הסיכון של זיהום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tardigrades הם בעלי חיים מיקרוסקופיים להיכנס למצב של ametabolic נקרא anhydrobiosis מול לייבוש והוא יכול להחזיר למצב המקורי שלהם כשהם מסופקים המים. רצף גנומית של בעלי חיים מיקרוסקופיים כמו tardigrades סיכוני זיהום חיידקי שמוביל לפעמים פירושים מוטעים, לדוגמה, בנוגע להיקף של העברה גנטית אופקית בבעלי חיים אלה. כאן, אנו מספקים שיטת קלט ultralow את רצף הגנום של דובוני מים, Hypsibius dujardini, מן להצטננות. על ידי שימוש קפדני הדרה כביסה ולא מזהם יחד עם ניסיון חילוץ יעיל שנות ה-50 ~ 200 pg DNA גנומי של אדם יחיד, ואנחנו נבנה ספריה רציף עם כלי עריכה ברצף ה-DNA. ספריות אלה היו מוטים הדירים מאוד, ניתוח אינפורמטיקה הקריאות ברצף עם הגנום dujardini ה אחרים הראו כמות מזערית של זיהום. בשיטה זו ניתן ליישם tardigrades unculturable זה יכול לא להיות רציף בשיטות קודמות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tardigrades הם בעלי חיים מיקרוסקופיים יכולים להזין את מצב ametabolic הנקרא anhydrobiosis מול לייבוש. הם לשחזר על-ידי ספיגת מים1,2. במצב ametabolic, tardigrades מסוגלים לנקוט בסביבות קיצוניות שונות, הכוללות טמפרטורות קיצוניות3 ו לחצים4,5, מינון גבוה של אור אולטרה סגול6, צילומי רנטגן, קרני גמא 7 , 8, חלל היקום9. נתונים גנומית היא יסוד חיוני לצורך המחקר של המנגנונים המולקולריים של anhydrobiosis.

נסיונות קודמים רצף הגנום של tardigrades הראו סימנים של זיהום בקטריאלי10,11,12,13,14. רצף גנטי של אורגניזמים קטנים כזה דורש מספר רב של בעלי חיים, והוא נוטה זיהום בקטריאלי; לכן, קודם לכן הקמנו פרוטוקול רצף באמצעות שיטת קלט ultralow החל להצטננות דובוני מים, כדי למזער את הסיכון מציג15. באמצעות נתונים אלו, יש נוספת ערכנו למיין שוב באיכות גבוהה ועל ההרכבה מחדש של הגנום של16, dujardini ה17. כאן נתאר בפירוט שיטה זו עבור רצף גנטי של אדם יחיד tardigrade (איור 1). האימות של שיטה זו הוא מעבר המוקד של המאמר, כבר המורכב בהרחבה בדוח הקודם שלנו16.

שיטה זו מורכבת משני חלקים: בידודו של דובוני מים יחיד עם הכי נמוך שאפשר זיהום, החילוץ באיכות גבוהה של pictogram רמות ה-DNA. דובוני מים מורעבים, לשטוף ביסודיות עם מים, כמו גם אנטיביוטיקה, שנצפו תחת מיקרוסקופ עם 500 X הגדלה כדי להבטיח סילוק כל זיהום חיידקי. הערכות קודמות ומדידות מראים כי אדם יחיד של דובוני מים מכיל כ- 50-200 pg גנומית דנ א16, אשר מופק על ידי פיצוח שלד חיצוני כיטין מחזורים ההקפאה-הפשרה או על ידי המגון ידנית. את הדנ א הגנומי נאספו ספריית לבנייה, וסודרו על מכשיר רצף ה-DNA. ניתוח נוסף אינפורמטיקה מציג רצף באיכות גבוהה, כמו גם רמות נמוכות של זיהום לעומת פרוייקטים רצף tardigrade קודמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה

  1. להכין 2% agarose ג'ל באמצעות מים מזוקקים (DW) כמו הממס מאכל תרבות הפלסטיק 90 מ מ, ו 10 מ ל 1% פניצילין/סטרפטומיצין קוקטייל עם DW. ניתן לאחסן את הג'ל במשך 2-3 שבועות באינקובטור להגדיר ב- 18 מעלות צלזיוס.
    הערה: להימנע מכל אחסון של הג'ל מתחת ל 10 ° C, כי הטמפרטורה הנמוכה יכווץ את הג'ל agarose, וכתוצאה מכך פער זעיר בין הג'ל לבין הקיר מאכל תרבות שבה יכול לבצע עליו את tardigrades.

2. לטעום הכנה להדרה מזהם

  1. אוספים של דובוני מים יחיד, להניחה על הצלחת אגר מוכן, לשטוף אותה 2 x - x 3 עם DW כדי להסיר את כל החלקיקים שנותרו.
  2. דגירה של דובוני מים ב 18-22 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה כדי להסיר את כל עודפי מזון מהמעיים.
  3. מקם את דובוני מים מורעבים האנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין עבור 2-6 h להסיר את כל חיידקי זיהום ומניחים את החיה decontaminated על כוס נקי שקופיות באמצעות פיפטה של P10.
  4. לצפות את דובוני מים תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 500 ואשר שקיימים אין חיידקים שנותרו.
    הערה: ההגדלה גבוה עם stereomicroscope האופטימלית, אך במיקרוסקופ אופטי ניתן להשתמש לחלופין ללא החלת coverslip.
  5. לאסוף את הפרט באמצעות פיפטה P10 עם מספר מרבי של 5 µL של נוזל, למקם אותו לתוך צינור תגובת שרשרת (PCR) נמוך מחייב פולימראז והסר כמו נוזל עודף הרבה ככל האפשר.
    הערה: microtubes, המבחנות ועצות פיפטה צריכים להיות קשירה נמוכה כדי למזער האובדן של ה-DNA.
    הערה: התנהגות המגון בהקדם האפשרי, עבור לייבוש מהיר או למות בעל החיים באופן משמעותי עלול לגרום נזק הדנ א הגנומי.

3. המגון והפקת דנ א

  1. Homogenize החיה כדי להשיג את הדנ א הגנומי (gDNA) באחת מהשיטות הבאות.
    הערה: חיוני כדי להשתמש בערכה שצוין שמוצג בטבלה של חומרים בשלבים מיצוי DNA הבאים, קיטים אחרים (או עמודה, חרוז מבוסס) הם לא יעיל זה קלט נמוך ביותר. המאגר פירוק גנומית סופק עם 0.5% בטא-mercaptoethanol לפני השימוש.
    1. Homogenize החיה עם מחזורים ההקפאה-הפשרה18.
      1. מיד לאחר שלב 2.5, להוסיף 100 µL מאגר פירוק הצינור PCR המכיל את דובוני מים.
      2. הכנס את הצינור PCR חנקן נוזלי למשך 10 דקות, 10 דקות, להזיז את גוש חום התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה, 2 x.
        הערה: שלב זה יכול לחזור כאשר המגון אינה מספיקה או יכול להתבצע לאחר ריסוק ידני.
    2. באופן ידני לרסק את החיה.
      1. מיד לאחר שלב 2.5, תחת stereomicroscope, לרסק את הפרט עם קצה P10 פיפטה על ידי לחיצה על החיה הקיר צינור PCR, מיד להוסיף 100 µL פירוק המאגר.
        הערה: חיוני לקיים הליך זה תחת stereomicroscope, כי דובוני מים יכול בקלות לחמוק, ריסוק לא יעיל יביא כשל כדי לחלץ gDNA. ודא כי הקוטיקולה tardigrade הוא שבור, כך המאגר פירוק יכול לחדור את האורגניזם.
  2. דגירה הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במשך פירוק להתרחש.
    הערה: נדרש מינימום של 30 דקות פירוק יעיל, אך הדגירה יכולות להיות ארוכות יותר.
  3. העבר את העוצמה המלאה (100 µL) של תערובת פירוק microtube נמוך מחייב נקי 1.5-mL.
  4. להוסיף 100 µL מאגר פירוק הצינור PCR נמוך מחייב כי שימשו את המגון עכשיו ריקה, לאחר pipetting את התערובת, להעביר אותו microtube 1.5-mL נמוך מחייב שימוש בשלב 3.3. חזור על שלב זה, 2 x.
  5. כמו צעד 3.4, להוסיף 300 µL מאגר פירוק הצינור PCR מחייב נמוך, לאחר pipetting, להעביר את הבלילה לתבנית microtube נמוך מחייב 1.5-mL. Microtube נמוך מחייב 1.5-mL צריך להכיל 600 µL של התערובת לאחר שלב זה.
    הערה: השלבים הבאים הם כדי למזער האובדן של gDNA כבול לקיר צינור PCR, נטילת הדגימה מספר פעמים.
  6. הוסף את סך של 600 µL של פירוק תערובת לעמודה ספין הניח צינור אוסף ' centrifuge זה ב 10,000 x g עבור 1 דקות.
  7. החל מחדש את הזרימה אל העמודה, centrifuge זה ב 10,000 x g עבור 1 דקות.
    הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי רוב gDNA מאוגדת לעמודה.
  8. להוסיף 500 µL מאגר שטיפת העמודה ספין, centrifuge זה ב 10,000 g x עבור 1 הגבלת העברת העמודה ספין כדי microtube נקי 1.5-mL.
  9. החל µL 20 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.5, העמודה ספין, להמתין 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר centrifuge זה ב 10,000 g x עבור 1 דקות.
    הערה: המאגר • תנאי אינו יכול להכיל EDTA, כי זה מפריע האנזימים הכנה הספרייה.
  10. החל מחדש את הזרימה דרך העמודה ספין, ואחרי 5 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, centrifuge זה עבור 1 דקות ב- 10,000 x g.
    הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח את • תנאי מקסימלי של gDNA מאוגד לעמודה.

4. ספריית בניית רצף

  1. פיצול דנ א
    1. להעביר 15 µL של eluant gDNA microtube 15-µL עבור ה-DNA פיצול, centrifuge את צינור 1 דקות באמצעות microcentrifuge על השולחן.
      הערה: microtube שצוין שמוצג בטבלה של חומרים הוא אופטימלי עבור קלט נמוכה. הפיצול עם sonication בנפח נמוך הוא קריטי, זה לא ניתן להחליף עם פיצול אנזימטי בשל הריכוז הנמוך ביותר של ה-DNA.
    2. קטע של gDNA ל 550 bp.
      הערה: ההגדרות bp 550 השתמשנו הן כדלקמן: שיא האירוע כוח = 30 W, פקטור חובה = 20%, מחזורים לכל פרץ = 50, זמן טיפול = 23 s.
    3. לאחר pipetting יסודי, להעביר µL 10 של תערובת DNA מפוצלים צינור נקי נמוך-איגוד ה-PCR.
      הערה: הניסוי ניתן לעצור כאן. לשמר את ה-DNA 4 ° C או-20 ° C.
  2. רצף בניית הספרייה
    הערה: זה הוא קריטי כדי להשתמש בערכה שצוינו בטבלה של חומרים בהליכים הבאים, בגלל הכמות הנמוכה של DNA קלט.
    1. להוסיף 2 µL של המאגר הכנת תבנית ו µL 1 של האנזים הכנת תבנית ומערבבים אותם ביסודיות עם פיפטה.
    2. לבצע את התגובה הכנת תבנית הצנטרפוגה תרמי עם התנאים הבאים: 22 מעלות במשך 25 דקות, 55 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, החזק 4 ° C, מכסה מחוממת ב 101-105 ° C. עם סיום התגובה, המשך לשלב הבא.
    3. להוסיף 1 µL של המאגר סינתזה ספריית µL 1 של האנזים סינתזה ספריית המוצר התגובה הכנת תבנית, דגירה התערובת ב 22 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות (עם אחיזה 4 ° C). עם סיום התגובה, המשך לשלב הבא.
    4. להוסיף 30 µL של ספריית הגברה מאסטר המיקס (25 µL של המאגר הגברה ספריית µL 1 של האנזים הגברה ספריה, 4 µL של מים נטולי נוקלאז) ו µL 5 מהתרכובת יצירת אינדקס.
    5. לערבב הכל היטב עם פיפטה, centrifuge את התערובת בקצרה עם צנטריפוגה שולחן.
    6. ביצוע של PCR עם התנאים המוצגים בטבלה 1.
טמפרטורהזמןמחזורים
72 הלעפה תרוטרפמט3 דקות
85 הלעפה תרוטרפמט2 דקות
98 הלעפה תרוטרפמט2 דקות
98 הלעפה תרוטרפמט20 שניות4 מחזורים
67 הלעפה תרוטרפמט20 שניות
72 הלעפה תרוטרפמט40 שניות
98 הלעפה תרוטרפמט20 שניותמחזורים 16
72 הלעפה תרוטרפמט50 שניות
4 הלעפה תרוטרפמט. תחזיק

טבלה 1: תנאי ה-PCR.

  1. טיהור של מוצרי ה-PCR
    הערה: שלב זה ניתן יהיה להחליף עם שיטות טיהור אחרות. אם שיטה חלופית, הקפד לבדוק טוהר DNA שנוצר באמצעות ספקטרופוטומטרים. ספיגת יחס של 260/280, 260/230 שנינו חייבים להיות מעל 1.8.
    1. להוסיף 50 µL של beads מגנטי, pipette הפתרון 10 x, ו- centrifuge זה בקצרה עם microcentrifuge השולחן.
    2. דגירה הפתרון למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. דגירה אותו על דוכן מגנטי במשך 5 דקות או עד הפתרון הופך לגמרי ברור, ולהסיר את תגובת שיקוע.
    4. להוסיף 200 µL הטרי 80% אתנול הצינור PCR נמוך מחייב על דוכן מגנט, לחכות 30 s, ולהסיר תגובת שיקוע. חזור על שלב זה, 2 x. נא לא להפריע את החרוזים.
    5. בקצרה centrifuge הצינור PCR נמוך מחייב עם צנטריפוגה שולחן ולהסיר כל אתנול עודף על הדוכן מגנטי. מילה נהדרת החרוזים אבל להימנע overdrying.
    6. Resuspend את החרוזים עם 15 µL 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.5 ביסודיות pipette את הפתרון כך החרוזים מגנטי homogeneously מופצים, דגירה הצינור למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ואחרי צנטריפוגה קצרה, דגירה אותו על דוכן מגנטי עבור 2 דקות עד הפתרון ברור.
      הערה: המאגר • תנאי צריך מכילה EDTA, כי זה מפריע הכימיה רצף.
    7. להעביר את תגובת שיקוע, מבלי להפריע בגדר, אל צינור נמוך-איגוד ה-PCR.
      הערה: הניסוי ניתן לעצור כאן. לשמר את ה-DNA ב 4 º C או ב-20 ° C עבור אחסון ותיק.

5. איכות הסימון כמת, רצף ה-DNA

הערה: בדיקת איכות לא מתבצע לפני שלב זה בגלל הכמות הנמוכה של ה-DNA.

  1. אימות של התפלגות גודל של ספריית דנ א
    הערה: מערכות אלקטרופורזה רגיש גבוהה עם דיווח דיגיטלי של התפלגות גודל ניתן להשתמש.
    1. להחזיר הכימית מאגר אלקטרופורזה, ג'ל מחסנית (25-1, 000 לחץ הדם בטווח) לטמפרטורת החדר.
    2. להוסיף 3 µL של ריאגנט מאגר אלקטרופורזה עם µL 1 של הספרייה רצף, ומערבבים היטב במשך 1 דקה עם מערבולת, בקצרה centrifuge אותם עם צנטריפוגה שולחן.
    3. התנהלות אלקטרופורזה ולאמת את התפלגות גודל הספרייה עם התוכנה המשויכים. הפסגה פרגמנט העיקרי צריך להיות באופן כללי ועד כ-300 1,000 bp.
  2. כימות דנ א
    הערה: שיטות מבוססות קרינה פלואורסצנטית או ה-PCR כמותי אחרים ניתן להשתמש גם, אבל ספקטרופוטומטר להימנע, כי זה לא מספיק מדויקת לכימות תנועת רצף ספריות.
    1. הוסף µL 796 פתרון מאגר µL 4 של ריאגנט פלורסנט ומערבבים אותם ביסודיות. לוותר על 190 µL של הפתרון עובד שני צינורות assay, µL 197 ל שפופרת assay אחת.
    2. הוסף 10 µL של סטנדרטים עם ריכוזים ידועים של ה-DNA כדי כל שפופרת assay המכיל µL 190 של הפתרון עובד µL 3 של הספריה מוכן כך הצינור assay המכיל µL 197 של הפתרון עובד.
    3. מערבולת הצינורות בקצרה, centrifuge אותם על צנטריפוגה שולחן. לכמת את הדנ א באמצעות fluorometer עם הגדרות 3-µL.
  3. רצף ספריית ה-DNA
    הערה: פלטפורמת רצף חייב להיות תואם עם ערכת בנייה הספריה שצוינה.
    1. הכינו את הספריה רצף בהתבסס על הפרוטוקול של היצרן.
    2. להגדיר את התא קלטות וזרימה של ריאגנט לתוך הכלי רצף והזן את הרצף לנהל מידע ע פ הפרוטוקול של היצרן.
    3. הפעל את הרצף.
      הערה: ביצענו שתי ריצות רצף: דוגמה אחת/הפעלה, כמו גם הארבעה מרובב בהפעלה אחת.

6. ניתוח חישובית

  1. בסיס-שיחה, אם נדרש, demultiplex את הקריאות.
  2. לאמת את איכות הנתונים רצף עם FastQC19.
    הערה: עבור אימות מעמיקה יותר של נתונים המתקבלים, ראה דו ח הקודם שלנו16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדרה מזהם:

פרוטוקול זה כרוך שטיפה של דובוני מים ועיקור בטיפול אנטיביוטיקה כדי למזער את הזיהום. זה כרוך גם תהליך בדיקה חזותית כדי להבטיח את שלמות התרגום של תהליכים אלה. תמונת מיקרוסקופ במהלך האימות (שלב 2.4 לפרוטוקול) מוצג באיור2. בעת שנצפה בהגדלה גדולה-X 500, ניתן לראות תאים חיידקיים חלקיקים קטנים מסביב את דובוני מים בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום חיידקי מהווה איום על רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים. בעוד מחקרים קודמים על רצף הגנום tardigrade סינון החוצה זיהום תוך שימוש נרחב אינפורמטיקה שיטות12,20, ריצפנו את הגנום של אדם יחיד כדי למזער את הסיכון של מציג. כיוון דובוני מים בודדים מכיל כ- 50-200 pg דנ א גנומי16 זה עטוף בשכבה עבה של שלד כיטין, הכללת מזהמים והפקת DNA באיכות גבוהה הן נקודות קריטיות של פרוטוקול זה. תרבויות tardigrades הקיימים אינם aseptic, ולא אלה נאספו מ להוצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים Nozomi אייב, יוקי Takai ו- Nahoko אישיאי על שלהם תמיכה טכנית ב רצף גנטי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הסיוע עבור החברה יפן עבור עמית מחקר של קידום המדע (JSPS), מענק הסיוע KAKENHI למדענים צעירים (No.22681029), KAKENHI מענק הסיוע עבור מדעי למחקר (B), מספר 17 H 03620 JSPS, על ידי גרנט עבור פרויקטים מחקריים מדע בסיסי מן הקרן Sumitomo (No.140340), באופן חלקי על ידי קרנות מחקר ממשלת המחזו איוו ג'ימה, העיר Tsuruoka, יפן. כלורלה דלקתית נהגה לתת את tardigrades סופק באדיבות כלורלה תעשיית ושות' בע מ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ SZ61OLYMPUS
BactoAgarDifco Laboratories214010
פניצילין סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Gibco על ידי טכנולוגיות חיים15140-148
VHX-5000 מערכתKeyence
0.2 מ"ל צינור ציפוי סיליקוןביו מדע רפואיBC-bmb20200
Quick-DNA ערכת מיקרו-פרפZYMO ResearchD3021השימוש בערכה זו הוא קריטי לחלוטין; ראה שלב 3.1
1.5 מ"ל מיקרו-צינוריתגריינר ביו-וואן616-201ראה 4.1.1
מיקרו צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוההTOMYMX-307
Covaris M220Covaris Inc.
ערכת ThruPLEX DNA-SeqRubicon GenomicsCAT. מס' R400406השימוש בערכה זו הוא קריטי לחלוטין; ראה שלב 4.2
ThermalCycler Bioer TechnologyTC-96GHbC
AMPure מגיב XPBECKMAN COULTER Life ScienceA63881
אתנולWako054-027335
EB bufferQIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA 
D1000 ריאגנטיםAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/ReagentThermoFisher ScientificQ32850
Cubee מיני צנטריפוגהRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3Illumina Inc.MS-102-3003
MiSeq SequencerIllumina Inc.SY-410-1003
4482277

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
  4. Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575(2016).
  5. Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
  6. Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793(2013).
  7. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
  8. May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
  9. Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
  10. Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
  11. Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839(2016).
  12. Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
  13. Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
  14. Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
  15. Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057(2016).
  16. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063(2016).
  17. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266(2017).
  18. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47(2011).
  19. Andrews, S. FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  20. Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808(2016).
  21. Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
  24. Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNATardigradeDNADNA

מאמרים קשורים