הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

9.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57685

⸱

7 ביוני 2018

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine, 2Interdepartmental Graduate Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.

תקציר

הגידול חסין microenvironment (זמן) לאחרונה הוכר כמתווך קריטי של תגובה לטיפול בגידולים מוצקים, במיוחד עבור immunotherapies. התפתחויות אחרונות קליניים חיסוני מדגישות את הצורך שיטות לשחזור לאפיין במדויק וביסודיות הגידול, שלה לחדור המערכת החיסונית המשויך. עיכול אנזימטי הגידול וניתוח cytometric זרימה מאפשרים אפיון רחבה של קבוצות משנה תא החיסון הרבות פנוטיפים; עם זאת, וניתוח מעמיק לעיתים קרובות מוגבל fluorophore הגבלות על לוח עיצוב את הצורך לרכוש דגימות הגידול גדול להתבונן אוכלוסיות החיסון נדירים של ריבית. לכן, פיתחנו שיטה תפוקה גבוהה ויעילה עבור הפרדת ומעשירה הגידול לחדור המערכת החיסונית של הרכיבים הלא-החיסון הגידול. הגידול שתואר לעיכול, הפרדה צנטריפוגלית המבוסס על צפיפות הטכניקה מאפשרת אפיון נפרדים של הגידול, הגידול לחדור המערכת החיסונית שברים המשמרת את הכדאיות הסלולר ואני לפיכך, מספק אפיון רחבה של הגידול מצב אוטואימונית. בשיטה זו נעשה שימוש כדי לאפיין את מקיף המרחבי המערכת החיסונית הטרוגניות בגידולים מוצקים, אשר בהמשך מדגים את הצורך טכניקות פרופיל אוטואימונית עקבי כל הגידול. בסך הכל, שיטה זו מספקת טכניקה יעילה וישימה עבור אפיון אוטואימונית תת עורית מאתר גידולים מוצקים; ככזה, כלי זה יכול לשמש כדי לאפיין טוב יותר את התכונות tumoral אוטואימונית, בהערכה פרה של הרומן אסטרטגיות immunotherapeutic.

מבוא

הזמן מדכאים לאחרונה הוכר סימן היכר של סרטן, וידוע לשחק תפקיד משמעותי התפתחות, התקדמות והגנה של גידולים מוצקים סרטן, כמו גם להמתיק את הרגישות חיסוני1. הזמן מורכב של מספר קבוצות משנה הסלולר של הפנוטיפים, אשר כולם לספק תובנות קריטי למדינה אוטואימונית של הגידול. אלה קבוצות משנה אוטואימונית יכול להיות מרובדת יותר לתוך תאים של לימפוציטים או מיאלואידית המוצא, אשר יחד מהווים את הרוב של תגובות חיסוניות מולדת, גמישים,2,3. ההתקדמות בתחום חיסוני סרטן הראו כי אסטרטגיות immunotherapeutic (קרי, מעכבי המערכת החיסונית במחסום, chimeric אנטיגן קולטן תאי-T, וכו ') יש פוטנציאל לגרום סרטן עמיד regressions; עם זאת, הם נשארים יעיל יחסית גידולים מוצקים-סרטן-4,-5. קבוצות רבות הראו המשוכה קריטי כי הזמן יכול לשחק על טיפול הצלחה6,7, לפיכך, נותר צורך להעריך במדויק את immunotherapies החדש בהגדרת קליניים במיוחד התמקדות שלהם היכולת לווסת או להתגבר על הזמן8.

המאמצים הנוכחיים כדי לאפיין את הזמן בדרך כלל לנצל או מיקרוסקופ או לזרום cytometry יחד עם נוגדן תיוג אסטרטגיות כדי לזהות קבוצות משנה התאית החיסונית שלהם תכונות9,10. אלה שתי אסטרטגיות לספק מידע שונים ייחודי, כמו מיקרוסקופ מאפשר הערכה המרחבי של קבוצות משנה הסלולר cytometry זרימה מספק תפוקה גבוהה, כימות רחבה של שינויים סלולריים. למרות השיפורים בפלורסנט אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס אופטימיזציה של מערכות הדמיה ספקטרלי, אשר כעת יכול לתמוך עד 7 פרמטרים, גודל לוח מוגבל מקשה רחבה רמת החיסון פרופיל, ובכך טכניקה זו היא לעתים קרובות שמורות יותר ממוקד ניתוחים. כתוצאה מכך, cytometry זרימה נשאר באחת החיסון הנפוצה ביותר. פרופילים טכניקות. למרות השימוש הנרחב שלה באפיון זמן, השיטות המשמש לעיבוד של צביעת הן משתנה מאוד. בדרך כלל פרוטוקולים לנצל את גידול בריא אנזים (קרי, collagenases, DNase, וכו) שיטות דיסוציאציה ידנית כדי להשיג את המתלים מתא בודד, ואחריו נוגדן מכתים וניתוח7. למרות היתרונות של כל אחת מהשיטות, קבוצות רבות הראו ההשתנות נרחב זה יכול להיגרם באמצעות טכניקות אלה11. זה עושה השוואות קרוס-מחקר של גידול microenvironment פרופיל קשה מאוד, גם כאשר הערכת המודל מאתר הגידול באותו. יתר על כן, שיטות אלה מספקים פוטנציאל מוגבל כדי להעריך את תאי הגידול, הגידול החיסון לחדור רכיבים באופן עצמאי, שכן שני הרכיבים הם וביניהם לאחר עיכול. כמות הדגימה מגביל ואז רב הפאנל מכתים וניתוח, אשר הופך להיות נושא מרכזי כאשר מנסים לאפיין קבוצות משנה אוטואימונית נדירה (קרי, הגידול הספציפי תאי-T)12. טכניקות מאוחרים יותר כגון cytometry המונית או cytometry מאת שעת הטיסה (CyTOF), מאפשרים ניתוח פנוטיפי גבוהה-ממדי הסלולר קבוצות משנה עם כמה מערכות תמיכה לוח עיצובים של יותר מ 42 פרמטרים עצמאיים13. למרות הכוח העצום של טכנולוגיה CyTOF פרופיל החיסונית, נותר מוגבל בשל ההוצאות, ניתוח מומחיות, גישה לציוד. בנוסף, פרוטוקולים CyTOF רבים ממליצים על טיהור של קבוצות משנה המערכת החיסונית כדי לשפר את יחס אות לרעש14, ועל כן אנו מציעים כי שיטת העשרה שלנו יכול לשמש הזרם של CyTOF ניתוח לשיפור איכות הנתונים.

במסמך זה אנו מתארים של גידול microenvironment לעיכול, ניתוח בשיטה המשלבת הגידול החיסון לחדור ההפרדה. מטרת שיטה זו היא לאפשר תפוקה גבוהה עצמאית פרופיל של הגידול לחדור המערכת החיסונית ואת הגידול שברים הסלולר עבור אפיון רחבה יותר של microenvironment הגידול. באמצעות שיטה זו, רחוק נדגים את החשיבות של ביצוע ניתוח כל הגידול, כמו דוגמנית גידולים מוצקים תת עורית נמצאה משמעותי הטרוגניות אוטואימונית מרחבית. בסך הכל, שיטה זו באפשרותך יותר מדויק ועקבי להשוות בין מדגמים כי זה מעשיר את מערכת החיסון התאית קבוצות משנה בתוך הגידול ומאפשר בניית פרופיל עצמאית של גידול תאים ושברים המערכת החיסונית של הגידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ביילור לרפואה.

1. הגידול הקציר ועיכול

הערה: הזמן הדרוש הקציר הוא ~ 3-5 דקות/גידול, ואת הזמן הדרוש לעיבוד הוא ~ 1 h + 2-3 דקות/גידול.

  1. המתת חסד עכברים על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני, לרסס כל העכבר למטה עם אתנול 70% לפני הקציר כדי למנוע זיהום שיער. בניתוח להסיר גידולים תת עורית של העכברים ולהבטיח כי הגידולים הם ללא כל רקמות מזהמים (קרי, שיער, עור, הצפק, וכו '). מקם כל הגידול 1.8 מ של מדיה RPMI-1640 הבסיס ללא סרום שור עוברית (FBS) לתוך צלחת 24-. טוב. לאסיפים גדול יותר, לשמור על צלחות קר על קרח כדי לשמר את הכדאיות הסלולר.
    הערה: אם נדרשת עקרות, כל הגידול והניתוחים תצטרך להתבצע באבטחה ארון עם כלי ניתוח סטרילי (קרי, מספריים, מלקחיים, וכו '), וכן צעדים נוספים. גידולים בקוטר הארוך בין 0.5 - 1 ס מ אופטימלית, גידולים גדולים יותר או קטנים יותר ידרוש שינוי קנה מידה של ריאגנטים.
  2. להשתמש במספריים לחתוך הגידולים בתוך פחות מ 1 מ"מ3 חתיכות בתוך כל טוב.
  3. הכינו 10 x קוקטייל לעיכול על ידי המסת collagenase אני ב- 10 מ"ג/מ"ל, collagenase הרביעי 2,500 U/mL, ו DNase. אני ב- U/mL 200 בתקשורת RPMI-1640 בסיס (ללא FBS).
    הערה: קוקטייל העיכול ניתן להכין יום מראש, המאוחסנים ב-20 ° C; עם זאת, אחסון ממושך לא מומלץ כי אנזימים תאבד את הפעילות לאורך זמן פעם התפרקה.
  4. להוסיף 200 µL של 10 x דיסוציאציה קוקטייל המכיל collagenase, collagenase הרביעי ואני DNase I כל טוב עם החלקים3 1 מ מ.
  5. לאפשר את הדגימות לעיכול עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועדת קלות במהירות של 60-100 סל ד באמצעות של שייקר צלחת מסלולית.
    הערה: העלאת טמפרטורה ל- 37 ° C במהלך עיכול אנזימטי עלול לגרום להפעלת תא החיסון.
  6. לאחר 1 h, לנטרל את התגובה על-ידי הוספת 1 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 בתוספת EDTA FBS ו- 2 מ מ 5% על כל טוב.
  7. Pipette העיכול הגידול ואת החלקים הנותרים של הגידול לתוך מסננת תא 40 µm יושב על גבי שפופרת צנטרפוגה 50 מ.
    הערה: חותכים את הטיפ ממני טיפ פיפטה 1 מ"ל להעברה קלה של עיכול הגידול כדי מסננת.
  8. להשתמש מכנית disaggregate החלקים הגידול דרך מסננת פומפה מזרק 10 מ"ל. מעת לעת לשטוף את מסננת עם 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם (המכילה 5% FBS) וחזור עד מסננת התא היא ברורה של הגידול.
    הערה: כ- 4-10 מ"ל של מדיה סה כ צריך להיות מספיק כדי שלמאחה לשטוף את מסננת של הגידול.
    הערה: במקום דוגמאות על הקרח עד להשלמת שלב זה עבור כל הדגימות לשמר את הכדאיות הסלולר.
  9. התאם כל שפופרת צנטריפוגה 50 מ ל אותו אמצעי אחסון באמצעות התקשורת RPMI-1640 שהושלם.
    הערה: ההתאמה של אמצעי חיוני לאיזון צנטריפוגה. דילוג על שלב זה יכול לגרום נזק צנטריפוגה או פציעה אישית.
  10. Centrifuge את המתלים תא (5 דקות, 805 x g, 4 ° C), למחוק את supernatants, וכן להשעות מחדש ב- 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם.
    הערה: צבירה תא שעלול להיווצר בעקבות צנטריפוגה שקשה resuspend. שימוש בסיסמה פיפטה 5 מ"ל סרולוגית לערבב במהירות לשבור אותה. לפני שתמשיך.

2. הפרדה בין שברים התאית החיסונית ואת הגידול

הערה: הזמן הנדרש עבור שלב זה הוא כ 1 h.

  1. להוסיף 3 מ"ל של צפיפות בינונית מעבר הצבע התחתון של שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. להכין, תווית מספיק צינורות עבור כל גידול.
  2. שכבת mL 2 של גידול התא השעיה על המדיום הדרגתיות צפיפות מאת pipetting לאט לאט במורד צינור כדי למנוע ערבוב של שתי השכבות.
  3. בזהירות המקום הצינורות בשכבות צנטריפוגה, ספין בשביל 20 דקות ב 805 x g, 20 ° C, עם בלי בלמים.
    הערה: חשוב מאוד לוודא איזון נאות ולהבטיח כי בלי בלמים משמש במהלך צנטריפוגה. כל הפרעה של תהליך זה יביא שכבת ערבוב, התאוששות מלאה מדגם יהיה קשה.
  4. להעביר בזהירות את הגידול שחדר ליקוציט (TIL) שכבה של השכבה העליונה מדיה לרכבת התחתית 15 mL החדש באמצעות פיפטה של העברת. למחוק את כל שאר צפיפות בינונית הדרגתיות, resuspend בגדר גידול בתחתית הצינורית ב 2 מ של RPMI-1640 שהושלם.
    הערה: לאחר צנטריפוגה יהיו ארבע השכבות הגלויות מלמעלה למטה המקבילים בהתאמה: מדיה, הפדגוגי, צפיפות בינונית הדרגתיות, גידול התא גלולה. ראה איור 2א לקבלת דוגמה של הרבדים השונים.
  5. Centrifuge TIL את שניהם, דגימות הגידול ב להפריד בין צינורות (5 דקות, g x 805, 4 ° C) ולמחוק את תגובת שיקוע.
  6. Resuspend המדגם TIL ב- 200 µL, בגדר גידול ב- 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם. לשמור על הקרח כדי לשמר את יכולת הקיום.

3. ציפוי ולא מכתים

הערה: הזמן הדרוש ציפוי הוא s 30/גידול; הזמן הנדרש עבור צביעת משטח הוא 1 h; הזמן הנדרש עבור צביעת תאיים הוא 40 דקות; הזמן הנדרש עבור ניתוח cytometry זרימה הוא 1 - 4 דקות/גידול.

  1. להכין וסופרת לוחית התווית 96-ובכן U-תחתון עבור כל החיסון צביעת לוח, צלחת נוספת עבור תא.
    הערה: בדרך כלל, שלושה לוחות מוכנים סה כ: צלחת לוח ממוקדות לימפוציט צלחת מיאלואידית ממוקד לוח, צלחת ספירת תאים.
  2. Aliquot המתלים תא בודד לתוך כל ההכתמה פאנל צלחות ונפח קבועים המשקולת ספירה.
    הערה: הצלחת לספור משמש כדי לחשב את המספר הכולל של תאים יתווספו כל לוח מוכתמים, ובכך לאפשר מדויק של האוכלוסייה ספירת. Cytometer זרימה עם יכולות דיגום וניתוח volumetric צלחת 96-ובכן יכול לספק את מספר התאים לכל µL בכל מדגם, לכן, לחשב את מספר התאים שיתווספו כל לוח מכתימים. לוחות ספירת ניתן לרכוש למחרת לאחר קיבוע בין לילה ב 4 ° C, שטיפה עם FACs מאגר (buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 2% FBS), ו resuspending בנפח קבוע של מאגר FACs.
  3. לשטוף את התאים פעמיים עם µL 200 תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עבור דגימה על-ידי צריך שתוציאו (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) ומחיקת את תגובת שיקוע בין כל שטיפה להסרת כל FBS חינם.
  4. להוסיף 50 µL של גוש Fc, לערבב את הדגימות באמצעות פיפטה רב ערוצית ולאחר תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
  5. להוסיף 50 µL של 2 x מרוכז נוגדן מיקוד חוץ-תאית, תערובת הכתם הכדאיות ניתן לתיקון, לערבב בעזרת פיפטה רב ערוצית ולאחר תקופת דגירה של 30 דקות בחושך RT או 4 ° C.
    הערה: התנאים מכתימים המדויק הנוגדן תלויים להוראות היצרן. דילולים צביעת כל חייב להיות DPBS, עם אין FBS נוספה כדי למנוע הרוויה של לצבוע הכדאיות ניתן לתיקון. נא עיין טבלה של חומרים/ציוד דילולים אופטימלית של הפאנל מכתימים בשימוש כתב היד הזה. נוגדן ואת הכדאיות שניתן לתקן צביעת פתרון מוכן-ריכוז 2 x כדי לספק 1 הסופי x מכתים ריכוז ב 100 µL הנפח הכולל צביעת כאשר הוסיף את הבלוק Fc.
  6. לשטוף את הדגימות פעמיים עם FACs מאגר מאת צריך שתוציאו (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) ומחיקת את supernatants בין כל שטיפה.
  7. Resuspend ב µL 200 1 x פיקסציה/permeabilization פתרון, דגירה בין לילה ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    הערה: הניסוי ניתן להשהות למשך הלילה בנקודה זו: לשמור דגימות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
  8. למחרת, centrifuge הלוחות (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) וזורקים את תגובת שיקוע.
  9. לשטוף פעם עם µL 200 1 x permeabilization מאגר, צנטריפוגה (5 דקות, g x 805, 4 ° C), ולמחוק את תגובת שיקוע.
  10. להוסיף 100 µL 1 x נוגדן תאיים מרוכז מכתימים ' בחלונית ' מוכן במאגר permeabilization 1 x, תקופת דגירה של 30 דקות בחושך RT או 4 ° C (זה תלוי המלצות מכתימים מהיצרן).
  11. שטיפה פעם עם 1 x permeabilization מאגר (5 דקות, 805 x g, 4 ° C), למחוק את תגובת שיקוע ולאחר שטיפה פעם שניה עם FACs מאגר (PBS עם 2% FBS).
  12. Resuspend את הדגימות ב µL 300 FACs מאגר (PBS עם 2% FBS), להעביר את הדגימות צינורות cytometry זרימה, ולבצע ניתוח cytometry זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות שלנו להפגין היתרון המשמעותי של TIL ההפרדה של רכיבים שאינם-החיסון הגידול, כפי שהוסבר בפרוטוקול. בנוסף, באמצעות השיטה המתוארת נדגים את הטרוגניות אוטואימונית משמעותית של גידולים מוצקים הוקמה.

בעיה משמעותית עם טכניקות רבות של דיסוציאציה הגידול הוא אובדן יכולת הקיום לדוגמה, לרוב כתוצאה תנאים קשים לעיכול (קרי, מוגבה טמפרטורות, אספקת מזונם לקוי, וכו '). שימוש בשיטת עיכול המתואר, עם או בלי צפיפות העשרה בינוני ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הזמן מורכב מרכיבי התא מגוונות ומורכבות ומולקולות. ממצאים אחרונים מעידים כי אפיון מדויק של סביבה זו יכולה לספק הבנה טובה יותר של הטיפול הצלחה או כישלון, יכול אפילו לעזור לזהות את מנגנוני ההתנגדות טיפולית. לדוגמה, הגדלת רמות intratumoral של תאים שונים לדיכוי המערכת החיסונית (קרי, MDSCs, תאי T רגולטוריים, וכו ') ניתן להמתיק את תגובות מערכת החיסון אפקטור, ביטל תופעות immunotherapeutic. מצד שני, נוכחות intratumoral הגוברת של אפקטור אוכלוסיות מערכת החיסון (למשל, גידול ספציפי CD8 + T תאים, תאים רוצח ט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

JMN מאשר תמיכה כספית מ הלאומית המכון של כללי למדעי הרפואה (T32GM088129), נבחרת המכון של שיניים ותחקיר ואסטתיים (F31DE026682) של מכוני הבריאות הלאומיים. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים. פרויקט זה גם נתמך על ידי Cytometry התא מיון הליבה ביילור לרפואה במימון NIH (P30 AI036211 P30 CA125123, S10 RR024574) ואת הסיוע מומחה של ג'ואל מ Sederstrom.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זכר בן 6 עד 12 שבועות C57BL/6 עכבריםמעבדת ג'קסון עכברים המשמשים במחקרי הגידול שלנו
קו תאי סרטן סינגני של עכברים MEERנרכש ממשתף פעולה N/AE6/E7 אנטיגן HPV המבטא קו תאי אפיתל סרטן שקדים עכבריים 
70% אלכוהול איזופרופיל EMD Milipore PX1840
ערכת כלים כירורגיים לעכבריםWorld Precision InstrumentsMOUSEKITבעיקר צריך מספריים, פינצטה ואזמל. 
צלחת 24 בארות דנוויל סיינטיפיק בע"מT1024או כל צלחת תחתונה שטוחה עם 24 בארות. 
RPMI-1640 מדיהSigma-AldrichR0883
קולגנאז I EMD Milipore234153
Collagenase IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNase I Sigma-Aldrich11284932001
שייקר מסלולי במהירות נמוכהBioExpress (ספק: Genemate) S-3200-LSאו כל שייקר מסלולי. 
חממה מווסתת חוםפישר סיינטיפיק13-255-27או כל חממה אחרת מווסתת תרמית
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 מ"ל פיפטה וטיפיםEppendorf13-690-032או כל פיפטה וטיפים אחרים
40 um מסנני תאיםפישר סיינטיפיק22363547
צינורות צנטריפוגה 50 מ"לדנוויל סיינטיפיק בע"מC1062-P
15 מ"ל צינורות חרוטייםדנוויל סיינטיפיק בע"מC1012
10 מ"ל מזרק Luer-Lok ללא מחטיםBD309604
שיפוע צפיפות לימפורפ בינוניSTEMCELL Technologies7811
העברת פיפטותדנוויל סיינטיפיק בע"מ.P7212
96 בארות U-bottom לוחותדנוויל סיינטיפיק בע"מ.
DPBSסיגמא אולדריץ' D8573
FoxP3 סט מאגר צביעה של גורם שעתוק ThermoFisher Scientific00-5523-00מאגר תיקון/פרמביליזציה ומאגר פרמביליזציה
צנטריפוגה מווסתת חוםEppendorf 5810 R
Attune NxT זרימה ציטומטרThermoFisher ScientificN/Aלספירת נפח תאים 96 באר 
עכברוש מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (בלוק BD FC של עכבר)  שיבוט 2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc Block
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים כחולים לתיקון, לעירור UVThermoFisher ScientificL34962כתם כדאיות ניתן לתיקון
CD45 נוגדן חד שבטי (30-F11), APC-eFluor 780 ThermoFisherScientific47-0451-80
TCR בטא נוגדן חד שבטי (H57-597), APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8 ואלפא; נוגדן (KT15), PEסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-53473 
נוגדן חד-שבטי CD4 (GK1.5), PE-ציאנין5ThermoFisher Scientific15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) נוגדן חד-שבטי (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
CD11c נוגדן חד-שבטי (N418), PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4/80 נוגדן חד-שבטי (BM8), eFluor 450ThermoFisher Scientific48-4801-80
CD11b נוגדן חד שבטי (M1/70), APCThermoFisher Scientific17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) נוגדן חד שבטי (RB6-8C5), PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) נוגדן חד שבטי (MIH5), PE-Cyanine7ThermoFisher Scientific25-5982-80
CD273 (B7-DC) נוגדן חד שבטי (122), PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Ki-67 נוגדן חד שבטי (B56), BV711BD Biosciences563755

מקורות

  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
  5. Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106(2016).
  6. Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
  7. Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
  8. Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
  9. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
  10. Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  11. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  12. Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
  13. Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
  14. Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
  15. Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD45
העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.