מאמר שיטה

יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1+ אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה

5.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57641

⸱

27 במרץ 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחין בתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) לתוך הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) תאים עבור הדור של שושלות הלבלב בהתבסס על הגידול חד שכבתי ללא-המושבה סוג של חלופה מועדפת תאים בודדים. שיטה זו מתאימה בהפקת הומוגנית נגזר hPSC תאים, מניפולציה גנטית וסינון.

תקציר

תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר בתאי הלבלב הם מקור תא מבטיח עבור רפואה רגנרטיבית ופלטפורמה ללמוד תהליכים פיתוחיים אנושי. Stepwise ביים בידול זה recapitulates תהליכים פיתוחיים היא אחת הדרכים הגדולות ביותר ליצירת תאי הלבלב כולל הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) ובתאים הלבלב. פרוטוקולים קונבנציונאלי ליזום את הבידול עם מושבות קטנות זמן קצר לאחר המעבר. עם זאת, במצב של מושבות או אגרגטים, התאים הם נוטים heterogeneities, אשר ייתכן ה"בלתי הבידול כדי PDX1+ תאים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להתמיין hPSCs PDX1+ תאים. הפרוטוקול כוללת ארבעה שלבים ויוזמת את הבידול על ידי תאים בודדים הפומבית זריעה. אינדוקציה של SOX17+ תאים האנדודרם סופית בעקבות הביטוי של סמנים צינור שני הבטן פרימיטיבית, HNF1β, HNF4α, בידול בסופו של דבר לתוך PDX1+ תאים. בפרוטוקול הנוכחי מספק טיפול קל, עשוי לשפר ולייצב את היעילות בידול של כמה שורות hPSC שנמצאו בעבר להבדיל באופן לא יעיל שושלות endodermal או PDX1+ תאים.

מבוא

הלבלב מורכבת בעיקר תאים האנדוקרינית אקסוקרינית, תפקוד לקוי או עומס יתר שלה גורם מספר מחלות, כמו לבלב, סוכרת וסרטן הלבלב. התירי את pathogeny של pancreatopathy, יש צורך לנתח את תהליך התפתחותי והתפקוד של תאים בלבלב. בנוסף, היצע תא יציב עם איכות נדרש להקים תא/רקמות תוספת של טיפול. תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר בתאי הלבלב הם מקור תא מבטיח למטרות אלו, פרוטוקול בידול כלפי בתאי הלבלב כבר למד באופן אינטנסיבי1,2,3, 4. התפתחויות אחרונות הדור במבחנה של תאי β בלבלב לחקות את הדור של תאי β אדם מבוגר, תאים אלה הצג יעילות טיפולית על ההשתלה לתוך מודל סוכרתית-עכברים-2,-3. בנוסף, ניתוח הנתונים של תאי β שנוצר בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) של בריאה, תורמים לחולה סוכרת סוג 1 גילה אין הבדלים תפקודיים כולל כאשר תחת מתח5. יתר על כן, המחלה פנוטיפים כבר חלקית שפירטתי ב המושרה בתאי הלבלב עם המטופל, נגזר iPSCs או hPSCs מחסה מוטציות גנטיות באותו אתר כמו המטופלים6,7.

לייצר תאי הלבלב hPSCs, משמש stepwise התמיינות מכוונת את recapitulates תהליכים התפתחותיים. הלבלב נגזרת לשכבת האנדודרם של העובר מוקדם, המבטאת סקס קביעת אזור Y-box 17 (SOX17) ו- forkhead תיבת A2 (FOXA2)8. על סמך המחקרים העכבר, השכבה endodermal טפסים ברכבת התחתית בטן פרימיטיבי, אשר מסומנת על ידי הביטוי של hepatocyte גרעיני גורם 1-בטא (Hnf1β) ו- 4 גרעיני גורם hepatocyte-alpha (Hnf4α). הצינור בטן פרימיטיביים מאריך ומפתחת לתוך מערכת הנשימה, מערכת העיכול, איברים. לאחר התארכות, האזור האחורי במעי הקדמי הופך האזור הלבלב הרב, שעורר, לפי המסומן על-ידי הביטוי של החלבון פקטור תעתיק הלבלב/תריסריון גנים homeobox 1 (PDX1)8,9,10. החלקים הגבי ו הגחון של PDX1+ בטן צינור לעבות את הטופס ניצנים הלבלב, אשר מסומנים על-ידי הביטוי שיתוף של הלבלב שעתוק מקדם 1 יחידה משנית אלפא (PTF1A), NK6 גנים homeobox (NKX6.1) 18,11. ביטוי זה מסמן את תחילת מורפולוגיים organogenesis הלבלב. תאי הלבלב האנדודרם, שהם מרכיבים של בלוטות הלבלב, יוצרים רשת צינורי מסועף של מבנים אפיתל12 , להבדיל בסופו של דבר לתוך תאים האנדוקרינית אקסוקרינית, לרבות תאי-β הורמון האינסולין, α מפריש גלוקגון-תאים. הביטוי של PDX1 הוא זוהה לראשונה אצל הרב, שעורר באזור הלבלב, אשר נצפית ואז במהלך פיתוח הלבלב כולו ומראה לוקליזציה β-אלפא-תאים ו9,13,14. למרות Pdx1+ אזור תא המבטאים לא Ptf1a או Nkx6.1 מבדילה את antrum קיבה, תריסריון, צינור המרה extrahepatic ואת מספר תאים מעיים באמצע לשלב מאוחר של התפתחות אצל עכברים9, PDX1+ תאים נחשבים המוצא לאגס התרבותי הלבלב בשלב התפתחותי מוקדם אצל בני אדם.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להתמיין hPSCs PDX1+ תאים לדור של שושלות הלבלב. הבידול יוזם פרוטוקול על ידי זריעה הפומבית תאים בודדים15,16,17. באופן כללי, hPSCs מובחן מתוחזקים מושבות או אגרגטים תא השעיה או אדהזיה. כתוצאה מכך, ברוב הפרוטוקולים ליזום את הבידול זמן קצר לאחר passaging. עם זאת, במצב של מושבות או אגרגטים, התאים הם נוטים המרחבי, תעתיק heterogeneities18,19,20,21,22, אשר ייתכן ה"בלתי בידול צעד לקראת סופי האנדודרם ואחריו בידול לא יעיל כדי PDX1+ תאים. בפרוטוקול הנוכחי עשוי להציע טיפול קל כדי לשפר ולייצב את היעילות בידול של כמה שורות hPSC שנמצאו בעבר להבדיל באופן לא יעיל שושלות endodermal, PDX1+ תאים23, 24 , 25.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים באמצעות hPSCs אושרו על ידי ועדת האתיקה של החוג לרפואה, בוגר ביה ס לרפואה, אוניברסיטת קיוטו.

1. הכנה של חומרים

הערה: להכין כל מדיה, ריאגנטים תרבית תאים בסביבה סטרילית. לחמם בסיס מדיה תרבות לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש. בינוני עבור בידול משמש בתוך 6-אייץ '-RT. פרטים של ריאגנטים מפורטים בטבלה שלחומרים.

  1. בידול (איור 1 א')
    1. שלב 1A בינוני: העברת RPMI 1640 בינוני לתוך צינור באמצעות פיפטה של. להוסיף את תוסף ללא סרום activin A, CHIR99021, Y-27632 ריכוז של 1 x, 100 ננוגרם למ"ל, 3 μM ו- 10 μM, בהתאמה.
    2. בשלב 1B בינוני: העברת RPMI 1640 בינוני לתוך צינור באמצעות פיפטה של. להוסיף סרום ללא תוספת, activin A ו- CHIR99021 כדי ריכוז של 1 x, 100 ננוגרם למ"ל, ≤1 μM, בהתאמה.
      הערה: הריכוז של CHIR99021 צריך להיות נמוך מ שלב 1A בינוני, ו תוספת אינה נחוצה, אבל זה מגדיל את המספר הסלולרי.
    3. שלב 2 בינוני: MEM שיפור העברת (iMEM) בינוני לתוך צינור באמצעות פיפטה של. להוסיף סרום ללא תוספת של גורם גדילה תקין (KGF) ריכוז של 0.5 x ו- 50 ng/mL, בהתאמה.
    4. שלב 3 בינוני: העברת בינוני iMEM לתוך צינור באמצעות פיפטה של. להוסיף סרום ללא תוספת, KGF, בשכל, 3-Keto-N-aminoethyl-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) וחומצה 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) על ידי פיפטה כדי ריכוזים של 0.5 x 50 ng/mL, 100 ננוגרם למ"ל, 0.5 μM ו- 10 ננומטר, בהתאמה.
  2. Cytometry זרימה (FCM)
    1. 1 x Permeabilization/שטיפת מאגר: להעביר מים לתוך צינור על ידי פיפטה. להוסיף מאגר Permeabilization/שטיפת באמצעות פיפטה ריכוז 1 x.
    2. FCM חסימת פתרון: להעביר 1 x Permeabilization/שטיפת מאגר לתוך צינור על ידי פיפטה. להוסיף סרום חמור על-ידי פיפטה ריכוז של 2% (vol/כרך).
  3. Immunostaining
    1. חסימת פתרון: של העברת Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים (DPBS) לתוך צינור מאת פיפטה. להוסיף סרום חמור ו- X טריטון באמצעות פיפטה ריכוזים של 5% (vol/כרך) ו- 0.4% (vol/כרך), בהתאמה.

2. hPSC בידול אחורי במעי הקדמי תאים/הלבלב אבות (PDX1+ תאים)

הערה: לנהל את כל ההליכים באמצעות טכניקות סטרילי. hPSCs מתוחזקים על 6-ובכן צלחות מצופה ע י חומר משטח סינתטי עבור hPSCs hPSC תחזוקה בינונית על פי היצרן הוראות17,26. כאשר תאים להגיע 50-80% confluency (שלב 0) להשתמש בהם עבור בידול.

  1. להכין קרום המרתף צלחות מצופים מטריצה.
    1. העברת 6 מ של RPMI 1640 (4 °C) לתוך צינור מקורר עד 4 °C על קרח. להוסיף 2 מ ג של מטריקס קרום המרתף (4 °C) עם מקורר-1 מ לפיפטה טיפים ולערבב היטב על ידי pipetting עדין כדי להפוך מטריצה קרום המרתף 0.33 מ"ג/מ"ל.
    2. להעביר 2 מ"ל של מטריקס קרום המרתף מדולל כל טוב של צלחות התרבות תאים 6-ובכן מאת פיפטה. מקם את הצלחות ב 37 ºC למשך 60-90 דקות בתוך אינקובטור. לאחר מכן, שמור את הצלחות ב RT עד לשימוש (במרחק של-3 שעות).
  2. זרע את hPSCs וליזום בידול מוחלט האנדודרם (שלב 1A).
    1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ"ל של חומצה ethylenediaminetetraacetic 0.5 מ מ (EDTA) (RT) לכל טוב באמצעות פיפטה לשטוף את hPSCs תרבותי לוחית 6-. טוב.
    2. האחות 0.5 מ מ EDTA ולהוסיף 2 מ ל 0.5 מ מ EDTA לכל טוב מאת פיפטה. דגירה הצלחות ב- 37 ºC למשך 5 דקות.
    3. האחות 0.5 מ מ EDTA ולהוסיף 1 מ"ל hPSC תחזוקה בינוני ב RT בתוספת 10 μM Y-27632 לכל היטב על ידי פיפטה. פיפטה בעדינות אך במהירות כדי לפוצץ תאים על הלוחות ו מביצועם גושית תאים לתוך תאים בודדים. לא בועה התליה תא במהלך pipetting.
    4. העברת התליה תא בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, המכיל 4 מיליליטר hPSC תחזוקה בינוני ב RT בתוספת 10 μM Y-27632. בעדינות pipette התליה תא.
    5. לספור את התא ההשעיה התא באמצעות ההליך אי-הכללה של הכתם Trypan Blue.
      1. ΜL מיקס 15 של הבולם תא, μL 15 של Trypan Blue בשפופרת.
      2. העברת μL 10 של ההשעיה תאים למהול Trypan Blue אל תא ספירת בשקופיות שכפל באמצעות פיפטה 10 μL.
      3. לספור את התא עם מונה הניתן תא אוטומטית מספר ולחשב את צפיפות התאים ההשעיה התא. הכדאיות בדרך כלל > 98%.
    6. Aliquot התליה תא בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ב- 1-1.5 x 106 תאים לכל טוב של 6-ובכן צלחות (1-1.5 x5 10 תאים/cm2).
    7. Centrifuge הצינור 50 מ ל- 200 x g ב- RT במשך 5 דקות.
    8. וארוקן את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של, resuspend את התאים עם 1 מ"ל של שלב 1A בינוני (RT) לכל טוב. בעדינות pipette התליה תא ולהוסיף עוד 1 מ"ל של שלב 1A בינוני (סה כ, 2 מ לכל טוב).
    9. האחות המטריקס קרום המרתף מדולל ב הבארות של הלוחות התרבות תאים בשלב 2.1.2 שהכין על פיפטה μL 1,000. המשך לשלב הבא מיד.
    10. בעדינות pipette התליה תא בשלב 2.2.8 שוב. מיד לאחר ערבוב, להעביר התליה תא (2 מ"ל) לתוך כל טוב של צלחת 6-. טוב. מכסים את הצלחת עם רדיד אלומיניום כדי להגן על הבסיס מפני אור. מקם את הצלחת על הספסל נקי ב RT למשך 10-15 דקות.
      הערה: אל תזיז את הצלחת לאחר זריעה.
    11. הנח בעדינות את הצלחת 37 °C, 5% CO2 מיכלים (האווירה humidified) ואת תרבות במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: אל תלחץ את הצלחת לאחר זריעה.
  3. זירוז הבידול לתוך סופית האנדודרם (בשלב 1B).
    1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבארות באמצעות פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
      הערה: להסרת תאים מתים טפט, לנער בעדינות את הצלחת לפני כל שאיפה.
    2. מחוק לגמרי את DPBS בשימוש על ידי פיפטה ולהוסיף 4 מיליליטר בשלב 1B בינוני (37 °C) לכל טוב. הנח בעדינות את הצלחת לתוך החממה 37 °C (humidified אווירה של 5% CO2) ואת תרבות במשך 48 שעות.
    3. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבאר מאת פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
      הערה: להסיר את התאים המתים טפט ע י ניעור עדין לפני כל שאיפה.
    4. מחוק לגמרי את DPBS בשימוש על ידי פיפטה ולהוסיף 4 מיליליטר בשלב 1B בינוני (37 °C) לכל טוב. הנח בעדינות את הצלחת לתוך החממה (37 °C, האווירה humidified של 5% CO2) ואת תרבות במשך 24 שעות ביממה.
  4. זירוז הבידול לתוך הצינור בטן פרימיטיבי (שלב 2).
    1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבאר מאת פיפטה.
      הערה: להסיר את התאים המתים טפט ע י ניעור עדין לפני כל שאיפה.
    2. מחוק לגמרי את DPBS בשימוש על ידי פיפטה ולהוסיף 4 מ של שלב 2 בינוני (37 °C) לכל טוב. מקם את הצלחת לתוך החממה (37 °C, האווירה humidified של 5% CO2) ואת תרבות במשך 4 ימים.
  5. זירוז הבידול לתוך PDX1+ תאים (שלב 3).
    1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבאר מאת פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
    2. מחוק לגמרי את DPBS בשימוש על ידי פיפטה ולהוסיף 4 מיליליטר בשלב 3 בינוני (37 °C) לכל טוב. מקם את הצלחת לתוך החממה (37 °C, האווירה humidified של 5% CO2) ואת תרבות במשך 3 ימים.
  6. זירוז הבידול לתאים האנדוקרינית הלבלב.
    1. מבצע NKX6.1+ התא אינדוקציה (שלב 4, 8 ימים) ואחריו האנדוקרינית התא אינדוקציה (שלב 5, 12 ימים) עם פרוטוקולים שתואר לעיל3,16,26. לאפיין ולאמת את הבידול האנדוקרינית תא על-ידי immunostaining וניתוח תגובת שרשרת (לרביעיית-PCR) פולימראז כמותיים שעתוק במהופך בזמן אמת.
      הערה: עיין Toyoda ואח16 ו- et al. קימורה26 לפרוצדורות מפורטות ניסיוני. עיין טבלה 1 לקבלת רצפי פריימר המשמש לניתוח לרביעיית-PCR.

3. לזרום Cytometry (FCM)

  1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ ל 0.5 מ מ EDTA הבאר מאת פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של 0.5 מ מ EDTA פעם אחת.
    הערה: לנער את הצלחת בעדינות כדי להסיר תאים מתים התאים חד שכבתי לפני כל שאיפה.
  2. כדי לבטל את התאים (כ 3-6 × 106 תאים לכל טוב), להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין המכילה 0.5 מ מ EDTA לכל טוב. דגירה הלוחות על 37 ºC למשך 5-10 דקות.
  3. פיפטה בעדינות אבל במהירות כדי מביצועם גושית תאים לתוך תאים בודדים. לא בועה התליה תא במהלך pipetting.
  4. הוסף 8-10 מ"ל של בסיס בינוני (RPMI 1640 או iMEM, RT) המכילה 0.5 x תוספת ללא סרום 10 μM Y-27632 לכל טוב ומערבבים התליה תא. העברת התליה תא לתוך שפופרת צנטרפוגה.
  5. Centrifuge את הצינור ב 300 x g ב- RT במשך 5 דקות.
  6. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 2 מ ל 0.5 מ מ EDTA (RT). בעדינות pipette התליה תא.
  7. Centrifuge את הצינור ב 300 x g ב- RT במשך 5 דקות.
  8. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 100 μL מאגר קיבעון, permeabilization לכל 106 תאים ברדס. בעדינות pipette התליה תא ברדס. שמור את הצינור ב RT למשך 30 דקות.
  9. Centrifuge את הצינור ב 400 x g ב- RT במשך 5 דקות.
  10. וארוקן את תגובת שיקוע ברדס, resuspend את התאים עם 500 μL FCM חסימת פתרון לכל 106 תאים. בעדינות pipette התליה תא. שמור את הצינור ב RT למשך 30 דקות.
  11. העברת μL 50 של התליה תא צינור (כ5 עונה 1 פרק 10 תאים). Centrifuge הצינור ב 400 x g ב- RT עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 100 μL של נוגדן ראשוני מדולל (ראה טבלה של חומרים) ב- FCM חסימת פתרון, דגירה על 4 °C עבור > 16 h.
  12. Centrifuge את הצינור x 400 g ב- RT 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 180 μL 1 x פרם/שטיפת מאגר.
  13. Centrifuge הצינור ב 400 x g ב- RT עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 100 μL של נוגדנים משניים מדולל (ראה טבלה של חומרים) ב- FCM חסימת פתרון. דגירה התאים ב RT עבור 60 דקות או ב 4 °C עבור > 16 קמ"ש עם הגנה מפני אור.
  14. Centrifuge את הצינור x 400 g ב- RT 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 180 μL 1 x פרם/שטיפת מאגר.
  15. Centrifuge הצינור ב- 400 x g ב- RT עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 180 μL של 2% נסיוב חמור ב- DPBS.
  16. לסנן את המתלים התא על ידי העברת-מ ל סביב צינור פוליסטירן התחתון עם תא מסננת (רשת ניילון מיקרומטר 35), לשמור על 4 °C עם הגנה של אור עד הניתוח.
  17. לנתח שיעור של תאים באופן חיובי מוכתם על ידי cytometer זרימה27.

4. Immunostaining

  1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבאר מאת פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
    הערה: לנער בעדינות את הצלחת להסרת תאים מתים התאים חד שכבתי לפני כל שאיפה.
  2. להוסיף 2 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) (4 °C) לכל טוב פיפטה ברדס. לשמור על הלוח 4 °C למשך 20 דקות.
  3. להסיר את כדורגלן בעזרת פיפטה ברדס. להוסיף 2 מ של DPBS ב RT לבאר באמצעות פיפטה ברדס. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
  4. להוסיף 2 מ"ל של חסימה פתרון לכל טוב ולהשאיר את הצלחת ב RT למשך 30 דקות.
  5. האחות הפתרון בשימוש ולהוסיף 1 מ"ל של נוגדן ראשוני (ראה טבלה של חומרים) בחסימה פתרון לכל טוב. דגירה ב RT עבור 60 דקות או ב 4 °C עבור > 16 h.
  6. האחות הפתרון בשימוש, להוסיף 2 מ של DPBS המכילה 0.4% טריטון X-100 דגירה -RT במשך 10 דקות חוזר השאיפה, תוספת של פתרון הדגירה פעם אחת.
  7. האחות הפתרון בשימוש ולהוסיף 1 מ"ל של נוגדנים משניים (ראה טבלה של חומרים) בחסימה פתרון לכל טוב. תקופת דגירה-RT של 60 דקות עם הגנה מפני אור.
  8. האחות הפתרון בשימוש, להוסיף 2 מ של DPBS המכילה 0.4% טריטון X-100 (RT) דגירה -RT במשך חמש דקות עם הגנה מפני אור. חזור על השאיפה, תוספת של פתרון הדגירה פעמיים.
  9. קח micrographs לבחון את יעילות בידול תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית28.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

HiPSCs כציוד (29,585A130) הם מרוכז ויוצרים טפט הומוגנית (איור 1B) מתאים בידול. HiPSCs מובחן (שלב 0) חלופה מועדפת, נזרע מחדש כתאי יחיד-צפיפות התאים נמוך (1-1.5 x5 10 תאים/cm2). בתוך 1 h, התאים מחוברים לצלחת ומתחילים להראות בליטה. יום 1, התאים הם התרבו, מחולק טוב כדי לכסות 80-90% על פני השטח. במהלך שלב 1B, התקשורת מופיעים מעונן בשל תאים מתים. הסרת תאים מתים הוא קריטי עבור בידול יעילים ביותר מאז תאים מתים עלול להפר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הדור של PDX1+ תאים מורכבת מרובי שלבים; לכן, חיוני לטיפול תאי בזמן המתאים. בין הצעדים, יעילות אינדוקציה האנדודרם סופי משפיע במידה רבה את היעילות אינדוקציה הסופי, יכול להיות הפרעה מזהמים שושלת היוחסין תאים אחרים (קרי, והמזודרם ו האאקטודרם), אשר עשוי להתרבות ו/או מפרישים על ידי גורמים לשבש התמיינות ספציפיים. אם היחס של SOX17+ תאים הוא נמוך מ- 80% ביום 4 (בשלב 1B), אינדוקציה יעיל כדי PDX1+ תאים הוא עלול להיות בסכנה.

הברית מובחן של hPSCs מתוחזקים מושבות או אגרגטים ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מימון מן האגודה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) דרך Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI גרנט Number15K09385 ו- 18 K 08510) טי, מענק הסיוע עבור עמיתי מחקר JSPS (מספר גרנט KAKENHI של JSPS 17J07622) משום מקום, ועבור הסוכנות יפן למחקר רפואי, פיתוח (AMED) באמצעות המחקר שלה להעניק "מרכז הליבה עבור שב"ס תא מחקר, מרכז מחקר ברשת המימוש של רפואה רגנרטיבית"בנוקאאוט המחברים תודה ד ר פיטר Karagiannis לקרוא את כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamineToronto Research ChemicalsK171000CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoicacid Santa Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים סטריליים מפוליפרופילןThermo Fisher Scientific339652
נוגדן נגד CDX2 [EPR2764Y]AbcamAb76541אנטי-CDX2, ופעמים; תוסף דילול 1/1000
B-27 (50 ופעמים;)תרמו פישר סיינטיפיק17504-044תוסף ללא סרום
BD FACSAria II סדרן תאיםBD Biosciencesלזרימה ציטומטריה
מקפיא ביו-רפואיSANYOMDF-U538עבור -30 מעלות; C אחסון
שקופיות ספירת תאים עבור מונה תאים TC10 / TC20, תא כפולBIO-RAD1450011ספירת זכוכית שקופיות
צלחת תרבית תאים MULTIWELL, 6 בארות, PS, שקוףגריינר BIO-ONE657165לתרבית בידול / צלחת 6 בארות
צנטריפוגהTOMYAX-310לתרבית תאים
צנטריפוגהTOMYMX-305עבור RT-qPCR
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
CLEAN BENCHSHOWA KAGAKU S-1601PRVספסל נקי
קורנינג CellBIND צלחת 6 בארותקורנינג3335לתרבית ללא מזין של hPSCs / צלחת 6 בארות
קורנינג מטריג'ל מטריצת קרום מרתף גורם צמיחה מופחתקורנינג354230מטריצת קרום מרתף
קורנינג סינתמקס II-SC מצעקורנינג3535לתרבית ללא מזין של hPSCs / חומר משטח סינטטי עבור hPSCs
CryostatLeicaLeica CM1510 Sלצביעה חיסונית של אגרגטים.
ערכת ציטופיקס/ציטופרםבקטון דיקינסון554714מאגר סלסול/שטיפה הוא  מאגר חדירה/שטיפה. מאגר ציטופיקס/ציטופרם הוא מאגר קיבוע וחדירה.
עט DakoDakoS2002לצביעה חיסונית של אגרגטים
תערובת dNTP (10 מ"מ)Thermo Fisher Scientific18427-088עבור RT-qPCR
חמור נגד עזים IgG (H + L) נוגדן משני נספג, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055נוגדן משני, וזמנים; 1/500 דילול
חמור נגד עכבר IgG (H + L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036נוגדן משני, ופעמים; 1/500 דילול
חמור אנטי-ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040נוגדן משני, ופעמים; 1/500 דילול
חמור סרוםMerck MilliporeS30סרום חמור
D-PBS(-) ללא Ca או MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001לתרבית ללא מזין של hPSCs/hPSC מדיום תחזוקה
Falcon 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול, עם מסננת תאים מכסההצמד קורנינג3522355 מ"ל צינור פוליסטירן תחתון עגול עם מסננת תאים
קצה מסנן, 1,000 ומיקרו; LWatoson124-1000Sהשתמש יחד עם פיפטות
קצה מסנן, 20 ומיקרו; LWatoson124-P20Sהשתמש יחד עם פיפטות
קצה מסנן, 200 ומיקרו; LWatoson124-P200Sהשתמש יחד עם פיפטות
מיקרוסקופ פלואורסצנטיKeyenceBZ-X700לצביעה חיסונית
CO2 ThermoFisher Scientific370Aחממה
HNF-1β נוגדן (C-20)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-7411אנטי-HNF1β, &פעמים; דילול 1/200
HNF-4α נוגדן (H-171)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-8987אנטי-HNF4α, &פעמים; דילול 1/200
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570לצביעת גרעין, ופעמים; 1/200 דילול
לבלב אנושי סך הכל RNAאמביוןAM7954עבור RT-qPCR
אנושי PDX-1 / IPF1 נוגדןR& D SystemsAF2419Anti-PDX1, עז IgG וזמנים; דילול 1/200
נוגדן SOX17 אנושיR& D SystemsAF1924Anti-SOX17, ופעמים; 1/200 דילול
משופר MEM אפשרות אבץ בינוניתרמו פישר מדעי10373-017iMEM
Cosmo Bio10DOלצביעה חיסונית של אגרגטים
כפפות בדיקת לטקסAdachi
MAS זכוכית שקופיות מצופהמטסונאמי83-1881עבור צביעה חיסונית של אגרגטים
MicroAmp מהיר 96-באר צלחת תגובהיישומי Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907עבור RT-qPCR
מיקרוסקופאולימפוסCKX41N-31PHPלתרבית תאים
MicrotubeWatoson131-515CS
מונוקלונלי אנטי-&אלפא;-FetoproteinSIGMAA8452Anti-AFP, × 1/200 דילול
Nanodrop 8000תרמו פישר מדעיעבור RT-qPCR
Oligo dTFASMACמותאם אישית אוליגו עבור RT-qPCR של הרצף הוא "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, אבקתNacalai tesque26126-54PFA, מקבע, מדולל במקרר תרופות DPBS
SANYOMPR-514עבור 4 מעלות; C אחסון
PIPETMAN P גילסוןפיפטה
רקומביננטית אנושית KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
רקומביננטי אנושי NogginPeproTech120-10CNOGGIN
רקומביננטי אדם/עכבר/חולדה Activin AR& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/μ L)TOYOBOTRT-101עבור RT-qPCR
RNase ללא DNase סט (50)QIAGEN79254עבור RT-qPCR
RNeasy מיני קיטQIAGEN74104עבור RT-qPCR
RPMI 1640 עם L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
איטום סרט לזמן אמתTakaraNJ500עבור RT-qPCR
פיפטות סרולוגיות 10 מ"לCostar/Corning4488לתרבית תאים
פיפטות סרולוגיות 25 מ"לCostar/Corning4489לתרבית תאים
פיפטות סרולוגיות 5 מ"לCostar/Corning4487לתרבית תאים
Sox2 (D6D9) XP ארנב mAbאיתות תאים3579SAnti-SOX2, ופעמים; 1/200 דילול
StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher מדעיעבור RT-qPCR
סוכרוזNacalai tesque30406-25לצביעה חיסונית של אגרגטים
TB Green
Premix Ex Taq II 		TakaraRR820Bעבור RT-qPCR
TC20 מונה תאים אוטומטיBIO-RAD1450101J1מונה תאים אוטומטי
Tissue-Tek OCT compound 4583 Sakura Finetechnic4583לצביעה חיסונית של אגרגטים
תבניות/מתאמים Tissue-Tek CryomoldSakura Finetechnical4566לצביעה חיסונית של אגרגטים
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
מקפיא אולטרה-קרSANYOMDF-U33Vעבור -80 ° C אחסון
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575-038לדלל עם DPBS להכנת 0.5 מ"מ EDTA
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientificעבור RT-qPCR
Y-27632Wako251-00514
חממת תא דגירה זכוכית

מקורות

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463(2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218(2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076(2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDX1hPSCWestern Blot

מאמרים קשורים