מאמר שיטה

שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון ספקטרומטריית

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57660

⸱

29 ביולי 2018

 ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול לשיפור אותות יון פחמימות ספקטרומטריית MALDI על ידי מבנים גבישיים רפורמה במהלך תהליכי הכנה מדגם הוא הפגין.

תקציר

הכנת הדוגמא היא תהליך קריטי בניתוח ספקטרומטר מסה (MS) של פחמימות. למרות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) MS הוא שיטת הבחירה בניתוח פחמימות, יון המסכן הפארמצבטית אותות ונתונים של פחמימות דגימות ממשיכות להיות בעיות קשות. לניתוח כמותי של פחמימות, פרוטוקול אנליטי יעיל לספק איכות מעולה הנתונים יש צורך. וידאו זה מדגים דוגמת פרוטוקולים הכנה כדי לשפר את עוצמת האות ולצמצם את הנתונים וריאציה של פחמימות MALDI-MS. לאחר ייבוש, התגבשות של מדגם טיפות, המורפולוגיה קריסטל תוקן על ידי מתנול לפני ניתוח המוני spectrometric. שיפור פחמימות אות נבדק עם MALDI הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS). תוצאות ניסויית להראות כי קריסטל הרפורמציה התאמת מבנים גבישיים, מפזרת מחדש פחמימות analytes. לעומת שיטת הכנה droplet יבשים MALDI קונבנציונלי-MS, רפורמה מורפולוגיות קריסטל פחמימות עם מתנול מראה עוצמת האות טוב יותר באופן משמעותי, יון התמונה התפלגות נתוני יציבות. מאז הפרוטוקולים הפגינו בזאת אינן כוללות שינויים בהרכב לדוגמה, הם חלים באופן כללי על פחמימות שונים, מטריצות.

מבוא

ניתוח פחמימות הוא נושא חשוב ומאתגר. פחמימות ונגזרותיהם תפקיד חשוב לחיות אורגניזמים1,2,3. מולקולות אלה סיבכו מבנים, נוטים מתפרקים. רבים מהם לא יכול להיות ברור מאופיין בשל קשיים הפרדה וזיהוי. למרות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) ספקטרומטר מסה (MS) הוחלה על ניתוח של מגוון רחב של מולקולות, בשל הרגישות שלה תוצאות מובנים4, ניתוח פחמימות באמצעות MALDI-MS ממשיכה להיות אתגר גדול בשל היעילות יינון נמוכה של מולקולות כאלה5. Derivatization כימית היא דרך נפוצה כדי לשפר את יעילות יינון של פחמימות6,7, אבל הליכים כאלה הם לדוגמה לצרוך וזמן. חוץ מזה, היעילות יינון של פחמימות derivatized הוא עדיין נמוך מזה של חלבונים. לפיכך, בפיתוח שיטות לשיפור האות פחמימות MALDI-MS ללא פרוצדורות מסובכות הכרחי.

היישום של MALDI-MS כדי ניתוח כמותי הוא נושא מאתגר אחר. אחת הבעיות המרכזיות של MALDI-MS היא כי שלה הפארמצבטית רגישות ונתונים מסתמך באופן ביקורתי על מדגם הכנת פרוטוקולים ופרמטרים ניסיוני. במקרים רבים, ניתוח כמותי על-ידי MALDI-MS הוא לא אמין עקב מדגם הטרוגנית מורפולוגיות והפצה analyte. דוגמה ידועה היא דגימות המוכנים מטריצה (DHB) MALDI 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה. כאשר DHB הוא גיבש אט-אט תחת סביבת אמביינט, מידת השתלבות analyte מטריקס קריסטלים הוא בלתי צפוי, כי תוצאות דגימות הראו מורפולוגיות לא סדיר. דוגמאות כאלה בדרך כלל מורכב גבישים גדולים בצורת מחט, בסדר. כאשר DHB מוכנה תוך שימוש של ממס נדיף ו/או צלחת המדגם מחומם, תהליך ייבוש מהיר התוצאה קריסטלים בסדר הומוגנית יותר תוצאות כמותיות8,9,10. טכניקה זו ידועה בשם "recrystallization" של דגימות MALDI. השיפור מיוחס יותר תיאגוד analytes לתוך מטריצה בסדר קריסטלים במהלך תהליך התגבשות מהר. גם הראו כי התאמת הסביבה הכנה מדגם צמצם את הטרוגניות של פחמימות אות ושיפור תוצאות כמותיות11,12. הממצאים בעבודות אלה מראים כי מדגם המורפולוגיה היא גורם קריטי בקביעת איכות אות פחמימות. כדי לפתח אסטרטגיה כללית לניתוח יומי, שיטה הרפורמציה מדגם יעיל במתן פחמימות משופרת רגישות נדרש.

בחנו באופן שיטתי המתאם בין מדגם מורפולוגיה, פחמימות רגישות ב MALDI-MS דו ח זה התבצעה13. התוצאות שהושגו באמצעות כמה פחמימות חשובה, הצג מטריצות שיפור האות הטוב ביותר מתגשמת מאת recrystallizing מיובשים MALDI דגימות. המורפולוגיה של דגימות שהוכנו בשיטת רביב מיובשות קונבנציונליות (DD) תוקן על ידי recrystallization מהיר עם מתנול (MeOH). הפרוטוקולים הכנה מפורטת מדגם מודגמות כאן. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים, כולל מדגם פלייט preconditioning, דוגמת התצהיר, recrystallization, וניתוח ספקטרומטר מסה. הפחמימות שימוש כוללים sialyl-לואיס (מירה כהןA), maltoheptaose (MH). DHB משמש מודל מטריצה. התוצאות מציגות עוצמת האות פחמימות והפצה המרחבי השתפר בצורה ניכרת אחרי recrystallization. השיטה ניתן ליישם דגימות עם מטריצות פופולריים אחרים, כולל 2,4,6-trihydroxyacetophenone (תאפ) וα- cyano-4-hydroxycinnamic חומצה. שיטה זו משמשת בגישה כללית אשר ניתן לשלב בקלות בתוך השגרה מעבדה לניתוח פחמימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מדגם פלייט Preconditioning

  1. ניקוי של צלחת מדגם
    1. ללבוש nitrile כפפות כדי למנוע זיהום של צלחת מדגם במהלך הניקוי.
    2. יד-לשטוף הצלחת מדגם עם mL 100.0 בפתרון דטרגנט (1.0 mg/mL).
    3. יד-לשטוף הצלחת מדגם במים מזוקקים-יונים (DDW).
    4. לשטוף את המשטח צלחת מדגם mL 30.0 של MeOH.
    5. לשים. את הצלחת מדגם גביע 600 מ ל, מילוי עם DDW עד לצלחת מדגם מלא שקועה בתוך המים.
    6. לשים את הספל אולטרה סאונד אמבטיה (ראה טבלה של חומרים), sonicate את הצלחת מדגם למשך 15 דקות (200 W, 40 קילו-הרץ).
    7. להוציא לצלחת לדוגמה, לפוצץ את טיפות המים באמצעות חנקן בלחץ.
    8. להפקיד 0.2 µL של MeOH על הצלחת לדוגמה כדי לבדוק אם MeOH מתפשטת למקומות אחרים.
      הערה: אם MeOH מתמזג עם מקומות אחרים, חזור על השלבים 1.1.3-1.1.5; אם לא, המשך לשלב הבא.
  2. רגולציה של ייבוש קאמרית טמפרטורה
    1. השתמש תא ייבוש בתנאים יציב להתייבש טיפות, כפי שתואר לעיל11,12,13. בפרט, השתמש בהליך מפורט שתואר בשלבים 2.1-2.5 של Ou, י'-מ'. et al. 201612. בקצרה:
      1. לטהר את החדר הייבוש על-ידי חנקן בטמפרטורת החדר בספיקה קבועה כדי לשמור על סביבת לחות יחסית נמוך.
      2. לשמור על מדגם פלייט טמפרטורה קבועה רגיל - (25 ° C) או תנאים ייבוש מהיר (50 ° C), מוסדר על ידי גוש נחושת מבוקרי טמפרטורה בחדר הייבוש.
  3. אופן ההכנה של פתרונות מטריקס ו- analyte
    1. הכנה של מטריקס פתרונות
      1. להמיס DHB ב- 50% acetonitrile (לחצן מצוקה): 50% DDW להכין פתרון 0.1 M.
    2. הכנת analytes פחמימות
      1. להמיס מירה כהןA ב DDW להכין 10-4 פתרון מ'.
      2. להמיס MH ב DDW להכין ז 10-4 פתרון.

2. לטעום התצהיר ו- Recrystallization

הערה: ההליכים ממוטב עבור ניתוח קטן ורגיל כמויות של דגימות מתוארים כאן. ודא כי הטמפרטורה צלחת מדגם הוא התייצב על הטמפרטורה הרצויה לפני הפקדת את הפתרונות. אם המדגם משתרעת שטח גדול כדי לכסות במקומות אחרים דוגמת במהלך recrystallization, להכין מדגם חדש או חזור על שלב 1.1.

  1. לניתוח של כמות קטנה (0.1 µL) של מדגם
    הערה:     השלבים הבאים פותחו עבור משימותינו דוגמה והשעה. היא מתאימה לניתוח כמותי של דוגמאות אמיתיות עם כמות מוגבלת או IMS מהיר עבור ניתוח כימות.
    1. Premix µL 0.25 DHB פתרון ו 0.25 µL של מירה כהןA או פתרון MH צינור microcentrifuge.
    2. מערבולת הפתרון מעורבת באמצעות מערבל מערבולת 3 s.
    3. ספין למטה הפתרון מעורב ומפרידה מיני עבור 2 s (2000 x g).
    4. השתמש פיפטה כדי למשוך µL 0.1 של הפתרון מעורבבים מראש מיד להפקיד אותו בצלחת מדגם.
      הערה: בעת הפקדת כמות קטנה של דגימה, לא שים הפתרון מעורבבים מראש קצה פיפטה עבור למעלה מ- 10 s.
    5. המתן המדגם להתייבש. ייבוש פעמים טיפוסי מוצגים בטבלה 1.
    6. השתמש פיפטה להפקיד 0.2 µL של MeOH ימינה אל המקום דגימת יבשים. המדגם יהיה רטוב ויבש מיד.
      הערה: להבטיח כי התצהיר כשההליך יסתיים ב- 3 s כדי למנוע אידוי משמעותית אובדן MeOH.
    7. לבחון את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ. אם מורפולוגיות קריסטל אינם כמו שציפיתי (ראה איור 1 לדוגמה של התוצאות הרצויות), חזור על השלבים 2.1.1-2.1.6 להכין מדגם חדש.
    8. ללבוש את הכפפות nitrile, להוציא בזהירות את הצלחת דגימה מן החדר הייבוש.
  2. לניתוח כמות רגילה (1 µL) של מדגם
    הערה: השלבים הבאים מפותחים עבור למקסם ההומוגניות של פחמימות דגימות עם שימוש בדרך כלל כמות מדגם MALDI. התהליך מתאים שגרתית ו כמותני. תהליך recrystallization מפזרת מחדש מטריצות באופן שווה על אזורים גדולים יותר ודוגמאות.
    1. Premix 2.5 µL של פתרון DHB ו 2.5 µL מורן סלםA או פתרון MH צינור microcentrifuge.
    2. מערבולת הפתרון מעורבבים מראש עם מערבל מערבולת עבור 5 s.
    3. ספין למטה הפתרון מעורב ומפרידה מיני עבור 2 s (2000 x g).
    4. השתמש פיפטה כדי למשוך µL 1.0 של הפתרון מעורבבים מראש מיד להפקיד אותו בצלחת מדגם.
      הערה: לא להשתמש הנותרים premixed פתרון שוב לאחר הפקדת את הדגימות.
    5. המתן המדגם להתייבש. ייבוש פעמים טיפוסי מוצגים בטבלה 1.
    6. השתמש פיפטה להפקיד µL 1.5 של MeOH ימינה אל המקום דגימת יבשים. המדגם יהיה רטוב ויבש מיד.
      הערה: במקרים עם טמפרטורה צלחת מדגם גבוה (50 ° C), השלב recrystallization צריך להיעשות בתוך 5 s כדי למזער את אידוי MeOH בעצת פיפטה.
    7. לבחון את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ. אם מורפולוגיות קריסטל אינם כמו שציפיתי (ראה איור 1 לדוגמה של התוצאות הרצויות), חזור על השלבים 2.2.1-2.2.6 להכין מדגם חדש.
    8. ללבוש את הכפפות nitrile, להוציא בזהירות את הצלחת דגימה מן החדר הייבוש.

3. מסה ספקטרומטר נתוני הרכישה וניתוח

הערה: הניתוח מתבצע באמצעות מסחרית זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (טבלה של חומרים) מצוידים עם מקור יון MALDI. המכשיר מופעל על ידי תוכנת שליטה ספציפי (טבלה של חומרים) עם עיכוב מיצוי מיטבי מראש ואנרגיה לייזר. ספקטרה נרשמים במצב לינארי עם מגוון מסה m/z = 0 – 1500. הצלחת מדגם פוטנציאלי הוא ±25 קוו וכל ספקטרום חישוב ממוצע 10 יריות לייזר. המשתמשים צריכים לנהל כלי אופטימיזציה וניתוח מדגם באמצעות תוכנה תואם ובצע את ההוראות של יצרן כלי.

  1. פתח את תוכנת בקרת מכשיר (ראה טבלה של חומרים).
  2. הכנס את הצלחת מדגם ספקטרומטר מסה.
  3. בחר את שיטת רכישת נתונים ממוטבת מראש בתוכנה.
  4. להירשם האזור כל מדגם IMS שימוש בתוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: דלג על שלב זה אם לא עושה IMS.
  5. התחל הנתונים במצב אצווה של תוכנת שליטה.
  6. להתוות את התמונות יון שימוש בתוכנת הדמיה לאחר השלמת רכישת נתונים.
  7. נתח ספקטרום המונית באמצעות ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים) אם הנתונים מתועד ללא תמונה יון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תמונות SEM נציג של מירה כהןA מעורבב עם DHB המוכנים DD, שיטות recrystallization מוצגים באיור1. מורפולוגיה DHB טיפוסי כפי שהוכנו על ידי שיטת DD הוא גבישים גדולים בצורת מחט, rim, מבנים גבישיים בסדר במרכז נקודות דגימה. טיפוסי אורך כזה בגביש בצורת מחט הם ~ 100 מיקרומטר. אחרי recrystallization על ידי MeOH, הדגימה יש אזור גדול יותר אחיד מכוסה גבישי בשבב אבן דמוי משובחים. אורך הקריסטלים "פתית" הם בערך 20-50 מיקרומטר. Recrystallized דגימות לספק שטחים משטח י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לדוגמה הטרוגניות היא שבעיה מכרעת בדמוקרטיה. גברת MALDI הוא הכי נפוץ שיטת הכנה דגימה, אך הקריסטלים תוצאות מאוד הטרוגנית. דוגמאות כאלה מציגות הפארמצבטית נמוכה של אות ירה--ירייה, לדוגמה-כדי-sample. לכן, בחיפוש אחר "מתוק כתמים" באזורים דוגמת במהלך איסוף הנתונים הוא הליך נפוץ בניסויים MALDI. . הדגימות הטרוגנית כזה ומבניות על כימות בניתוח שגרתי

במחקר הנוכחי, מורפולוגיה מדגם MALDI ממוטבת על-ידי recrystallization. השיפור פחמימות אות עוצמה ויציבות נתונים על-ידי recrystallization מיוחס התאגדות משופרת בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים לא תודות לך

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנט
אבקת דטרגנטאלקונוקס242985
מתנולMerck106009
אצטוניטרילMerck100003
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB)AlfaAesar A11459
sialyl-lewis A (SLeA)Sigma-AldrichS1782
MaltoheptaoseSigma-AldrichM7753
קצות פיפטהמטלר טולדו17005091
צינור מיקרוצנטריפוגהAxygenMCT-150-C
<חזק>ציוד
Milli-Q מערכת טיהור מיםMilliporeZMQS6VFT1
כפפות ניטריל ללא אבקהMicroflexSU-690
600 מ"לדוראן2110648
מנקה אולטרסאונדדלתאDC300H
מד לחותWisewind5330
מד זרימת גז חנקןDwyerRMA-6-SSV
צמדים תרמיים מסוג KDigitron311-1670
מערבל וורטקסתעשיות מדעיות  SI-0236
מיני צנטריפוגהSelect BioProductsForce Mini 
פיפטהRaininpipet-lite XLS
סטריאומיקרוסקופאולימפוסSZX16
תא ייבוש לשליטה בטמפרטורהמעבדה זו Ultraflex
II TOF / TOF ספקטרומטר מסהBruker Daltonics
MTP 384 צלחת יעד פלדה מלוטשת BCBruker Daltonics8280781
Flexcontrol גרסה 3.4Bruker DaltonicsControl תוכנה
Fleximaging גרסה 2.1Bruker Daltonicsתוכנת הדמיה
Flexanalysis גרסה 3.4Bruker DaltonicsAnalysis תוכנה

מקורות

  1. Holme, D. J., Peck, H. Analytical Biochemistry. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).
  2. Costello, C. E. Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
  3. Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
  4. Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
  5. Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
  6. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
  7. Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
  8. Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
  9. Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
  10. Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
  11. Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
  12. Ou, Y. -M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409(2016).
  13. Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
  14. Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
  15. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MALDI

מאמרים קשורים