בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

Summary

כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.

Abstract

בהקשרים ביולוגיים רבים, תאים בעלי חיים צריך אינטראקציה פיזית עם הסביבה שלהם על ידי פיתוח כוחות מכני. בין אלה, כוחות המתיחה היה מאופיין היטב, אך יש חוסר של טכניקות המאפשר מדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים orthogonally המצע שלהם. תיכננו התקנה ניסיוני. למדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים חסיד על המצע שלהם. תאי ציפוי על גליון Formvar תואם לעוות את המצע, הטופוגרפיה וכתוצאה מכך ממופה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) את המשקל ננומטר. כוח ערכים המחולצים ואז ניתוח של הפרופיל דפורמציה בהתבסס על הגיאומטריה של המבנים התאיים protrusive. לפיכך, ניתן למדוד את הכוחות שהופעל על ידי היחידות בולט בודדים של תא חי לאורך זמן. טכניקה זו תאפשר המחקר של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה. כאן, אנו מתארים את היישום שלה כדי למדוד את הכוחות protrusive שנוצר על ידי podosomes הנוצרת על-ידי מקרופאגים אנושי.

Introduction

תאים בעלי חיים אינטראקציה פיזית עם המטריקס, התאים האחרים המהווים את הסביבה שלהם¹. פעולה זו נדרשת כדי להעביר, להפנים גופות, לרכוש מידע חיצוני או להבדיל. בתהליכי כזה, התא צריך להקרין כוחות מכני ומשפיע, כמו מחקרים רבים הראו בשנים האחרונות, היכולת של תא כדי ליצור כוחות, לחקור את הסביבה שלה התנהגות ביולוגית, בימוי למשל התפשטות או בידול^2,3. בתורו, המדידה של כוחות הסלולר היא מכשיר מרכזי לימוד ויסות כוח הדור ולהבין את המשמעות שלה תא התנהגות ורקמות גורל^4,5.

בשנים האחרונות עדים על התפתחות טכניקות רבות כדי למדוד את הכוחות תא יכול להפעיל על הסביבה שלה⁶. רוב אלה סייעו חושפים שהמתיחה כוחות כי תאים להפעיל כפי שהם מושכים על הגששים ניידים או מצע deformable. עם זאת, הכוחות מכניים מעורבים בליטה לסביבת חוץ-תאית סובלים מחסור של טכניקות מדידה והם עד היום לא טוב מאופיין.

כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מציגים שיטה למדידת כוחות המופעל orthogonally אל המצע. זה מורכב ב ציפוי חיים תאים בגיליון אלסטי דק אשר ניתן לעוות בכיוון אורתוגונלית, דבר המאפשר למדוד דפורמציה המצע על ידי התאים ולהסיק את הכוחות המעורבים. המצע הטופוגרפיה נמדד עם רזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הערכת כוחות של דפורמציה מסתמך על הידע של הגיאומטריה של מבנים הסלולר protrusive^{7,8, 9}.

כאן, אנו מתארים את הכיוונון ויישומה למדידת הכוחות שנוצר על ידי podosomes, מבנים אדהזיה protrusive הנוצרת על-ידי מקרופאגים להעברת mesenchymal שלהם סביבות תלת-ממדי^{10,11, 12,13,14,15,16,17}. אנו מאמינים כי טכניקה זו תקדם את ההבנה של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה.

Protocol

1. הכנת רשתות מצופים Formvar

1. מיקרוסקופ אלקטרונים רשתות עם אצטון טהור ונקי ומניחים אותם על נייר סינון. לאחר מכן נקיים שקופית מיקרוסקופ עם אתנול טהור, לנגב עם נייר עדשה, להסיר את האבק עם מפוח.
2. מקום של שקופיות זכוכית ניקיתי אתנול אנכית המשפך של מכשיר הליהוק סרט המכיל פתרון של Formvar בחלק התחתון. לכסות את החלק העליון של המשפך.
3. משאבת 100 מ של Formvar פתרון (0.5% באתילן dichloride) עם הנורה atomizer ב עד רמת מגיע שני שלישים של השקופית.
4. לשמור את השקופית הפתרון עבור 1 דקות.
5. . פתח את הברז של המכשיר כדי לנקז את הפתרון Formvar ב זרם קבוע קצב זרימה של 10 עד 15 מ ל/s תניב סרט Formvar של 30-80 ננומטר. העובי של הסרט נקבעת על ידי הריכוז של הפתרון Formvar על ידי קצב ניקוז.
   הערה: קצב ניקוז יכול להיות נשלט על-ידי איוור את הלחץ באמצעות שסתום האוויר החוצה על-ידי לאט פתיחת המסתם. מהר יותר הניקוז, עבה הסרט. בפועל, כי זה קשה לחזות את עובי הסרט לפי קצב זרימה Formvar, אנו להכין מספר אצוות של סרטים Formvar ולשלוט עובי שלהם על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (ראה שלב 2).
6. הסר את השקופית מן החדר, לייבש אותו בעדינות על נייר סינון כדי להסיר את כל Formvar נוזלי.
7. גוזרים מלבן 20 מ"מ x 50 מ"מ מהסרט Formvar עם סכין גילוח.
8. מילוי גביע עם מים מזוקקים נקיים, לאט מזנקת השקופית אנכית אל המים לעוף. הסרט: הסרט אמור לצוף על פני המים.
9. מקום יבש ניקיתי אצטון רשתות על הסרט, מבריק פונות למעלה.
10. המקום של coverslip זכוכית עגול (Ø 12 מ מ) על כמה מן הרשתות. Coverslip זה ישמש כדי למדוד את עובי הסרט (ראה שלב 2).
11. מכסים שקופית מיקרוסקופ עם מדבקה לבנה, גודלה משתנה כך שיתאים. טובלים את השקופית אנכית על הגבול של הסרט Formvar צף עד כל הסרט לאנאפוליס השקופית. להסיר את המים העודפים השקופית עם נייר סינון ולתת לזה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

2. מדידת עובי הסרט

1. חותכים את Formvar סביב coverslip עם פינצטה כדי לנתק את זה מתוך השקופית.
2. סמן את המיקום של הרשת תחת coverslip עם עט.
3. חותכים את Formvar מרחבי הרשת מסומן כדי לנתק אותו מן coverslip. לכן יהיה חור בגליון Formvar הנותרים, שיאפשר למדוד את עובי הסרט. לכסות את coverslip עם PBS והנח אותו על משטח זכוכית על המיקרוסקופ.
4. הר של זיז ניטריד סיליקון על הבלוק זכוכית מיקרוסקופ כוח אטומי, מוודא שהפס הזהב אינו מכוסה על-ידי הקצה של האביב.
   הערה: הרגישות ואת קבוע הקפיץ הזיז צריך לקבל קודם לכן היה מכויל ב- PBS.
5. לטעון את גוש זכוכית על גבי המודול AFM ולאחר מכן הצב את המודול לתוך המיקרוסקופ.
6. מניחים את coverslip מצופים Formvar על תא תצפית, לכסות את זה עם µL 500 ל- PBS.
7. סרוק את הגבול של החור בגליון Formvar באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ב מצב הקשר ונקודת ערכת כוח 0.5 nN.
8. פני השטח coverslip זכוכית כהפניה למדידות גובה ושימוש להעריך את עובי Formvar כמו הגובה של חתך הרוחב (לבצע מדידות לפחות 10 לכל Formvar אצווה).

3. זריעת תאי על רשתות

1. ברדס סטרילי, לשים רצועה (12 מ"מ x 3 מ"מ) של דבק דו צדדי coverslip.
2. לגזור רשת מצופה Formvar עם פינצטה ושים אותו הפוך על רצועת דבק (רק השפה של הרשת צריך לצרף את הקלטת). הסרט Formvar צריך להתמודד עם coverslip.
3. לשים התקן זה תרבות היטב.
4. המקום droplet 10 µL של RPMI ללא FCS המכיל 10⁴ מקרופאגים תריז ומונוציטים האנושי¹⁶.
   הערה: הקפד לא לגעת הרשת עם הטיפ פיפטה כדי למנוע פגיעה הציפוי Formvar.
5. תקופת דגירה של 30 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) לתת תאים ולהתבטא.
6. למלא את הבאר עם 2 מ של RPMI המכיל 10% FCS.
7. דגירה את המכשיר עבור 2 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ לתת תאים לדבוק לפני התצפית AFM.

4. טופוגרפיה מדידות של העיוותים הנוצרות על-ידי Podosome

1. תוקע שתי רצועות של דבק צדדית הוכפל על רצפת הזכוכית צלחת פטרי.
   הערה: המרחק בין שתי רצועות צריך להיות קטן יותר הקוטר רשת.
2. ניתוק בקפידה את רשת מצופה מקרופאגים מהקלטת דבק.
3. הפוך את הרשת על מנת לקבל את התאים מול הזכוכית ולהישאר ברשת בין שתי רצועות דבק.
4. תיקון הרשת עם שתי רצועות חדש דבק צדדית הוכפל: הרשת ובכך להיות דחוקה בין שתי רצועות דביקות, עזיבת האזור המרכזי של הרשת להנגיש הטיפ AFM.
   הערה: ודא כי הרשת טוב קבוע, לא המעוות; אחרת הזיז AFM לא יוכל להתקרב השטח Formvar.
5. למלא את צלחת פטרי עם 2 מיליליטר מחומם מראש-37 ° C תרבות בינוני (RPMI עם 10% FCS) בתוספת 10 מ מ HEPES (pH 7.4).
6. במקום המנה תרבות על תנור מנה 37 º C.
7. להתקין את התנור מאכל על הבמה AFM.
8. . תן למערכת ייצוב ב 37 º C.
9. במצב קשר עם כוח 0.5 nN, להפוך תמונה הגלובלית הראשונה לאתר podosomes, ולאחר מכן סרוק את הטופוגרפיה Formvar-3 הרץ עם פיקסל nm-גדול כ-20.
   הערה: להימנע סריקה בקרבת קצות הרשת.

Results

הפרוטוקול הנ ל מתאר כיצד להכין את הגדרת הניסוי לכמת חדירת כוחות שהוחלו על-ידי macrophage podosomes על מצע Formvar. זו מושגת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מודגם באיור1.

בעת ניתוח תמונת הטופוגרפי של גבשושיות וזיזים מתחת podosomes שימוש בתוכנת עיבוד נתונים JPK, פולינום מדרגה שלישית מתאים צריך להיות מופחתים מכל שורה הסריקה באופן עצמאי. הגובה המרבי של podosome-induced בליטות יכול להיות מוערך על ידי הוספת ...

Discussion

תכונות החומר

הבחירה של החומר עבור ממברנה deformable, במקרה שלנו Formvar, צריך למלא כמה דרישות. החומר חייב להיות שקוף האור הנראה ולהציג קרינה פלואורסצנטית אוטומטי מוגבלת כדי לאפשר תצפיות בשדה בהירים ואת פלורסצנטיות מיקרוסקופ. המראה המחוספס של הסרט דק חייב להיות מתחת 10 ננומטר כדי להימנע הטופוגרפי השפעה על התא אדהזיה וכדי לאפשר תצפית ברורה של בליטות המושרה תא על-ידי הדמיה AFM. בסופו של דבר, הנוקשות של הקרום, אשר תלויה מודולוס של הצעירים, עובי החומר, צריך להיות גבוה מספיק כדי לגר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
רשתות ניקל 200 רשת	מיקרוסקופיה מדעי	G200-Ni
נייר סינון	סיגמא-אולדריץ'	1001-055
מיקרוסקופ שקופיות	פישר סיינטיפיק	10235612
מדבקות לבנות 26 x 70 מ"מ	Avery	DP033-100
מכשיר יציקת סרט עם שסתום ביציאה שלו	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי	71305-01
סכיני גילוח	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית	72000
אתנול	VWR	1.08543.0250
אצטון	VWR	20066.321
פורמבר 0.5% תמיסה באתילן דיכלוריד	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית	15820
12 מ"מ כיסויים	VWR	631-0666
מיקרוסקופ הפוך	Carl Zeiss	Axiovert 200
מיקרוסקופ כוח אטומי	JPK Instruments	NanoWizard III
מחזיק דגימה מבוקרת טמפרטורה	של JPK Instruments	BioCell
עם קבוע קפיץ נומינלי של 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
סרט דבק דו צדדי	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
צלחות פטרי 35 מ"מ עם תחתית זכוכית	WPI	FD35-100