הבדיקה זיהום צמח: ריסוס, בתיווך הפצע חיסון עם הפתוגן של צמח Magnaporthe Grisea

סיכום

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לבדוק התקפה אלימה צמח עם המחלה צמח Magnaporthe grisea. דוח זה לתרום הקרנת בקנה מידה גדול pathotypes של פטריות מבודד, לשמש נקודת התחלה מצוינת להבנת מנגנוני עמידות הצמחים במהלך ההתרבות מולקולרית.

תקציר

צמחים בעלי מערכת חזקה כדי להגן על עצמם מפני איומים פוטנציאליים על ידי פטריות פתוגניים. בצמחים חשוב בחקלאות, אולם, אמצעים הנוכחי כדי להלחם פתוגנים כאלה הוכיחו שמרן מדי, לכן, לא מספיק יעיל, והם יכול העלול להוות סיכונים סביבתיים. לכן, זה הכרחי מאוד כדי זיהוי המארח-התנגדות גורמים כדי לסייע מחלות השליטה באופן טבעי דרך זיהוי עמיד germplasm, הבידוד, אפיון גנים עמידות ו רבייה מולקולרית של הזנים עמיד. בהקשר זה, יש צורך להקים שיטה מדויקת, מהירה, בקנה מידה גדול חיסון להתרבות ולפתח גנים עמידות צמחים. האורז הפיצוץ תסמיני המחלה חמורה של גורם Magnaporthe grisea פטריות פתוגניות, תשואות הפסדים. לאחרונה, מ grisea התפתחה אורגניזם מודל לומד את המנגנונים של אינטראקציות צמח-פטריות פתוגניות. לפיכך, מדווחים על התפתחות הצמח התקפה אלימה מתודת בדיקה ספציפית עבור grisea מ'. שיטה זו מספקת חיסון בתרסיס עם השעיה conidial וגם ופצעו חיסון עם קוביות תפטיר או טיפות השעיה conidial. השלב מפתח של שיטת חיסון wounding אורז מנותק עלים הוא לעשות פצעים על עלי הצמח, הנמנעת כל הפרעה הנגרמת על ידי המארח חדירה ההתנגדות. זה ספריי ופצעו פרוטוקול תורמת הקרנת מהירה, מדויקת, בקנה מידה גדול pathotypes של grisea מ' מבודד. זה משולב, משיטת ההדבקה צמח שיטתית ישמש נקודת התחלה מצוינת להשגת פרספקטיבה רחבה של סוגיות פתולוגיה.

מבוא

הפיצוץ אורז, הנגרמת על ידי מ grisea, היא אחת המחלות הכי רציני אורז הזנים ברחבי העולם^1,2. התהליך שבאמצעותו מ grisea מדביק צמחים פונדקאים כולל ייצור conidia, מצורף משטח, נביטה conidia עם היווצרות appressorium, היווצרות של חדירה פג ובידול hypha זיהומית, ולהפיץ מחלה ³. כל השלבים האלה שכיחים אצל רבים אחרים צמח פתוגניים פטריות, ומונעת, ואכן, מצור. על כל שלב בודד הזיהום של צמחים פונדקאים. בשל החשיבות הכלכלית שלה, גנטי ללקוחות שלנו, מ grisea התפתחה אורגניזם מודל לומד את המנגנונים של צמח-פטריות פתוגניות אינטראקציות^1,4. לכן, לימוד הבסיס המולקולרי של אלה שלבים התפתחותיים מ grisea יעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס פטריות פתוגניות וזיהוי של המועמד גנים היעד של ההקרנה, עיצוב הרומן קוטלי פטריות⁵.

דיווחים אחרונים בנוגע grisea מ זיהום התמקדו המנגנונים המולקולריים של שלבי טרום חדירה, במיוחד את conidiation, היווצרות appressorium, את היתדות חדירה ואת הצמיחה זיהומיות^{3, 6}. לכן חיוני לפתח פרוטוקול מפורט לבדיקת זיהום grisea מ' . במסמך זה, אנו מציגים שיטה מפורטת עבור בדיקת זיהום אשר מנצל מבחני זיהום בתיווך ספריי עם השעיה conidial, את חיסון של פצעים עם תקעים mycelial של grisea מ'. בדו ח זה, הפרוטוקול מתמקד התרבות של זנים, הכנת הפתרון conidiation ריסוס, חיסון בתיווך הכנס mycelial של צמחים עם grisea מ'. שלבים אלה מתוארים פירוט בהמשך, ומבט סכמטית מציג את זרימת העבודה כולו של השיטה, פצע אופייני מוצגות דמויות 1 ו- 2, בהתאמה.

פרוטוקול

1. ספריי חיסון עם השעיה של Conidia מ grisea

1. תרבות פטרייתי M.grisea
   1. היכונו המדיום תרבות שיבולת שועל אגר (OTA) עגבניות זני פטריות.
   2. שוקל 30-50 גר' שיבולת שועל, להוסיף את זה לרשימת 800 מ ל מים מזוקקים/יונים (ddH₂O), מרתיחים את התערובת למשך 30 דקות בסיר חשמלי.
   3. סנן את המיץ שיבולת שועל מבושלים לתוך כשהספל דרך פיסת גזה.
   4. להוסיף 150 מ של מיץ עגבניות, 20 גר' אגר פילטרט של במיכל ולהוסיף ddH₂O עד 1,000 מ ל.
2. הכנה של חומרים ניסיוניים
   1. להשרות כ-50 זרעים של אורז (אורז sativa) לדבורי Lijiangxintuan-heigu (LTH) ב- ddH₂O עבור בתלת-ממד או להשרות כ-50 זרעי שעורה (מבטיח הזהבשעורה מצויה cv) ב- ddH₂O עבור 1 י.
   2. עוטף את זרעי שעורה או אורז גזה, לנבוט אותם על נייר סינון לח ב 30 צלחות פטרי בקוטר של 10 ס"מ על 10 ס"מ ב 28 º C. הפעם נביטה של זרעי אורז בערך 2-3 d, הפעם נביטה של זרעי שעורה הוא בערך 2 d. הלחות היחסית בחממה הוא כ-70%.
   3. לשתול את שתילי אורז או שעורה בעציצים באמצעות אדמת השתילה והשקיית בלוק, ואז לכסות אותם עם שכבה של ורמיקוליט.
   4. מקום הצמחים מתאימים חממה או צמיחה ארון 25 ° c כ 1 ~ 2 שבועות.
   5. לחתוך 3 שכבות של נייר סינון במעגלים עם מספריים כירורגיים סטרילי (כל מעגל צריך להיות בקוטר של 8 ס מ) ומניחים אותם על גבי צלחות פלסטיק סטרילית 100 מ מ.
   6. להוסיף ddH₂O כל מנה להשרות נייר הסינון.
   7. ודא שהנייר מסנן רטוב לחלוטין אך להוסיף מים נוספת.
   8. הסר את כל המים העודפים עם משאבה ואקום.
   9. מניחים 2 קיסמים סטרילי לתוך המנה תרבות כדי לתמוך את האורז/השעורה עלים; מרחב הקיסמים ~ 2-3 ס מ זו מזו.
   10. לאסוף את העלים של האורז 2 שבועות לאחר זורעים את הזרעים או לקחת עלי השעורה 7 d לאחר זורעים את הזרעים.
   11. באמצעות 4 כדי 6-עלים-שתילים אורז/שעורה, חותכים את החלק התחתון של הגזע ~ 5 ס מ מהחלק העליון ולאסוף את העלים.
3. פרוטוקול חיסון בתרסיס
   1. תרבות הלחץ פטרייתי על הצלחות OTA חממה ברים, מערכות אינסטלציה (25 ° C) עבור d ~ 4.
   2. הוסף ~ 2 מ"ל של ddH₂O שימוש של 0.5 - פיפטה 5 מ"ל כל צלחת בת 4 יום.
   3. ללולאה חיסון, לגרד את תפטיר של המתח פראי-סוג grisea מ' , המתח מוטציה לתוך תפטיר פסולת.
   4. לאסוף את הלכלוך תפטיר, להעביר אותו צלחת חדשה OTA. לוקחים את פסולת תפטיר מכה יבשה על הספסל נקי.
   5. מכסים את הצלחת עם 3 שכבות של גזה כדי להבטיח את הלחות הדרושים לצמיחה של conidia בחממה ב 25 ° C ביום (14 h), 23 ° C בלילה (10 h) במשך 24-48 שעות.
   6. להוסיף 2 מ"ל של ddH₂O כל מנה, לגרד את conidia בעדינות עם ספוגיות כותנה סטרילי ואחריו סינון דרך 2 שכבות של נייר העדשה. יש להיזהר לא לגרד את פני השטח של המדיום תרבות.
   7. להעביר את המתלים conidia לתוך צינור 50 מ עם פיפטה µL 100-1, 000.
   8. צנטריפוגה למשך 5 דקות לכל הפחות של g x 5,000 ב 25 º C.
   9. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר להיכנע 2 x 10 conidia⁴ לכל מ"ל 0.025% (v/v) פתרון Tween-20. הפתרון Tween-20 הוא בדרך כלל בערך 10-20 מ.
   10. שופכים את המתלים נבג לתוך ריסוס ידניים.
   11. עיקור בערך 10 מ"ל של ההשעיה conidial על גבי העלים אורז של אורז בת שבוע 2 שתילים או שעורה עלים של שתילי שעורה בן יום-7, דגירה אותם 25 ° c בחדר חשוך, לח עבור ה ~ 24 ספריי הצמחים שליטה 0.025% (v/v) פתרון Tween-20.
   12. להעביר את העלים לתא לח עוד תחת אור ניאון 25 ° c עבור photoperiod של 12 שעות.
   13. להקליט את תסמיני המחלה ב 5 d לאחר חיסון. בדוק על להבי אורז חולה/שעורה ~ 6 ס מ אורך. האבחון הסטנדרטי לפי מערכת התוצאות להתנגדות הפיצוץ של מכון המחקר אורז הבינלאומי (IRRI). הפרטים של מערכת התוצאות להתנגדות הפיצוץ מוצגים בטבלה 1.
   14. לצלם את העלים כדי להעריך את הזיהום של זנים שנבדקו. הזיהום נאמד על ידי מספר נגעים לכל 3.6 ס מ².

2. ופצע חיסון עם קוביות תפטיר או טיפות השעיה Conidial של grisea מ

1. באמצעות המחט האנטומי של, לגרד שלושה פצעי ארוך 2-3 ס מ של הוורידים העיקריים של אורז מנותק/שעורה עלים; . שמור על עצמך לא לחדור את העלים.
2. לשים את העלים שרוטים קיסמים, ספריי של 0.02% (v/v) פתרון Tween-20 על העלים כדי ליצור שכבה של טיפות.
3. חותכים פקק mycelial 0.5 ס מ x 0.5 ס מ עבור כל זן מ grisea (המשלים פראי-סוג, מוטציה, זנים, או זנים אחרים מבחן) של צלחת OTA.
4. לשים את אטמי mycelial או µL 25, טיפות השעיה conidial אל הפצועים משאיר דגירה העלים 25 ° c בחדר לחים עבור d 3-8.
5. בדוק נגעים ב 5-7 d לאחר חיסון. שיטת הבדיקה היא זהה בשל שיטת חיסון בתרסיס (ראה שלב 1.3.13).
6. לבחון על להבי אורז חולה/שעורה ~ 6 ס מ אורך ולצלם אותם כדי להעריך את הזיהום של זנים שנבדקו. הזיהום נאמד על ידי מספר נגעים לכל 3.6 ס מ².

תוצאות

זרימת העבודה כולו הטכניקה מוצג באיור1. מבחני זיהום הצמח בוצעו על שתילי אורז רגישים בת 14 יום (או סאטיבה cv CO-39) או רגישים שעורה בן יום-7 עלים (מבטיח הזהבמצויה ה cv)^7,8,9. לבדיקת זיהום על העלים אורז, השעיה conidial (1.0 x נבגים⁵ 10/mL) של המתח פראי-סוג grisea מ P131, המתח מוטציה של מחיקה Com1 היו מוכנים, ריססו אז. חשבוני עלה 14 ...

דיון

גנים עמידות למחלות צמחים תפקיד חיוני במניעת זיהומים על ידי פתוגנים, כולל פתוגנים ופטריות^1,12. אורז הפיצוץ שימש כמודל להבין את טבעם של פתוגן האוכלוסייה מבנים, וכן לזיהוי צמח ההתנגדות גנים⁴. לכן, יש צורך לבחון את המחלה ההתנגדות גנוטיפ ואת avirulence אחרים של הזנים העיקריים של צמחי חקלאות בקנה מידה גדול כדי לזהות צמחים עמידים למחלות, כי יכול להיות מעובד באופן רציף. יתר על כן, היתרונות של avirulence אחרים של שדה פתוגנים מחייבים את חלוקת רציונל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נייר סינון	מותג GE Healthcare (שוודיה)
10311387 צינור 50 מ"ל	קורנינג (אמרסיה)	430290
צנטריפוגה	אפנדורף (אמרסיה)	5804R
צלחת תרבית	תרמופישר (אמרסיה)	150326
0.5-5 מ"ל פיפטה	אפנדורף
4920000105 100-1000uL פיפטה	אפנדורף	4920000083
משאבת ואקום	Leybold	D25B
מחט דיסקציה	FST	26000-35
חממה	MEMMERT	PYX313
טבעת חיסון	גריינר ביו 731175