הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57664

⸱

13 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדור של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs) מ תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) החולה נגזר fibroblasts, הבידול של iPSCs באמצעות גזע mesenchymal (MSCs) תאי העצם, מידול vivo tumorigenesis באמצעות תאי העצם של החולה-derived הסימולטור.

תקציר

תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) היא הפרעת סרטן תורשתית אוטוזומלית דומיננטית. חולים עם הסימולטור הן נטייה סוג שונים של גידולים, כולל אוסטאוסרקומה--אחד הראשית בתדירות הגבוהה ביותר-המטולוגיות ממאירות ב הילדות וההתבגרות. לכן, הסימולטור מספק מודל אידיאלי ללמוד זה גידול ממאיר. ניצול של מתודולוגיות iPSC, אוסטאוסרקומה הסימולטור-הקשורים שניתן למדל בהצלחה על ידי הבחנה הסימולטור החולה iPSCs גזע mesenchymal (MSCs), ולאחר מכן תאי העצם, תאי המוצא לכל osteosarcomas. אלו תאי העצם הסימולטור מסכם את הדברים oncogenic מאפייני אוסטאוסרקומה, מתן מערכת מודל אטרקטיבי עבור בהתוויית בפתוגנזה של אוסטאוסרקומה. כתב יד זה מדגים את פרוטוקול לדור של iPSCs של הסימולטור fibroblasts החולה, הבידול של iPSCs כדי MSCs, הבידול של MSCs תאי העצם, ויוו tumorigenesis באמצעות הסימולטור תאי העצם. ניתן להרחיב מודל המחלה זה iPSC לזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות הקשורות הסימולטור אוסטאוסרקומה.

מבוא

בין 2006 ו 2007, מספר ממצאים פריצת דרך המעבדות של ד"ר Shinya יאמאנאקה, ג'יימס א. תומסון הוביל את הפיתוח של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs)1,2,3. על ידי התכנות תאים סומטיים עם גורמים תעתיק מוגדר שיש טופס iPSCs, החוקרים הצליחו לייצר תאים בעלי מאפיינים מרכזיים כלומר, pluripotency, התחדשות עצמית, אשר נחשב בעבר רק קיימים תאי גזע עובריים (hESCs). iPSCs יכולים להיווצר מכל אדם או חולה, לא היו צריכים להיגזר עוברי, במידה רבה להרחיב את הרפרטואר של מחלות זמין ורקעים לצורך המחקר. מאז, החולה, נגזר iPSCs שימשו כדי לסכם את פנוטיפ של מחלות אנושיות שונות, מחלת אלצהיימר4 ו נוירודגנרטיביות5 זמן QT תסמונת6,7, 8.

ההתפתחויות הללו במחקר iPSC גם נפתחו דרכים חדשות לחקר הסרטן. מספר קבוצות לאחרונה השתמשו iPSCs החולה מודל לפיתוח סרטן תחת הרקע הגנטי רגישים9,10,11, עם יישום מוצלח הפגינו לתאריך אוסטאוסרקומה9, לוקמיה10,11,12, סרטן המעי הגס13. למרות סרטן נגזר iPSC מודלים בחיתוליהם, הדגים פוטנציאל גדול ב phenocopying הקשורים למחלות ממאירות, שחקרתי מנגנונים פתולוגי, וזיהוי תרכובות טיפולית14.

תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) היא הפרעת אוטוזומלית דומיננטית סרטן תורשתית הנגרמת על ידי מוטציה germline TP53 15. חולים עם הסימולטור נטייה סוג שונים של ממאירות כולל אוסטאוסרקומה, שהופך iPSCs הסימולטור תאי נגזר שלהם במיוחד מתאים היטב ללמוד זה גידול ממאיר16. מודל מבוסס iPSC אוסטאוסרקומה הוקם לראשונה בשנת 2015 באמצעות הסימולטור החולה נגזר iPSCs9 לאחר מכן הבדיל לתוך גזע mesenchymal (MSCs), ואז על תאי העצם, שמקורם תאים של אוסטאוסרקומה. אלו תאי העצם הסימולטור מסכם את הדברים הקשורים אוסטאוסרקומה בידול osteogenic פגמים ומאפיינים oncogenic, הדגמת המודל פוטנציאליים כפלטפורמה "סרטן העצמות בצלחת". מעניין, ניתוחים ברמת הגנום transcriptome להציג היבטים של חתימה ג'ין אוסטאוסרקומה בתוך הסימולטור תאי העצם, זה תכונות של פרופיל ביטוי גנטי זה הסימולטור נמצאים בקורלציה עם פרוגנוזה גרועה אצל אוסטאוסרקומה9, המציין הפוטנציאל של הסימולטור iPSCs המחלה מודלים כדי לחשוף את התכונות של הרלוונטיות הקלינית.

כתב יד זה מספק תיאור מפורט של אופן השימוש הסימולטור החולה נגזר iPSCs כדי אוסטאוסרקומה מודל. זה מפרט את הדור של הסימולטור iPSCs, הבידול של iPSCs MSCs ולאחר מכן על תאי העצם, ושימוש ויוו xenograft מודל באמצעות הסימולטור תאי העצם. המודל המחלה הסימולטור כוללת מספר יתרונות, ובראשם את היכולת לייצר תאים ללא הגבלה בכל שלבי ההתפתחות אוסטאוסרקומה מחקרים מכניסטית, סמן זיהוי של סמים הקרנת9,14, 16.

לסיכום, המודל מבוסס iPSC אוסטאוסרקומה הסימולטור מציע מערכת משלים אטרקטיבי לקידום המחקר אוסטאוסרקומה. פלטפורמה זו מספקת גם הוכחה-של-קונספט דוגמנות סרטן באמצעות החולה נגזר iPSCs. אסטרטגיה זו המתוארת להלן ניתן להרחיב בקלות את מודל ממאירות הקשורות סרטן נטיות גנטיות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבודה זו אושרה על ידי אוניברסיטת טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון (UTHealth) חיה ועדת הרווחה. הניסויים מתבצעים בהתאמה קפדנית עם אמות המידה שנקבעו על-ידי המרכז UTHealth עבור רפואה מעבדתית חיה & טיפול (CLAMC) אשר הוסמך על ידי האגודה האמריקנית על מעבדה חיה על עצמך (AAALAC הבינלאומי). הנושאים האנושי במחקר זה נופל תחת תרחיש ("לא אנושית נושאי מחקר") כפי שהוגדרו על ידי התיעוד NIH SF424. לכן, זה לא צריך שום אישור על-ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי UTHealth.

1. דור של הסימולטור iPSCs (איור 1 א')

  1. ביום-2, לוחית רישוי 2 x 104 הסימולטור fibroblasts החולה לבאר אחת של צלחת 6-ובכן, ואת התרבות תאי פיברובלסט בינונית (טבלה 1) ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 מיכלים. ודא כי fibroblasts להגיע למפגש 50-60% ביום של התמרה חושית (יום 0).
  2. לבצע התמרה חושית סנדאי וירוס ביום 0. כדי לעשות זאת, החלף המדיום בילה פיברובלסט מראש ומחוממת בינוני. להפשיר את סנדאי מסחרי וירוס התכנות קיט (ראה טבלה של חומרים) על קרח. להדביק הסימולטור fibroblasts בווירוסים סנדאי מעורבים לפי הוראות היצרן.
  3. תחזוקה של התאים transduced במדיום פיברובלסט (יום 1-6):
    1. יום 1, 24 שעות לאחר התמרה חושית, להסיר את המדיום פיברובלסט המכיל וירוס סנדאי הנותרים ולהחליף אותו עם 2 מ"ל פיברובלסט טרי בינוני. תרבות של fibroblasts transduced-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 מיכלים.
    2. לשנות את המדיום עם המדיום פיברובלסט בכל יום אחר מיום 2-6.
  4. תחזוקה של התאים transduced מצב התרבות מזין (יום 7-28):
    1. להכין פיברובלסט עובריים בעכבר CF1 לקרינה (MEF) מנות תרבות ביום השישי. לעשות את המעיל הזה שש מנות תרביות רקמה 100 מ מ על-ידי הוספת 5 מ של 0.1% ג'לטין כל צלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות תשאף הג'לטין 0.1% לאחר ציפוי.
    2. הסר MEFs מיכל חנקן נוזלי. הפשרת MEFs באמצעות מערכת שהביקושים זמינים מסחרית ההוראות של היצרן. צלחת התאים על הלוחות מצופים ג'לטין MEF/MSC תרבות בינונית (טבלה 1)-צפיפות זריעה של סביב 6.7 x 105 תאים לכל מאכל תרביות רקמה 100 מ מ.
    3. לחסן את התאים transduced על צלחות MEF (יום 7): Trypsinize את התאים transduced באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל מנה 100 מ מ למשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר. לנטרל טריפסין עם 9 מ של פיברובלסט בינוני. העברת תאים חרוט צינורות ותאים צנטריפוגה ב g x 230 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 דק צלחת את fibroblasts transduced על המנות MEF שש מוכן ביום השישי, תרבות אותם ב 8 מ של פיברובלסט בינוני לכל תבשיל.
      הערה: confluency של MEFs הוא בסביבות 20% לפני זריעה על צלחות MEF תא transduced.
    4. ביום 8, למחוק את המדיום פיברובלסט ולהחליף hESC בינונית (טבלה 1).
    5. המתן עד הופעתה של שיבוטים iPS ימים 9-28 (איור 1C). מחליף המדיום hESC בילה כל יום אחרים ונטר את הופעתה של שב"ס שיבוטים מתחת למיקרוסקופ. לחכות שיבוטים iPSCs גדול מספיק כדי להיות שנצפו בעין בלתי מזוינת ותפעל להרחבת iPS שיבוטים במצב מזין ללא תרבות.
  5. הרחבה של שב"ס המתגלים שיבוטים במצב מזין ללא תרבות (יום 29-79 ~ 99):
    1. כדי להכין את הצלחת מצופים מטריצה, מעיל צלחת 48-ובכן עם 120 µL של קרום המרתף מטריקס ציפוי הפתרון (טבלה 1) לכל טוב. ודא כי הפתרון קרום המרתף מטריקס ציפוי מכסה הבאר וציפוי על פני התבשיל תרבות. להשאירו בטמפרטורת החדר במשך ה 1 וביופסיה הפתרון ציפוי מיד לפני השימוש ולהוסיף µL 250 hESC בינוני לכל באר עם 2 מיקרומטר רוק מעכבי Thiazovivin.
    2. ב- 28 יום, תשאף המדיום hESC בילה ולשטוף iPS שיבוטים עם 1 x DPBS. לאסוף שיבוטים iPS גלוי עם עצה פיפטה 1 מ"ל, העברת לבאר של צלחת 48-ובכן שטופלו (שלב 1.4.1). זרע מושבה אחת לכל טוב של צלחת 48-. טוב.
    3. Centrifuge את הצלחת ב g x 230 במשך 4 דקות להקל על הקובץ המצורף התא. תרבות שיבוטים iPS ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 מיכלים.
    4. למחרת (יום 29), להסיר את המדיום hESC בילה ולהוסיף 250 µL של המדיום iPSC זמינים מסחרית כל היטב.
    5. לשמור על שיבוטים iPS ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 מגשים, ושינוי המדיום iPSC בכל יום אחר.
    6. כאשר שב ס שיבוטים מגיעים למפגש 85%, תת-תרבות תאים ב- 1:10 יחס לפי אזור התרבות. הוסף µL 60 הפתרון passaging מסחרי לנתק את התאים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
    7. זרע מחצית iPSCs מנותק על קרום המרתף מצופים מטריצה 12-ובכן צלחת ב 1 מ"ל hESC בינוני עם 2 מיקרומטר רוק מעכבי Thiazovivin. תרבות iPS שיבוטים בצלחת 12-ובכן עם 1 מ"ל של המדיום iPSC זמינים מסחרית לכל iPSCs טוב, תת-תרבות בעשר: 1 יחס עד שיגיעו מעבר 10.
      הערה: iPSCs הם תת תרבותי כל 5-7 ימים ב- 1:10 יחס. זה לוקח עד 10 שבועות עבור שב"ס שיבוטים להגיע מעבר 10. אפיוני iPSC כולל תא מורפולוגיה, פעילות פוספטאז אלקליין (AP) הביטוי של גורמים pluripotency וסמנים hESC, יכולים להיבדק אחרי ההסרה של וירוס סנדאי iPSCs (בדרך כלל הפגינו אחרי בסביבות 10 מעברים) (איור 1B-E). נוגדן ומידע פריימר עבור אפיון iPSC כלולים בטבלה 2 ו- 4.

2. הבידול של הסימולטור iPSCs על גזע Mesenchymal (MSCs) (איור 2 א)

  1. תרבות iPSC שיבוטים על צלחות MEF לפחות 2 שבועות (היום ~-14-0): להכין את הכלים MEF (100 מ מ תרביות רקמה מנות) תיאר כאמור (1.3.1 - 1.3.2). לשמור על iPSCs בינוני hESC ושנה בינוני בכל יום אחר. בכל פעם iPSCs להגיע למפגש 90%, תת-תרבות iPSCs על ידי 1:10 דילול.
  2. הסרה של MEFs מ- iPSCs (יום 0):
    1. לאחר שמירה על iPSCs על MEFs עבור 2 שבועות, תרבות iPSCs במנות תרביות רקמה 100 מ מ עד תאים להגיע למפגש 80-90%. להסיר את המדיום hESC בילה ולשטוף iPSCs עם 5 מ של 1 x DPBS. להוסיף 1 מ"ל של הפתרון ניתוק התא כדי לנתק את התאים דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
    2. להוסיף 9 מיליליטר MEF/MSC תרבות בינוני הצלחת לנטרל את פעילות פתרון של ניתוק התאים ולהעביר את התאים מנותקת ל תבשיל חדש של תרביות רקמה 100 מ מ ללא ציפוי כלשהו.
    3. דגירה התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאפשר את MEFs לצרף הצלחת.
    4. בזהירות לאסוף את תגובת שיקוע אשר מכיל כעיגולים בצבע iPSCs, צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
      הערה: ברישול שטיפה בתחתית צלחת מוביל הניתוק של MEFs.
  3. הבידול של iPSCs כלפי MSCs (יום 0 - 28):
    1. מעיל משלוש בארות של צלחת 6-ובכן עם 1 מ"ל של 0.1% ג'לטין לכל טוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. הסר את תגובת שיקוע של iPSCs שנאספו 2.2.4.
    3. Resuspend iPSCs ב 6 מ של MSC בידול בינונית (טבלה 1), תאי זרע הבארות מצופה שלוש 2 מ לכל טוב (יום 0).
    4. לשנות את המדיום בידול MSC בכל יומיים כדי להסיר תאים כעיגולים בצבע ו/או מת (יום 1 - 28).
  4. ההבשלה של MSCs נגזר iPSC (יום 28-45):
    1. להסיר את המדיום בידול MSC בילה ולשטוף תאים עם 1 מ"ל של 1 x DPBS.
    2. Trypsinize MSCs 0.5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA לכל טוב בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
    3. לנטרל טריפסין מאת 1.5 מ של המדיום תרבות MEF/MSC ולאסוף MSCs משלוש בארות לתוך שפופרת אחת של חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
    4. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend MSCs ב- 3 מ"ל של MEF/MSC תרבות בינוני וצלחת בצלחת 60 מ מ 0.1% מצופי ג'לטין (28 יום).
    5. תרבות MSCs במדיום תרבות MEF/MSC ושנה בינוני כל יומיים. כאשר התאים להגיע 100% הנהרות, תת-תרבות MSCs ביחס של 1:3 באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA.
      הערה: MSCs להציג מורפולוגיה, כמו פיברובלסט (איור 2B). כאשר MSCs גדלים בצפיפות גבוהה, מוארך MSCs יכולים ליצור דפוס כמו מערבולת (איור 2B).
    6. לבצע ההכתמה immunofluorescent להעריך MSCs iPSC נגזר על ידי בחינת MSC סמני פני השטח CD44, CD73, CD105 ו- CD166 (איור 2C).
      הערה: הדילול של נוגדנים מוצגות בטבלה מס ' 2. צביעת immunofluorescent של תאים חיים מבוצעת על פי הוראות היצרן.
    7. לאחר אישור, הרחב MSCs ביחס של 1:3 במנות תרביות רקמה 100 מ מ. להקפיא את הבקבוקונים (3 מבחנות לכל מאכל תרביות רקמה 100 מ מ) תוך שימוש באמצעי קפוא המכיל דימתיל סולפוקסיד 10% ל- 90% FBS.
      הערה: כדי להעשיר את האוכלוסייה MSC, MSCs ניתן למיין בעזרת CD105+, CD24-קריטריונים מאת לזרום cytometry9,17. נגזר iPSC MSCs הבדיל באמצעות השיטה PDGF-AB מבוססי בדרך כלל יכול להישמר במשך 2-3 חודשים בתרבות ללא איבוד הזהות MSC9. להקפיא MSCs ממספר מעבר מוקדם לאחר שנוכח MSC מאפיינים.

3. הבידול של הסימולטור MSCs כדי תאי העצם (איור 3 א)

  1. הכנה של MSCs הבידול osteogenic (יום-1)
    1. להקפיד על כמות נאותה של תאים כדי להשלים את פרוטוקול בידול osteogenic, מתחילים עם MSCs תרבותי במנות תרביות רקמה 100 מ מ עד 95% הנהרות. להסיר את המדיום תרבות מבוזבז, לשטוף MSCs עם 5 מ של 1 x DPBS.
    2. Trypsinize MSCs עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל מנה 100 מ"מ בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות. כדי להבטיח שהתאים הם לא מעל trypsinized, להפסיק trypsinization כאשר 50% של הניתוק תא נצפית במיקרוסקופ.
    3. לנטרל טריפסין מאת 9 מיליליטר MEF/MSC תרבות בינוני ולאסוף MSCs 3 בארות לתוך שפופרת אחת של חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
    4. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend MSCs ב 5 מ של MSC בינוני, לספור את מספר התאים על ידי hemocytometer.
    5. צלחת תקין מספר MSCs על צלחת תרבות.
      הערה: הפירוט של מספרי הטלפון הנייד של צלחת 12-ובכן, 6 פלייט-טוב ומנות 100 מ מ תרביות רקמה מסוכמים בטבלה3.
  2. אינדוקציה של בידול osteogenic על ידי אוסטאובלסט בידול בינוני (ODM) (טבלה 1) (יום 0 - 24):
    1. תשאף MEF/MSC תרבות בינוני והחלף עוצמת הקול הנכון של ODM (1 מ"ל, 2 מ ל ו מ ל 8 עבור כל טוב של צלחת 12-. ובכן, כל טוב של תרביות רקמה 100 מ מ, ורוטב בצלחת 6-ובכן צלחת, בהתאמה) להבדיל MSCs כדי תאי העצם (יום 0).
    2. האחות ה-ODM בילה והחלף עוצמת הקול הנכון של ODM בכל יומיים במהלך תהליך התמיינות osteogenic.
    3. לבצע את phosphatase אלקליין (AP) ולומדים Alizarin האדום S (ARS) צביעת לזהות העצם-הקשורים phosphatase אלקליין מתוצרת preosteoblasts ומשקעים מינרליים המיוצר על ידי תאי העצם, בהתאמה, ביום 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, ו 24 ( איור 3B).
      הערה: AP מכתים, ARS מכתים מבוצעות באמצעות ערכת זמינים מסחרית ע פ הפרוטוקול היצרן.
    4. לבדוק את רמות הביטוי של סמנים אוסטאובלסט preosteoblast ובוגר (ALPL ו COL1A1 עבור preosteoblasts; PTH1R ו- BGLAP עבור מבוגרים תאי העצם) על ידי לרביעיית-PCR (איור 3C).
      הערה: AP חיובי מכתים צפוי אחרי יום 9 של בידול osteogenic, צביעת ARS חיובי ניתן לצפות לאחר 21 יום של בידול osteogenic. ניתן להגיש את MSCs גדל במדיום תרבות MEF/MSC פקד שלילי של AP מכתים, ARS מכתים.

4. המודל Xenograft ללמוד Tumorigenesis In Vivo של הסימולטור MSC-derived תאי העצם (איור 4A)

  1. בידול של MSCs הסימולטור תאי העצם:
    1. הזרע 3-4.5 x 105 MSCs בצלחת תרביות רקמה 100 מ מ. היכונו חמש מנות זריקה תת עורית אחת.
    2. תרבות MSCs ב ODM להבדיל MSCs כדי תאי העצם, כמתואר ב- 3.2 עד 14 יום.
  2. הכנה של תאי העצם הבדיל להזרקה תת–עורית:
    1. כדי להכין אוסטאובלסט ניתוק פתרון (טבלה 1), לפזר collagenase II סוג 1 g ב- 1,000 מיליליטר בינוני αMEM כדי להפוך את הפתרון השני collagenase (1 mg/mL). לשמור את הפתרון השני collagenase ב-20 ° C. לערבב 0.25% טריפסין-EDTA ולאפשר הפתרון השני collagenase ביחס של 1:1. תאי העצם ניתוק פתרון.
    2. להסיר את ה-ODM בילה ולשטוף הבדיל תאי העצם עם 5 מ של 1 x DPBS לכל מנה 100 מ מ.
    3. להוסיף 1.5 מיליליטר אוסטאובלסט ניתוק פתרון לכל מנה 100 מ מ, דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לבחון ולהבטיח הניתוק אוסטאובלסט באמצעות מיקרוסקופ.
    4. לנטרל את הפתרון ניתוק תאי העצם על ידי ODM ולאסוף את תאי העצם מנותקת צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    5. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בתאים 25 מ של ODM בינוני. עוברים את התאים דרך מסננת תא מיקרומטר 70 כדי להסיר תאים צבורים. לספור את מספרי הטלפון הנייד באמצעות של hemocytometer.
    6. היכונו תאי העצם7 עונה 1 פרק 10 לכל בזריקה תת עורית ותאים צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 ° C 4 דקות.
    7. Resuspend של תאי העצם7 עונה 1 פרק 10 ב 50 µL קר כקרח 1 x DPBS. מיקס הבדיל תאי העצם עם 50 µL של קרום המרתף חינם פנול אדום מטריקס (מטריקס הבולם, קרום המרתף, מעורבים ביחס של 1:1 תאי העצם) ולשמור על תאי העצם על הקרח לפני ההזרקה.
  3. In vivo xenograft הגידול דגם של הסימולטור MSC-derived תאי העצם:
    1. עזים ומתנגד בן שבוע 8 NU/NU נקבה עכברים immunocompromised בחדר הספקת איזופלוריין 5% (v/v) בשאיפה ב- 1 ליטר/דקה של חמצן (שסופק על-ידי CLAMC). לאחר שבעל החיים הופך שכיבה, לעבור את מערכת משלוח הרדמה קונוס האף, אספקת 2% (v/v) בשאיפה איזופלוריין ב 200mL/min של חמצן (שסופק על-ידי CLAMC). נטר את העומק של הרדמה על ידי בדיקת הרפלקסים הקרנית, פדלים כדי להפוך העכברים הם מרדימים מספיק ואני לא סובלים אי נוחות במהלך ההליך.
    2. לחטא את האזור להיות מוזרק עם מטליות לסירוגין של אלכוהול איזופרופיל chlorhexidine ו- 70%. השתמש 26 גרם מחט כדי לבצע הזרקה תת עורית של קרום המרתף מעורב-מטריקס הסימולטור תאי העצם לתוך צד אחד של הרגליים האחוריות של עכברים NU/NU immunocompromised (איור 4A) בן שבוע 8.
    3. לפקח על עכברים על-ידי ביצוע מישוש שבועי באתרי הזרקה לצמיחה של צפיפויות קשרי תת עורית. היווצרות הגידול יכול להיות שנצפו בסביבות 6-10 שבועות לאחר ההזרקה (איור 4B).
    4. המתת חסד העכברים בשיטה חנק פחמן דו-חמצני, ואחריו נקע בצוואר הרחם. לנתח גידולים מפותחים. לקבוע הגידול כיתה בידול אינדקס, preosteoblasts, ואת תאי העצם בוגרת באמצעות שיטות שונות מכתימים (למשל Hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת אדום סיריוס Picro מכתים, פון Kossa מכתים בהתאמה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מציג את ההליכים לרבות הסימולטור iPSC הדור, MSC בידול, בידול אוסטאובלסט ויוו tumorigenesis assay באמצעות הסימולטור MSC-derived תאי העצם.

ערכת לדור של הסימולטור iPSCs מ fibroblasts באמצעות וירוס סנדאי זמינים מסחרית התכנות ערכת מוצג איור 1A. מבוסס סנדאי וירוס משלוח של הגורמים יאמאנאקה ארבע היא שיטה התיכנות ללא שילוב. לכן, שיבוטים iPSC הסימולטור יציב צריך להיות ללא גנום הוירוס סנדאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי להשיג יעילות גבוהה יותר של בידול MSC, מספר היבטים הם קריטיים. אחת היא התנאי התרבות של iPSCs לפני ביצוע MSC בידול. פרוטוקול שהוצג בחוברת מתבסס על מחקרים קודמים 9,17. iPSCs צריך להיות בתרבית על MEFs לפחות 2 שבועות. שמירה על iPSCs טובים תנאים על MEFs הם קריטיים עבור תאים לצרף בצלחת מצופים ג'לטין לקבלת MSC בידול. היבט חשוב נוסף הוא הצפיפות של iPSCs על MEFs לפני בידול. 80 - 90% confluency של iPSCs היא העדיפה ליזום MSC בידול. יתר של iPSCs יפגום הישרדות cell במהלך ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

ר צ נתמך על ידי חדשנות UTHealth עבור סרטן מניעה מחקר הכשרה תוכנית Pre-Doctoral לאגודה (מניעת סרטן, טקסס של מכון המחקר להעניק RP160015). ג'יי. טי נתמך על-ידי התוכנית לין הקי של האוניברסיטה הראשונה המזוהה עם בית החולים של סון יאט-סן. ד-F.L. המלומד CPRIT בחקר הסרטן, נתמך על ידי NIH השביל המוביל אל העצמאות פרס R00 CA181496 ו- CPRIT פרס RR160019.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כלי פלסטיק
100 מ"מ430107
60 מ"מ430166
12 בארותפלקון353043
48 בארותפלקון353078
1 מ"ל טיפ פיפטארה"ב סיינטיפיק1111-2721
200 ומיקרו; L טיפ פיפטארה"ב סיינטיפיק1111-0706
10 ומיקרו; L Pipet TipUSA Scientific1111-3700
5 מ"ל פיפטה סרולוגיתSARSTEDT86.1253.001
10 מ"ל פיפטה סרולוגיתSARSTEDT86.1254.001
25 מ"ל פיפטה סרולוגיתSARSTEDT86.1685.001
צינור 50 מ"ל, PPSARSTEDT62.547.100
צינור 15 מ"ל, PPSARSTEDT62.554.100
<חומרים וריאגנטים חזקים>תרבית חזקה
CytoTune- iPS 2.0 ערכת תכנות מחדש של סנדאיInvitrogenA16517ערכת תכנות מחדש של וירוס סנדאי
מסחרית קורנינג hESC מטריקס מוסמךקורנינג354277מטריצת ממברנת מרתף
CF1 MEFs, מוקרןThermoFisherA34180
DMEMסיגמא-אולדריץ'D5671
DMEM/F12קורנינג10-090-CV
α MEMCorning10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368מסחרי iPSC בינוני
נוקאאוט DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
החלפת סרום נוקאאוטThermoFisherA3181502
פניצילין-סטרפטומיציןSigma-AldrichP4333
MEM חומצות אמינו לא חיוניותקורנינג25-025-CI
תמיסת L-גלוטמיןSigma-AldrichG7513
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M3148
FGF-בסיסי אנושי (bFGF)PEPROTECH100-18B
רקומביננטי אנושי PDGF-ABPEPROTECH100-00AB
&בטא;-גליצרופוספטסיגמא-אולדריץ'G9422
דקסמתזוןסיגמא-אולדריץ'A4902
חומצה אסקורביתסיגמא-אולדריץA5960
תמיסת מלח פוספט של דולבקו, 1x (DPBS)קורנינג21-031-CV
StemMACS פתרון מעבר XFMiltenyi Biotec130-104-688פתרון מעבר מסחרי
Accutatse תמיסת ניתוק תאיםקורנינג25-058-CIתמיסת ניתוק תאים
תיאזוביבין (מעכב ROCK)Calbiochem420220
0.25% תמיסת טריפסין-EDTAסיגמא-אולדריץ'T4049
קולגנאז, סוג II   ThermoFisher17101015
נוגדן NANOG אנושיR& D SystemAF1997
OCT4 נוגדן (H-134)Santa Cruzsc-9081
אדם/עכבר SSEA-4 נוגדן מצומד PER& D SystemFAB1435P
Alexa Fluor 555 עכבר אנטי אנושי TRA-1-81 אנטיגןDB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 חמור נגד עזים IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 עיזים נגד ארנב IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE עכבר אנטי-אנושי CD105eBioscience12-1057-42
FITC עכבר אנטי אנושי CD44DB Biosciences555478
PE עכבר אנטי אנושי CD73DB Biosciences550257
PE עכבר אנטי אנושי CD166DB Biosciences560903
FITC עכבר אנטי אנושי CD24DB Biosciences555427
סרום חמורג'קסון ImmunoResearch017-000-121
סרום עיזיםJackson ImmunoResearch005-000-121
ערכת צביעת פוספטאז אלקליין IIStemgent00-0055
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
TRIzol ReagentThermoFisher15596018
כלורופורםThermoFisherC298-500
2-פרופנולThermoFisherA416-4
אתנול, אבסולוט, ביולוגיה מולקולרית ThermoFisherBP28184
DNase I, ללא RNase (1 U/µ L)ThermoFisherEN0521
iScript cDNA ערכת סינתזהBioRad1708891BUN
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708884
מטריצת מטריג'ל ריכוז גבוה (HC),354262קורנינג
מזרק קצה החלקה 1 מ"ל, 26 מד x 5/8 אינץ'DB Biosciences309597
צלחת פלקון 353046 צלחת צלחת ' ללא פנול-אדום

מקורות

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  4. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  5. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  6. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  7. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  8. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  9. Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
  10. Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
  11. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  12. Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  13. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
  14. Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
  15. Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
  16. Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
  17. Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
  18. Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

iPSCS
מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.