מאמר שיטה

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

DOI:

10.3791/57653

⸱

8 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Bristol Medical School, Translational Health Sciences, University of Bristol

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התיקון של מעברי גדילי כפול (DSBs) ב- DNA הוא תהליך מאוד מתואמת, המחייב את היווצרות והרזולוציה של מתחמי חלבון רב תיקון. תהליך זה מוסדר על ידי מספר עצום של חלבונים לקדם את העמותה ואת השיוך של חלבונים אלה נגעים. תודה במידה רבה היכולת לבצע מסכי פונקציונלי של ספריה העצום של חלבונים, יש הערכה גדולה יותר של הגנים הדרושים עבור התיקון מעבר DNA כפול-strand. לעיתים קרובות נוקאאוט או כימי המעכב מסכי לזהות חלבונים המעורבים בתהליכים תיקון על-ידי שימוש מוגבר רעילות סמן חלבון הדרוש לתיקון DSB. למרות שימושי עבור מזהים הרומן הסלולר החלבונים המעורבים שמירה על נאמנות הגנום, אנליזה פונקציונלית דורש קביעת אם החלבון עניין מקדמת לוקליזציה, היווצרות או ברזולוציה של מתחמי תיקון.

ההצטברות של חלבונים תיקון ניתן להבחין בקלות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence כמו foci גרעיני ברורים. לפיכך, השיוך של חלבונים אלה באתרים של נזק לדנ א וארגון ניתן לגשת על ידי התבוננות אלה foci גרעיני במרווחי זמן נציג לאחר אינדוקציה של זוגיות-גדיל DNA מעברי. גישה זו ניתן לזהות חלבונים גורם תיקון בזיהוי שגיאות מקומי, אם תיקון פגמים אינם מתרחשים בו זמנית עם לא שלם עיכובים בתיקון. בתרחיש זה, לטווח ארוך כפול-גדיל DNA מעברי ניתן לתכנן על ידי הבעת של חיתוך נדיר endonuclease (למשל, SceI) בתאים איפה האתר זיהוי האנזים אמר שולב הגנום הסלולר. הנגע וכתוצאה מכך קשה במיוחד לפתור כמו תיקון הנאמן להציג אתר הכרה של האנזים, המבקשת עוד סיבוב של המחשוף. כתוצאה מכך, הבדלים קינטיקה של תיקון נמחקות. אם תיקון מכלולי לא נוצרות, יש כבר המניע לוקליזציה. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה נחוץ לזהות שינויים ותיקון קינטיקה, כמו גם תיקון חלבון לוקליזציה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל יום, כל תא בגוף האדם הוא מופגז עם 10,000 המשוערת DNA נגעים1. האיום הקיומי הזה מעמיד אותנו בסיכון מוטציות, oncogenesis, כמו גם לתא המוות. כדי להגן על נאמנות הגנום, בתרבית של תאים התפתחו להגיב על נזק לדנ א עם סדרה מורכבת של עמותות חלבונים ושינויים. תגובה זו מאורגנת לתוך מספר מסלולים, המכונה באופן קולקטיבי ה-DNA נזק התגובה (DDR)2,3. DDR מורכב ההצטברות של חלבונים תיקון ה-DNA ב DNA נגעים, מתואמים חנותם והן במרחב. DDR גורם לעתים קרובות מחזור התא מעצר כדי למנוע את התפשטות או התעצמות של נזק עלול להתרחש במהלך השכפול של הדנ א פגום2,4,5. בתורו, זה גם הכרחי עבור הכדאיות הסלולר לבטל את מחזור התא מעצר על-ידי ביטול השיוך תיקון מכלולי לאחר תיקון שהושלם.

בין הסוגים השונים של נזק לדנ א, DSBs, המזיקות ביותר. יכול לגרום לכשל כדי לתקן את DSBs rearrangements כרומוזום או מחיקות בקנה מידה גדול כגון האובדן של הזרועות כרומוזום שלם. התיקון של DSBs מחולק לשני מסלולים6,7,8. רקומבינציה הומולוגית (HR) דורש אחות כרומוזום להשתמש כתבנית DNA ולכן הוא מוגבל מאחר G2/מאזו שלבי מחזור התא9,10. Non-הומולוגי סוף מצטרף (NHEJ) אין הגבלות אלה, אך יכול לגרום מחיקות קטן בעת תיקון DSBs11,12.

DSB לתקן באופן ספציפי, DDR באופן כללי הם פעילים תחומי החקירה. למרות להיות מאורגנים בתוך המסלולים מופרדים בנוחות, יש מידה רבה של יתירות. אכן, הרבה חלבונים (BRCA1, BRCA2 ו את RPA מורכבים לדוגמה) מעורבים מספר מסלולים13,14,15,16. התיקון של פגיעה באמצעות שביל אחד, יכול להוביל ביניים נזק זה צריך לתקן על ידי מסלול אחר14. השילוב של מסלולים אלה, בשילוב עם המשימה המורכבת שלהם לגייס את החלבונים הנכון למקום הנכון עבור הסכום המדויק של הזמן הדרוש, דורש תהליך התקינה רב שכבתית.

לאחרונה דווח מדגיש המורכבות של DDR על ידי הפגנת כי היווצרות מורכבות תיקון רזולוציה, לוקליזציה של כל אחד בנפרד ניתן לקוי17. המטרה הכוללת של הפרוטוקול הבא הוא לנתח באופן מוחלט את היכולת של תאי לתקן DSB. באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence, הצטברות של חלבונים תיקון באתרים של נזק, ניתן לאבחן בנקודות זמן נציג בעקבות של אינדוקציה של DSBs.

טכניקה זו היא בעלת מספר יתרונות גישות נפוצות. לעתים קרובות, תיקון הוא ובדוקים בנקודות פעם ולא מסוגל המייצגים את תהליך דינמי של הרכבה דיסוציאציה של מתחמי תיקון. התבוננות בטווח המלא של התיקון של ההפעלה הראשונית לרזולוציה מלאה מבטיחה לא טעינו בזיהוי עיכוב תיקון כמו עיכוב מוחלט. לעומת זאת, היא מבטיחה לא טעינו בזיהוי של אינדוקציה של תגובה לתיקון אין אפשרות להשבית את התגובה אמר הרגיל או הפעלת יתר.

היווצרות מורכבות חלבונים מתעכב, לוקליזציה שגויה של תיקון חלבונים, עם זאת, ייתכן לא חד משמעית להבחין עם גישה זו. כדי לקבוע אם תיקון חלבונים הם בזיהוי שגיאות מקומי לעומת להתעכב על לוקליזציה שלהם, שיוכל DSB "ארוך" דרך המחשוף אנזימטי של DNA. תאית. הנגע וכתוצאה מכך הוא ואז אני יערוך בכל פעם שזה יתוקן, והתוצאה היא מוקד ברורים תיקון גרעיני גדול והסרה ההגבלה הטמפורלי של גיוס. זו יכולה להיות מושגת על ידי שינוי הגישה הקיימת עם השימוש חיתוך נדיר endonuclease (למשל, SceI) כדי לעודד DSB לטווח ארוך. תוחלת החיים של DSBs מאפשר את הפריט החזותי של תיקון חמקמק חלבונים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. שפע משופרת יכול גם לשפר את הפריט החזותי בעת זיהוי מתעכבת על ידי הגבלה באיכות נוגדן, תכונה אשר יכול להיות שימושי כאשר חלבונים למד פחות מזוהים כבעלי השפעה על תיקון ה-DNA.

ראוי לציין, אנו מספקים הוראות מפורשות על תמונה חופשית עיבוד וניתוח תוכנה (לדוגמה, ImageJ). פעולה זו מסירה את מחסום הפיננסיים העיקריים בניתוח התמונה, פתיחת החקירה של DNA לתקן נזק לקהל רחב יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימו לב, פרוטוקול זה נכתב עבור U2OS תאים המכילים של אתר הכרה-SceI18. התאים לא צריך להיות U2OS אבל חייב להכיל את האתר SceI. הפרוטוקול ייתכן שתצטרך להיות מנוכי עונתיות (למשל, מספר התאים נזרע ושעות הדגירה) בהתאם לסוג תאים בשימוש.

1. הגדרת את קינטיקה של DSB תיקון היווצרות מורכבות

  1. לגדל תאים U20S-DRGFP על צלחת תרביות רקמה 10 ס מ עד 85-90% confluent.
  2. הסר את המדיה, דגירה בטמפרטורת החדר (RT) ב- 3 מ"ל של EDTA למשך 2 דקות.
  3. החלף EDTA 1 מ"ל של טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. ודא כי התאים מנותקים מפני השטח של הלוח על ידי צפייה במיקרוסקופ. לנטרל טריפסין 5 מ של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
  4. לקבוע את הריכוז של תאים ההשעייה באמצעות hemocytometer ואת שיטת מניעה כחול trypan.
  5. זרע 6 x 103 תאים/טוב ב µL 200 של צלחת זכוכית-התחתון 96-ובכן. לחלופין, זרע 4 x 10 תאים6 מ ל 8-12 מ מ coverslips להציב צלחת 10 ס מ.
    הערה: כל טוב או coverslip מייצג נקודת זמן אחד, כולל את הפקד.
  6. לגדל את התאים בן לילה-CO של 37 ° C ו- 5%-2.
  7. גרימת DSBs
    1. להחליף את המדיה מן המנה 96-ובכן צלחת/10 ס מ עם2O H2 מדולל על ריכוז של 25 מיקרומטר עם DMEM + 10% FBS דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
    2. לשטוף את התאים 3 x 1 x PBS והחלף עם DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה התאים 37 ° C 0, 1, 4, 8, 24 ו 48 ה ודא כי דילולים טריים של2O H2 משמשים עבור כל ניסוי.
      הערה: כדי למנוע הרג תאים על ריכוז2 2O H המשמש כאן, ודא כי המינון של נזק הוא נמוך מספיק כך עיקר התאים יימנע ואפופטוזיס ו הזדקנות ביולוגית. זה חיוני כדי לבחון את תהליך ההחלמה. זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי מדידת רגישות מגוון רחב של מנות. לבצע assay MTT או אחרים assay הכדאיות תא כדי לקבוע ריכוז מינימלי של מי חמצן יכול לשמש.
  8. תיקון, permeabilizing תאים
    1. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 x PBS. להסיר את coverslip הצלחת 10 ס מ עבור כל נקודת זמן ולמקם אותו טוב יחיד של צלחת 24-ובכן לתיקון. השתמש במחט מלקחיים בזהירות להסיר את coverslip והימנעות גירוד התאים מעל פני השטח coverslip.
    2. תיקון התאים על ידי המקננת למשך 15 דקות עם 4% paraformaldehyde (PFA) איזור פעמים לאחר 1 h H2O2 חשיפה, החלפת DMEM טריים (0, 1, 4, 8, 24 ו 48 שעות).
    3. לשטוף את coverslips קבוע 3 פעמים עם PBS. Permeabilize התאים עם 0.5% דטרגנט ללא יונית מדולל ב- 1 x PBS. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT, לפני נטילת 3 x עם PBS.
      הערה: לאחר permeabilization, אחסון של coverslips אפשרי ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות שבוע.
  9. תיקון הדמיית מורכבים
    1. לחסום את 96-ובכן הצלחת/coverslips בריכוז של 3% אלבומין שור (BSA) ו- 0.1% דטרגנט ללא יונית מדולל ב- PBS 1 x (3% BSA פתרון) עבור h 1-RT.
    2. דגירה עם נוגדנים העיקרי שכוונו החלבון תיקון של עניין, מדולל על פי מפרט היצרן בפתרון BSA 3% עבור h 1-RT, לפני נטילת 3 פעמים עם 1 x PBS.
    3. דגירה של 96-ובכן הצלחת/coverslips עם נוגדנים משניים מדולל לפי הפרוטוקול של היצרן בפתרון BSA 3%. לאשר כי fluorophores המשני אין עירור חופפים או ספקטרום הפליטה.
    4. לאחר שטיפת התאים עם PBS 3 פעמים מוסיפים דאפי, מדולל על פי מפרט היצרן ב- 1 x PBS, דגירה-RT במשך 5 דקות.
    5. הר על coverslips על גבי שקופיות עם טיפה של הסוכן הרכבה, מוודא את הפרצופים התא בצד למטה. הקש בקפידה על coverslips ולספוג כל סוכן הרכבה עודף עם מגבון.
    6. חותם על coverslips עם ייבוש מהיר לק שקוף ולהבטיח חותם שלמה של coverslip כאשר השקופית.
    7. קח את התמונות מיקרוסקופ קונפוקלי על-ידי התמקדות בערוץ דאפי, לפני ערוצים אחרים (עם אותות גנים תיקון ה-DNA של עניין) כדי למנוע הטיה ידביקו הניסוי.
    8. לחלופין, ניתן לרכוש תמונות על-ידי לקיחת Z-סעיפים של האזור הרצוי עיבוי התמונה לתוך מטוס בודד לדמיין כל foci לזיהוי.
      הערה: אם DSB רזולוציה או חלבון עניין נצפית לא בנקודות זמן שנבחר, לקבוע מתי DSBs לפתור על-ידי בחירת מגוון רחב של נקודות זמן בתחילה (0 – 48 h פוסט DSB אינדוקציה). זמן מוקדי עניין ישתנו לפי שיטת האינדוקציה DSB, החלבון תיקון של עניין.
  10. השתמש ImageJ תוכנה חופשית כדי להגדיר הגרעינים של תמונות מיקרוסקופ immunofluorescence.
    הערה: כדי לפתוח תמונות מיקרוסקופ, התוסף ביו-תבניות להתקין ב- ImageJ.
    1. פתח את התמונות קונאפוקלית (.czi או. tif) על-ידי גרירת קובץ התמונה לתוך חלון ImageJ, או על-ידי בחירה "ביו-תבניות היבואן" מסרגל הכלים "תוסף" ב- ImageJ.
      הערה: יופיע חלון "ביו-תבניות ייבוא אפשרות".
    2. בחר 'פצל ערוצים' לפצל את התמונה דאפי מכוננת ותמונות פלורסנט בתוך חלון "ביו-תבניות ייבוא אפשרות".
    3. בחר "Colorized" 'אפשרויות צבע' מהתפריט הנפתח. בחר "אישור" כדי לפתוח את דאפי היסטון H2AX (H2AX) תמונות כמו להפריד בין חלונות ובחר את התמונה דאפי.
    4. בחר את סרגל הכלים 'תמונה' "להתאים את הסף" אפשרות לבחירת רב-קוטבי.
      הערה: יופיע חלון "סף".
    5. להתאים את הסף תמונה על-ידי הזזת סרגל התחתון של חלון "סף" לגמרי בצד ימין. התאם את הבר העליון עד הגרעינים מופיעים אדום לגמרי עם קווי מתאר ברורים, הרקע השחור. אל תבחר להחיל. סגור את החלון "להתאים את הסף".
    6. בחר את סרגל הכלים 'נתח' "חלקיקים לנתח" אפשרות. ראה חלון "חלקיקים לנתח" המופיעות על המסך.
    7. קלט הגודל המינימלי של גרעין.
      הערה: חלקיקים מתחת לגודל שלא יהיה, לא תימנה כמו גרעינים.
    8. מהתפריט הנפתח 'הצג', בחר 'קווי מתאר'. בחר באפשרות "הוסף למנהל". לחץ על "אישור" כדי לפתוח את חלון "רועי מנהל".
      הערה: קווי המתאר של גרעינים יופיעו בחלון נפרד.
    9. להקצות מספרי גרעינים שניתן לבחור מתוך חלון "רועי מנהל".
  11. השתמש ImageJ כדי לכמת H2AX foci בתמונות מיקרוסקופ immunofluorescence.
    1. בחר חלון foci "H2AX" (מוכתמים fluorescently מצומדת נוגדנים משניים). לאחר מכן, בחירת סרגל הכלים "תהליך" ובחר "למצוא Maxima" למצוא את foci בתוך האטומים.
      הערה: יפתח חלון "Maxima למצוא".
    2. בחר באפשרות "יחיד נקודות" מתוך התפריט הנפתח 'סוג פלט' ובחר "בחירת נקודת תצוגה מקדימה" כדי להמחיש את מקסימה/מוקדים. קלט ערך "רעש סובלנות" בהתאם עוצמת קרינה פלואורסצנטית של התמונה (איור 1). בדוק המראה של חלון לבן עם נקודות שחורות קטנות.
      הערה: הנקודות מייצגות H2AX foci/מקסימה אשר זוהו. הערך סובלנות רעש חייבת להישמר קבוע לכל התמונות שעוברים ניתוח. סובלנות רעש נמוכה/גבוהה מתארים גם רבים/כמה maxima (foci) בתוך הגרעין, לא יהיה ייצוג מדויק של מוקדים בתוך הגרעין.
    3. בחר גרעינים שעבורו H2AX foci עליך ניתן לכמת עבור מהחלון "רועי מנהל". בחר כל האטומים על ידי סימון האפשרות "הצג הכל".
    4. בחר "מדידה" כדי למדוד את מספר maxima/foci בתוך האטומים שנבחרו.
      הערה: מספר maxima/foci מופיעים כפולות של 255, קרי, אחד לכל היותר יש קריאה "RawIntDen" (צפיפות משולב) של 255.
    5. להעתיק את הערכים "RawIntDen" ולהדביק אותם לתוך תוכנה לניתוח נתונים.

2. ניתוח לוקליזציה אל מעבר לטווח ארוך כפול-גדיל דנ א

  1. תאי הזרע ב 96-ובכן צלחות/coverslips כמפורט בסעיפים 1.1 ו- 1.2.
  2. אינדוקציה של זוגיות-גדיל DNA מעברי
    1. Transfect תאים עם וקטור ביטוי-SceI באמצעות תגובה כימית השומנים מבוססי תקנים על פי מפרט היצרן. המתן 24-72 שעות לאחר תקנים על מנת למקסם את הביטוי endonuclease. לקבוע אם תרביות תאים הצליחה על-ידי איתור תאים עם דגש מיוחד במינו גדול גרעינית וγ-H2AX.
  3. רכישת תמונות
    1. לתקן את permeabilize, לחסום, לשטוף את הצלחת/coverslips 96-ובכן, כמתואר בסעיף 1.8.
    2. שיתוף דגירה תאים עם נוגדן נגד γ-H2AX החלבון תיקון עניין (כאן, נוגדן ראשוני נגד RAD51 שימשה) מדולל על פי מפרט היצרן בפתרון BSA 3%.
    3. לשטוף את 96-ובכן הצלחת/coverslips 3 פעמים עם 1 x PBS. דגירה של 96-ובכן הצלחת/coverslips עם נוגדנים משניים מדולל לפי הפרוטוקול של היצרן בפתרון BSA 3%. לאשר כי fluorophores המשני אין עירור חופפים או ספקטרום הפליטה.
    4. לזהות תאים בעלי דגש גדול גרעינית וγ-H2AX. רק תצלמי תמונות של תאים אלה כדי למנוע הטיה.
  4. ניתוח של טווח ארוך-SceI המושרה מוקדים
    1. לנתח את מוקדים לאורך זמן באופן ידני, על ידי ספירת מספר שני תאים גדולים וγ-H2AX מוקדים של מוקדים משותפת לשפות אחרות של החלבון תיקון עניין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג את מבחר האפליה רעש הנכון על כימות maxima/foci באמצעות ImageJ. התמונות הממוזגות של דאפי החלבון תיקון עניין נמצאים בלוח השמאלי. איור 1A מציג של אפליה רעש של 90, מסמן את המספר הנכון של מוקדים. גרעינים על הקצה (מתואר עם חץ ורוד), מוקדים מחוץ הגרעינים (מתואר עם חץ צהוב) אינם נספרים במהלך כימות. איור 1B מתארת סובלנות רעש נמוך של 50. Maxima רבים מזוהים מחוץ לגרעין, בתוך הגרעין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניתוח של ה-DNA נזק תיקון באופן כללי, תיקון כפול גדילי DNA מעברי במיוחד הוא אזור פעיל של מחקר מפני השלכותיה span tumorigenesis ל ביולוגיה בסיסית6,20. זו גישה במדויק מבתר את התרומה של RAD51 וγ-H2AX חלבונים עד הרזולוציה של DSBs באמצעות מר להסתכל קדימה, שיטה זו יכול לשמש כדי להבהיר פונקציות נוספות של תיקון חלבונים DSBs14פרטים כתב היד. ההשוואה של תיקון קינטיקה ועל הגיוס של תיקון מכונות DSBs אני-SceI המושרה בין תאים שליטה תאים עם החלבון עניין ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ג'ואל Sanneman, ד ר Philine Wangemann של גרעין מיקרוסקופ קונפוקלי, הממומן על ידי קנזס סטייט אוניברסיטת במכללה לרפואה וטרינרית, על תמיכתם של המאמצים לפתח טכניקה זו. pCBASceI הייתה מתנת Jasin מריה (Addgene פלסמיד # 26477) 30. תאים U2OS ד ר-GFP היו מתנה די מריה Jasin18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12 מ"מ CoverslipsVWR89015-725
16% Paraformaldehyde (PFA)ThermoFisher Scientific28908
צלחת 24 בארותVWR82050-892
צלחת תחתונה מזכוכית 96 בארותCellvisP96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488EMD Millipore05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10) טכנולוגיית איתות תאים8875S
תוסף פורמטים ביולוגיים עבור ImageJהמכון הלאומי לבריאות (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
אלבומין סרום בקר (BSA)VWR97061-416
DAPIThermoFisher ScientificD1306
DMEM, גלוקוז גבוהThermoFisher Scientific12100046
EDTAInvitrogen15576-028
סרום בקר עוברי (FBS)VWR89510-194
עיזים נגד ארנב IgG Alexa594ThermoFisher Scientific  א-11012 
מי חמצןסיגמא-אולדריץ'216763-100ML
ImageJ תוכנההמכון הלאומי לבריאות (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
SceI ביטוי וקטורAddgene26477
לק לציפורניים- אינסטה דריסאלי והאנסןמהיר בבירור (103)
פוספט חוצץ מלח (PBS)Bio BasicPD8117
ProLong Gold AntifadeReagent Life TechnologiesP36930
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 מ"ל
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049-500 מ"ל
TurboFect Transfection ReagentThermoFisher ScientificR0531
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  2. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
  3. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  4. Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
  5. Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
  6. Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
  7. Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
  8. Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
  9. Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501(2011).
  10. Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9(2012).
  11. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  12. Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
  13. Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
  14. D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
  15. Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
  16. Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
  17. Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
  18. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
  19. Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
  20. Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
  21. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687(2015).
  22. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
  23. Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957(2010).
  24. Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617(2017).
  25. Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
  26. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
  27. Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
  28. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237(2015).
  29. Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

I SceIGamma H2AXImageJ

מאמרים קשורים