מאמר שיטה

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

DOI:

10.3791/57646

⸱

11 בנובמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, 2Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, 3Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, 4Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, 5Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, 6Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, 7Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, 8LinkoCare Life Sciences AB, 9College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 10Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר פרוטוקול לחקור את prenylation ואת guanosine-5'-טריפוספט (GTP)-טעינה של GTPase רו. פרוטוקול זה מורכב משתי שיטות מפורט, כלומר assay ממברנה fractionation ו- immunosorbent של GTPase-מקושרים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את prenylation ואת GTP העמסת שונים GTPases קטנים אחרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפחת רו GTPase שייך superfamily ראס וכוללת כ-20 חברים בבני אדם. Rho GTPases חשובים בוויסות תאיים מגוונים, כולל cytoskeletal dynamics, תנועתיות תא, התא קוטביות, הדרכה עצב, סחר vesicular בקרה מחזור התא. שינויים ב- Rho GTPase איתות תפקיד חיוני הרגולציה של מצבים פתולוגיים רבים, כגון סרטן, מחלות מערכת העצבים המרכזית, מחלות מערכת החיסון תלוית. שינוי posttranslational של GTPases רו (קרי, prenylation על ידי intermediates מסלול mevalonate) ואיגוד GTP הם גורמי מפתח אשר משפיעים ההפעלה של חלבון זה. בנייר זה, שתי שיטות פשוטות וחיוני ניתנים לגילוי של prenylation מגוון רחב של רו GTPase ופעילויות איגוד GTP. הפרטים של ההליכים טכני כי שימשו מוסברים צעד אחר צעד בכתב היד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רו GTPases הם קבוצה של חלבונים קטנים (21-25 kDa), אשר ההכפלה שמורים היטב במהלך האבולוציה, בצורה של תת ייחודי superfamily Ras של GTPases קטן. כל תת משפחה בתוך superfamily הזה, יש גרעין משותף G תחום מעורב של GTPase פעילות נוקלאוטיד exchange1. ההבדל בין המשפחה רו את subfamilies ראס אחרים הוא הנוכחות של "תחום הוספה רו" בתוך סטרנד βth 5, סליל αth 4 את תחום GTPase קטן2.

בהתבסס על הסיווג האחרונות, רו GTPases נחשבים משפחה של איתות חלבונים שמתאימים לתוך superfamily GTPase בראס3. GTPases Rho יונקים יש 22 חברים המבוסס על התפקוד המסוים שלהם אפיון כללי4 שבה RhoA, Rac1 ו- Cdc42 הם בין בני למד ביותר בקבוצה זו. Rho GTPases מקושרות אל תאיים איתות המסלולים באמצעות מנגנון מוסדר באופן הדוק אשר תלויה מתגים מולקולריים באמצעות חלבון שינויים posttranslational5.

GTP טעינה, הידרוליזה מנגנונים חיוניים במחזור הפעלה/ביטול הפעלה של GTPases רו קטן והם מוסדרים באמצעות הפעלת GTPase חלבונים (רווחים). פערים אחראים הידרוליזה GTP, לעבוד ביחד עם גואנין נוקלאוטיד exchange גורמים (GEFs) אשר אחראים על התגובה GTP-טעינה. התמ ג רו דיסוציאציה מעכבי (GDIs) לספק עוד יותר רגולציה של רו GTPases קטנים באמצעות איגוד GTPases רו התמ ג מכורך. זה מעכב את התמ ג דיסוציאציה ואסטמה ומקילה על sequestering של GTPases רו קטן מן האתרים פעיל ממברנה תאיים. יש גם עוד יותר רגולציה של חלבונים רו GTPase המערבים את prenylation של GDIs המסדירה נוקלאוטיד הידרוליזה של exchange והן פקדי התמ ג/GTP רכיבה על אופניים1,6,7,8.

GTP-טעינה והן GTPase רו prenylation מעורבים בתנועה של GTPase רו בין ציטוזול קרום התא על-ידי שינוי המאפיינים lipophilic של אלה חלבונים1,9. הרגולטורים הנ ל אינטראקציה עם פוספוליפידים של קרום התא וחלבונים modulating אחרים מתוך התמ ג/GTP המרת פעילות10. יתר על כן, GDIs, מעכבי דיסוציאציה, לחסום את הידרוליזה GTP והן ההחלפה התמ ג/GTP. GDIs לעכב את הדיסוציאציה של החלבונים רו לא פעילים מן התמ ג ו, לכן, האינטראקציה שלהם עם effectors במורד הזרם. GDIs גם לווסת את המחזוריות של GTPases בין ציטוזול קרום התא. הפעילות של רו GTPases תלויה במידה רבה את תנועתם אל קרום התא; לפיכך, GDIs נחשבים הרגולטורים קריטי זה יכול sequester GTPases בציטופלסמה דרך מסתיר את אזור הידרופובי/תחומים11,12.

עבור GTPase רו יש אופטימלי איתות ותפקוד בשלבים השונים של מחזור ההפעלה שלה, מחזור דינמי של הידרוליזה GTP-טעינה/GTP היא קריטית. כל סוג של שינויים בתהליך זה עלול לגרום השינויים הבאים בפונקציות תא מווסתות על-ידי רו GTPase, כגון תא קוטביות, התפשטות, מורפוגנזה, ציטוקינזה, הגירה, אדהזיה והישרדות13,14.

בפרוטוקול הנוכחי מספק לקוראים שיטה מפורטת כדי לפקח קטן RhoA GTPase הפעלה דרך החקירה של prenylation שלהם, התמ ג/GTP טעינה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות את GTP ואיגוד של מגוון רחב של GTPases קטן, prenylation. וזמינותו GTPase-מקושרים immunosorbent יכול לשמש כדי למדוד את רמת ההפעלה של סוגים אחרים של GTPases, כגון Rac1, Rac2, Rac3, H-, קיי- או N-ראס, הב ו רו15. סימבסטטין סוכן תרופתי משמש כדוגמה, כפי שדווח לאחרונה להיות מעורב ברגולציה של קטן GTPase רו prenylation ופעילות8,9,14,16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קביעת לוקליזציה RhoA באמצעות ממברנה/ציטוזול Fractionation

  1. טיפול תרבות, סימבסטטין תא
    1. זרע 50,000 U251 בתאים 100 מ מ צלחת, תרבות אותם של Dulbecco ששינה בינוני הנשר (DMEM) (גלוקוז גבוהה, 10% סרום שור בעובר [FBS]).
    2. כאשר 30% confluent, מתייחסים לתאים על-ידי הסרת המדיום והוספת בינוני המכיל סימבסטטין אליו (10 מיקרומטר סימבסטטין מומס דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]), תקופת דגירה של h 36-37 מעלות צלזיוס8. השתמש דימתיל סולפוקסיד לבד כפקד הרכב.
      הערה: 10 מיליון תאים יש צורך את fractionation ציטוזול ואת הממברנה של התאים.
  2. אוסף של תאים
    1. להסיר התאים החממה 37 º C. תראה התאים במיקרוסקופ כדי לאשר את confluency.
      הערה: התאים צריכים להיות confluent 70% - 80%.
    2. האחות של המדיום, לשטוף את התאים 1 x עם קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). הוסף 5 מ של ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) מאגר (אשלגן כלורי: 400 מ ג/ליטר, NaCl: 6800 מ ג/ליטר, NaHCO3: 2200 מ ג/ליטר,2PO NaH4. H2o: 140 מ"ג/ליטר, D-גלוקוז: 1,000 מ ג, ניתרן EDTA: 373 מ ג/ליטר) לכל צלחת והמקום התאים חזרה לתוך החממה 37 º C למשך 5 דקות.
    3. אחרי 5 דקות של דגירה, לאסוף את EDTA עם תאי בשפופרת 15 מ"ל המכיל את אותה כמות של בינוני כמו EDTA.
      הערה: יש בינוני בצינור מנטרלת את EDTA ומונעת כל עיכול נוספות של קרום התא.
    4. הכנס את הצינור מקרר והמשך לצנטריפוגה.
    5. להגדיר לצנטריפוגה ל x 1,500 גרם ב 4 ° C, לסובב את התאים עבור 5 דקות.
    6. להסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר ולהוסיף 1 מ"ל של PBS קר. מערבבים היטב את התאים.
    7. להעביר את התערובת תא (פתרון) צינור 1.5 mL החדש, צנטריפוגה-x 1,500 g ב- 4 ° C, ולסובב את התאים עבור 5 דקות.
    8. בדוק את גודל גלולה (עבור הערכת היקף המאגר לשלב הבא). מניחים את הדוגמאות על קרח. למחוק את תגובת שיקוע לחלוטין מבלי להפריע בגדר.
    9. הוסף את המאגר הקר שאני (10 מ מ טריס-HCl [pH 7.5] 0.1 מ מ EDTA, 0.1 מ מ EGTA, 1 מ dithiothreitol, מעכב פרוטאז קוקטייל), לערבב את הדגימות היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, לאחר מכן, המשך sonication.
  3. Sonication
    1. להגדיר את sonicator עבור 5 מחזורים, 5 s כל, ו- x 3. אני חוזר.
    2. לבצע את sonication על קרח. להמשיך ultracentrifuge.
      הערה: קרח, במצב קר לשמר את החלבונים ולהפוך את התוצאות אמין יותר.
  4. Ultracentrifugation
    1. השתמש ultracentrifuge כדי להפריד את homogenates תא לתוך cytoplasmic ושברים ממברנה. הגדר לצנטריפוגה x 100,000 g עבור 35 דקות ב 4 º C. כפי שמוצג באיור1, לבדוק את גודל גלולה.
      הערה: השבר ממברנה היא בתחתית הצינורית ו. רכיבים cytoplasmic אחרים.
    2. לאסוף את תגובת שיקוע לחלוטין תוך נזהר שלא להפריע בגדר. תגובת שיקוע הוא השבר cytosolic. מקם את תגובת שיקוע בשפופרת שכותרתו החדש.
    3. להוסיף 300 µL מאגר דיסוציאציה (מאגר II) (50 מ מ טריס-HCl [pH 7.5] 0.15 מ' NaCl, dithiothreitol 1 מ מ, 1% מרחביות, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ EGTA, מעכבי פרוטאז קוקטייל) כדי בגדר (מכיל את השבר קרום). מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    4. המשך קביעת חלבון, הכנת הדוגמא תספיג חלבון (ניתוח immunoblot).
  5. Immunoblotting
    1. להכין החלבון תא תמציות מן השברים מופרדים במאגר פירוק (20 מ"מ טריס-HCl [pH 7.5], 0.5 מ מ PMSF, 0.5% ללא יונית דטרגנט-40, 100 מיקרומטר β-גליצרול 3-פוספט, ו- 0.5% פרוטאז מעכב קוקטייל).
    2. למדוד את ריכוז חלבון באמצעות שיטת לאורי8 ולחשב את עוצמת הקול של המאגר פירוק (20 מ מ טריס-HCl [pH 7.5], 0.5 מ מ PMSF, דטרגנט nondenaturing 0.5%, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 מיקרומטר β-גליצרול 3-פוספט ו- 0.5% קוקטייל מעכב פרוטאז) לנרמל את הריכוז של חלבון בין הדגימות.
    3. מחממים את הדגימות ב 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וטען µL 15-20 של הדגימות על ג'ל מרחביות-דף 15% כדי להפריד את החלבונים.
      הערה: לטעון µg 1 של חלבון עבור כל דגימה. לחשב את עוצמת הקול צריך לפעול בהתאם.
    4. להעביר את החלבונים מופרדים ניילון ממברנות תחת צמצום תנאים (500 ננומטר גליצין, 50 מ מ טריס-HCl ו 20% מתנול) h 2, בטמפרטורת החדר (RT) ב- 100 וולט.
      הערה: כדי לאשר את העברת חלבון מוצלחת, השתמש כתם צבע מאכל פונסו או לדמיין את סמן חלבון על הקרום.
    5. לחסום את הקרומים עם 5% שומן חלב יבשים, 1 x באגירה טריס תמיסת מלח המכיל חומרי ניקוי (דטרגנט nonionic TBS/0.01%; TBST) כדי לחסום את איגוד נוגדן ספציפי ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ב- RT לשעה.
    6. להוסיף נוגדנים העיקרי לניתוח immunoblotting, דגירה בין לילה ב 4 º C.
      הערה: בניסוי זה, Rac1/2/3 ', ' cdc42 ', ' RhoA ', GAPDH, פן-קדהרין שהשתמשו 1:1,000 לדילול חלב 1% 1 x TBST. פאן-קדהרין GAPDH שימשו כדי לאשר ממברנה וטוהר שבר cytosolic, בהתאמה.
    7. לשטוף את הקרומים 3 x עם מאגר כביסה עם 1 x TBST למשך 20 דקות.
    8. דגירה בקרום עם הארנב נגד חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים משניים עבור הנוגדנים העיקרי בהתאמה (עבור 1h-RT).
    9. לשטוף את שהכלים x 3 עבור 20 דקות ולפתח אותם עם זיהוי משופרת chemiluminescence (ECL).

2. מדידה של המטען GTP RhoA שימוש Assay הפעלה G-חלבון קטן

  1. ספירת 10,000 תאים למ"ל ותרבות התאים U251 100 מ מ מגישים.
  2. כאשר הם 30% confluent, פנקו את התאים עם סימבסטטין כפי שמתואר בשלב 1.1.2.
  3. להביא את הצלחות תרבות מתוך החממה. תראה התאים במיקרוסקופ כדי לאשר confluency. ודא כי התאים נמצאים confluent 70% - 80%. מניחים על צלחת פטרי על הקרח וארוקן את המדיה, לשטוף את התאים 3 x עם PBS קר כקרח (pH 7.2).
  4. מחוק לגמרי מגניב. להטות את צלחת פטרי על הקרח דקה נוספת להסיר את כל שרידי PBS.
    הערה: PBS שיורית משפיע לרעה זה וזמינותו.
  5. Lyse תאי נפח 700 µL של פירוק כקרח מאגר המכיל מעכבי פרוטאז, פוספטאז.
    הערה: 700 µL היא בדרך כלל מספיק עבור 100 מ מ פטרי. ראה טבלה 1 כדי למצוא את הנפח הנכון עבור כל כלי תרבות.
  6. לקצור את התא lysate עם מגרד התא. שיפוע לצלחת תרבות עבור טכניקה זו.
  7. להעביר את lysate cryotube קר כקרח שכותרתו ולשמור אותו בקרח.
  8. מערבבים ביסודיות באמצעות מערבולת. שמור µL 10 של lysate עבור וזמינותו חלבון, כדי למדוד את ריכוז חלבון במדגם.
  9. Snap-הקפאת התא הנותרים lysate של חנקן נוזלי.
    הערה: להכין aliquots מרובים של תא lysate לפני snap-הקפיאה אותם, כדי להימנע מחזורים ההקפאה/ההפשרה חוזרות ונשנות אשר יכול להוביל לאובדן הפעילות של RhoA GTPase.
  10. להעביר את cryotubes מוקפאים snap מקפיא-80 ° C ולאחסן את הדגימות עבור וזמינותו GTPase-מקושרים immunosorbent.
    הערה: אל תאחסן את הדגימות לתקופה העולה על 14 ימים. עובדת במהירות ואני לעולם לא אעזוב את הדוגמאות על הקרח יותר מ 10 דקות. אף פעם לא להתמודד עם צלחות פטרי כל בו זמנית.
  11. למדוד את ריכוז חלבון באמצעות שיטת לאורי8 ולחשב את עוצמת הקול של המאגר פירוק לנרמל את הריכוז של חלבון בין הדגימות.
    הערה: הריכוז הכי טוב בדרך כלל 1 מ"ג/מ"ל; עם זאת, 0.3 - 2 מ"ג/מ"ל ניתן לזיהוי.
  12. להכין את הפקד ריק על-ידי הוספת µL 60 פירוק מאגר µL 60 מחייב מאגר microtube.
    הערה: הפקד ריק יש נוגדנים לכל פרט אנטיגן והוא משמש עבור החיסור של הרקע.
  13. להכין פקד חיובי על-ידי הוספת µL 12 של חלבון שליטה רו µL 48 פירוק המאגר, µL 60 מחייב המאגר.
    הערה: הפקד חיובי יש נוגדנים לכל בתוספת אנטיגן מאושרות עבור Rho-A-GTP.
  14. לוקח את הצלחת זיקה רו מהתיק שלה ומניחים אותו על קרח.
  15. להמיס את האבקה בתוך הבארות עם 100 µL של קרח מים מזוקקים. לקחת את הצלחת על קרח.
  16. להפשיר את lysates תא מוקפאים snap באמבט מים מוגדר 25 º C.
  17. להוסיף נפח מחושב של מאגר פירוק כקרח (מתוך שלב 2.11) כל מדגם לנרמל את הריכוז של חלבון.
    הערה: הסר את PBS לאחר שטיפת התאים (באמצעות של העצמות שפופרת ריק) כדי למנוע גרימת שינויים בהרכב של המאגר פירוק. להשוות החלבון הדגימה כדי ריכוז בין 0.8 ל- 2 מ"ג/מ"ל על השוואה בין דוגמאות של מבחני הפעלת GTPase. בטבלה 2 מספק פרטים אודות מאגר שישמש עבור זה וזמינותו.
  18. להעביר 60 µL של הדגימות כקרח מנורמל microtubes ולהוסיף 60 µL של איגוד המאגר; לערבב את הדגימות ביסודיות ולשמור אותם על קרח.
  19. לחלוטין להסיר את המים/הפתרונות microplate על ידי מצליף נמרצת, ואחריו חמש עד שבע הברזים קשה על מזרון מעבדה.
  20. להוסיף 50 µL של הדגימות מנורמל, פקד ריק פקד חיובי הבארות שבו כפילויות.
  21. מניחים את הצלחת על תפקודי לב / נשימה למשך 30 דקות ב 4 ° C-300 סל ד.
    הערה: הצעד חזק חשוב מאוד, מומלץ להשתמש ניעור צלחת מסלולית-300 סל ד.
  22. נקה דגימות מן הלוח על ידי מצליף ולשטוף אותם 2 x עם 200 µL לרחוץ את מאגר ב RT. נמרצות להסיר המאגר הכביסה מן הבארות לשטוף אחרי זה על ידי מצליף, ולאחריו הקשה, ולשמור את הצלחת על הספסל-RT.
  23. להוסיף 200 µL RT אנטיגן מאגר מכל קידוח, דגירה-RT למשך 2 דקות.
  24. קפיצי את הפתרון מן הבארות. ולשטוף את בארות 3 x עם 200 µL לרחוץ את מאגר-RT.
  25. להוסיף 50 µL של טריות 1/250 נוגדן anti-RhoA העיקרי מכל קידוח.
  26. למקם את הצלחת תפקודי לב / נשימה למשך 45 דקות ב 300 סל ד מוגדר 25 º C. קפיצי את הפתרון מן הבאר.
  27. חזור על השלבים כביסה 2 x (שלב 2.24).
  28. להוסיף 50 µL של טריות 1/250 נוגדן anti-RhoA משנית בכל טוב.
  29. למקם את הצלחת על גבי תפקודי לב / נשימה למשך 45 דקות ב 300 סל ד מוגדר 25 º C.
  30. להכין את ריאגנט לזיהוי HRP על ידי ערבוב נפחים שווים של ריאגנט A וריאגנט B.
  31. קפיצי את הפתרון מכל קידוח ולשטוף הבארות 3 x עם 200 µL לרחוץ את מאגר-RT.
  32. להוסיף 50 µL של ריאגנט לזיהוי HRP טריות כל טוב.
  33. לקרוא את האות זורח בתוך 3-5 דקות כדי לקבל את האות המרבי ולנתח את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה מתאימה.
    הערה: קריאות חייב להילקח תוך 3-5 דקות כדי לקבל את האות המרבי. הפעלת "צלחת מבחן" כדי לאשר את פירוק תקין נפח המאגר משמש את lysates תא כך ריכוז חלבון גבוה מספיק כדי לזהות פעילות RhoA GTPase. (צלחת הבדיקה היא צלחת של תאים המשמשות לקביעת ריכוז חלבון נופל בתוך הטווח המקובל וכן כדי לקבוע אם היקף המאגר פירוק בשימוש מתאים). הפקד חיובי יש לקרוא 4 - ל 10 פי גבוה יותר הבארות ריק אם זה בטווח ליניארי. אם לא, ואז להתאים את luminometer על ידי ייעוץ היצרן. ההגדרות עבור luminometer מקבלים בטבלה3.
  34. הזן נתונים גולמיים עמודות שבו הכותרות לקרוא לדוגמה, זאת אומרת, סטיית תקן, rep1, rep2, rep3, ו rep4, אשר נועד להציג את המספר של משכפל נעשה על כל דגימה.
  35. תחת זאת אומרת, הזן את הנוסחה =average(Xn:Yn) שבו X = את מציין העמודה עבור rep1, Y = את מציין העמודה עבור rep4ו- n = מציין את השורה של השורה להיות עבד.
  36. תחת סטיית תקן, הזן את הנוסחה = stdev (Xn:Yn) שבו X = את מציין העמודה עבור rep1, Y = את מציין העמודה עבור rep4ו- n = מציין את השורה של השורה להיות עבד.
  37. הזן את הנתונים שכפל לתוך rep1, rep2, וכו '
  38. לאחר הזנת הנתונים, השתמש בשיטה לחץ וה גרור כדי לבחור את הדגימה, כלומר, על סטיית תקן.
  39. לאחר מכן, תוכנה לניתוח נתונים, בחר בפונקציה עבור תרשים גורם אשר נראה ריבוע עם תרשים עמודות מיני בפנים.
    הערה: פעולה זו מעלה את התרשים ביצוע תהליך שבו זה אפשרי עיצוב תרשימים בהתבסס על נתונים שהוזנו.
  40. לבחור תרשים טורים , עבור ערכי הקלט, לייעד את המספרים מתכוון .
    הערה: התרשים עבור מספרי מתכוון נוצרת לראשונה, לאחר מכן, המיועד העמודה סטיית התקן עבור קווי השגיאה ציר ה-y. כדי לעשות זאת, לחץ פעמיים על הסורגים גרף, בחר בכרטיסיה ציר ה-y שגיאה , לחץ על האפשרות מותאם אישית ולאחר בחר את האזור בגליון העבודה כדי להזין את המיקום של נתוני סטיית תקן . ניתן לראות את ההבדל בין הקבוצות צריכים להיות מושווה לאחר היצירה של התרשימים הרצוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרום Fractionation:

Ultracentrifugation שימש את fractionation של הממברנה ורכיבים ציטוזול. כפי שמוצג באיור1, תגובת שיקוע מכיל את השבר cytosolic ומכיל בגדר השבר ממברנה. השפע של RhoA cytosolic andmembrane שברים מתקבל מתאי U251 נבדקה לאחר הטיפול עם סימבסטטין באמצעות immunoblotting. הטוהר וטעינה שליטה של השבר ממברנה, ציטוזול שאושרו על-ידי פאן-קדהרין ו- GAPDH בהתאמה. כפי שמוצג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה מדויקת למדוד קטן GTPase prenylation ואיגוד GTP כמוצג GTPase קטן subcellular לוקליזציה (ממברנה לעומת ציטוזול) ו GTP רו טעינה. GTPases קטנים באים לידי ביטוי התאים האיקריוטים, ממלאים תפקידים חיוניים ב תאית שגשוג, תנועתיות ומבנה. Prenylation ואיגוד GTP מעורבים בוויסות פעילות GTPase; לכן, מבחני כדי להעריך את prenylation ואת GTP קשירה של חלבונים אלה הם כלים חשובים עבור תא ביולוגים1,8.

בהתבסס על תוצאות מחקר שנערך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איציק רז Ghavami נתמכה על ידי בריאות מדע מרכז ההפעלה מענק, CHRIM ההפעלה מענק מחקר מניטובה החדש החוקר הפועלים גרנט. . ג'אבד אליזאדה נתמכה על ידי מניטובה מחקר studentship. דאגה Shojaei נתמך על ידי מענק בריאות קרן המדע פועל להאיץ MITACS הבתר. עאדל רזאא'י מוגדם נתמכה על ידי NSERC הפועלים גרנט אשר נערך על ידי ג'וסף וו גורדון. אמיר א Zeki נתמכה על ידי כל הפרס NIH/NHLBI K08 (1K08HL114882-01A1). מארק ג' לוס בחביבות מודה התמיכה של NCN להעניק #2016/21/B/NZ1/02812, נתמך על ידי LE ביבליקום המכון ללימודים מתקדמים (אזור מרכז-ואל דה לה לואר, צרפת) דרך חכמה הלואר עמק כללי תוכנית שלה והיתה שותפה במימון מאת מארי פעולות Sklodowska-קירי, להעניק #665790. סימון דה סילבה רוזה נתמכה על ידי UMGF studentship.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM גלוקוז גבוהVWR (קנדה)VWRL0101-0500
סרום בקר עובריVWR (קנדה)CA45001-106
פניצילין/סטרפטומיציןVWR (קנדה)97062-806
EDTA (חומצה אתילנדיאמין טטראצטית)VWR(קנדה)CA71007-118
EGTA (אתילן גליקול ביס(2-אמינואתיל אתר)-N,N,N',N'- חומצה טטראצטית)VWR (קנדה)CAAAJ60767-AE
DTT (DL-DITHIOTHREITOL),VWR (קנדה)CA97061-340
אמוניום פרסולפטVWR (קנדה)CABDH9214-500G
Tris-HydroxymethylaminomethaneVWR (קנדה)CA71009-186
30% תמיסת אקרילאמיד/ביסביורד (קנדה)1610158
TEMEDBiorad (קנדה)1610801
קוקטייל מעכב פרוטאזSigma/Aldrich (קנדה)P8340-5ML1:75 דילול
Rho-GTPase Antibody Sampler KitCell Signaling (קנדה)99681:1000 דילול
Pan-CadherinAntibody Cell Signaling (קנדה)40681:1000 דילול
נוגדן GAPDHסנטה קרוז ביוטכנולוגיה (ארה"ב)sc-697781:3000 דילול
RhoA G-LISA מבחן הפעלה (פורמט זוהר)Cytoskeleton Inc. (ארה"ב)BK121Cytoskeleton I. G-LISA מדריך טכני לבדיקות הפעלה. 2016.RhoA
נוגדניםאיתות תאי2117
ECLאמרשם-פרמסיה ביוטקRPN2209
אנטי-ארנב IgG (מולקולה שלמה) נוגדן פרוקסידאזSigmaA6154-1ML
SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Readerהתקנים מולקולריים 1612071Aספקטרופוטומטר
Nonidet P-40Sigma11332473001חומר ניקוי שאינו דנטורציה, אוקטילפנוקסיפוליאתוקסיאתנול
DMSOסיגמאD8418-50ML
PBSSigmaP5493-1L
קוקטייל מעכב פופטאזSigmaP5726-5MLדילול 1:75

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
  2. Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
  3. Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
  4. Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
  5. Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
  6. Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
  7. Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
  8. Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841(2017).
  9. Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523(2011).
  10. Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
  11. DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
  12. Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
  13. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  14. Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
  15. Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
  16. Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
  17. Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
  18. Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3(2008).
  19. Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
  20. Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
  21. Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
  22. Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
  23. Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
  24. Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Rho GTPaseGTPWestern BlotSimvastatin

מאמרים קשורים