כאן נתאר שיטת מדרגיים, באמצעות שילוב פשוט של Activin A ו- Id1 בתיווך lentivirus-ביטוי, כדי ליצור אבות לב שדה דמויי הלב הראשון וחדרית דמוי cardiomyocytes מתאי גזע pluripotent אנושי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדור של כמויות גדולות של pluripotent האנושי פונקציונלי תאי גזע-derived לב אבות, cardiomyocytes הלב מוגדרים שדה המקור הוא מהווה דרישה מוקדמת עבור טיפולים לב מבוססת תא ומודלים המחלה. אנחנו לאחרונה הראו כי מזהה גנים הדרושים והן מספיקות לציין אבות הראשון של שדה לב במהלך הפיתוח חוליות. פרוטוקול בידול זה ממנף את הממצאים הללו ומשתמש Id1 ביטוי בשילוב עם Activin כמו רמזים ציון חזק כדי לייצר הראשון הלב כמו שדה (FHF-L) אבות. חשוב, וכתוצאה מכך אבות להבדיל ביעילות (~ 70-90%) לתוך cardiomyocytes דמוי חדרית. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת ליצירה 1) hPSCs Id1 overexpressing 2) להבדיל כמויות מדרגי של אבות FHF-L cryopreservable חדרית דמוי cardiomyocytes.
מבוא
ייצור בקנה מידה גדול של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs)-נגזר לב אבות, cardiomyocytes זה מהווה דרישה מוקדמת עבור טיפולים מבוססי תאי גזע1, מחלת מידול2,3 ואפיון מהירה הרומן משעולים ויסות בידול לב4,5,6 , פיזיולוגיה7,8. למרות מספר מחקרים9,10,11,12,13,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. Id1 וירוס והכנה זיהום
- צור Id1 lentivirus overexpressing על ידי שיתוף transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G, pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: פלסמיד #107735) לתוך התאים HEK293T. לאסוף חלקיקי נגיפי, filtrate, לטהר מ תגובת שיקוע, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס כמו קיטאמורה. et al. (2003) 19. לחלופין, לייצר מסחרית Id1 lentivirus על-ידי שליחת pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR ליצרן לייצר lentivirus.
התראה: אנא עקוב אחר תקנות הבטיחות lentiviral ופרוטוקולים סטנדרטיים מבצע.
הערה: חשוב: כייל נוגדנים אופטימלית וירוס צריך להיות לפחות 108 עד 109 Transducing יחידות/mL (טו/mL). - לפני ההדבקה, מעיל אחד טוב של צלחת טוב 96 עם ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דור של hPSCs Id1 קווים
hPSCs נגוע lentivirus תיווכה ביטוי Id1 (איור 1א'). ברגע hPSCId1 נוצרים, transgene ביטוי לכמת על ידי לרביעיית-PCR (איור 1B). רק hPSCId1 שורות לבטא Id1 mRNA ברמות גדול מ- 0.005 קיפול של GAPDH צריך לשמש עבור בידול.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Differentiations מוצלח, ודא לעקוב מקרוב אחר ההוראות המפורטות לעיל. בנוסף, כאן אנחנו מדגישים פרמטרים מרכזיים אשר משפיעים מאוד על תוצאות בידול. לפני שמתחילים הבחנה, להתייחס הפרמטרים הבאים מורפולוגי שלושה: מורפולוגיה גזע של hPSCsId1, דחיסה גבוהה הסלולר ועל זרימה גבוהה (> 90%) של התרבות ביום 0. בהקשר הזה, תנאים אופטימליים בידול נוצרים בצורה הטובה ביותר על ידי ציפוי הפומבית hPSCsId1 כמו תאים בודדים, המאפשר להם טופס בחוזקה התקבצו monolayers לגדול כדי הנהרות ~ 90% במהלך 2-3 ימים. לעומת זאת, אם hPSCId1.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים חברי המעבדה קולה לדיונים מועיל, ביקורות קריטי של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי NIH/NIEHS R44ES023521-02, CIRM DISC2-10110 מעניקה ד ר קולה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן ACTC1 | Sigma | A7811 | |
| Activin A | טכנולוגיות תאי גזע | Hu Recom Activin A | |
| אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית (אנטי) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| תוסף B27 ללא אינסולין | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| תוסף B27 ללא ויטמין A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| נוגדן CDH5 | R& D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | מגיב לשימור בהקפאה |
| DMEM גלוקוז גבוה | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS עם Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| ערכת פוטנציאל ממברנה FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | לרכישת פוטנציאל פעולה אופטית, עיין ב-McKeithan et al. 2017 |
| החלפת סרום נוקאאוט | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, גורם גדילה מופחת | Corning | 356231 | ציפוי ריאגנט |
| mTeSR1 ערכת מדיה | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & מ"ג | קורנינג | 21-040-CV | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | ג'יבקו | ||
| פורומיצין | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | מגיב דיסוציאציה ללא אנזים |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| נוגדן TAGLN | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | מעכב מסלול RHO/ROCK |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X מגיב דיסוציאציה המכיל אנזים |
| Tyrodes תערובת תמיסות חבילות | Sigma | T2145-10X1L | (לרכישת פוטנציאל פעולה אופטית, עיין ב-McKeithan et al. 2017) |
מקורות
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
