הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57688

⸱

19 ביוני 2018

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן נתאר שיטת מדרגיים, באמצעות שילוב פשוט של Activin A ו- Id1 בתיווך lentivirus-ביטוי, כדי ליצור אבות לב שדה דמויי הלב הראשון וחדרית דמוי cardiomyocytes מתאי גזע pluripotent אנושי.

תקציר

הדור של כמויות גדולות של pluripotent האנושי פונקציונלי תאי גזע-derived לב אבות, cardiomyocytes הלב מוגדרים שדה המקור הוא מהווה דרישה מוקדמת עבור טיפולים לב מבוססת תא ומודלים המחלה. אנחנו לאחרונה הראו כי מזהה גנים הדרושים והן מספיקות לציין אבות הראשון של שדה לב במהלך הפיתוח חוליות. פרוטוקול בידול זה ממנף את הממצאים הללו ומשתמש Id1 ביטוי בשילוב עם Activin כמו רמזים ציון חזק כדי לייצר הראשון הלב כמו שדה (FHF-L) אבות. חשוב, וכתוצאה מכך אבות להבדיל ביעילות (~ 70-90%) לתוך cardiomyocytes דמוי חדרית. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת ליצירה 1) hPSCs Id1 overexpressing 2) להבדיל כמויות מדרגי של אבות FHF-L cryopreservable חדרית דמוי cardiomyocytes.

מבוא

ייצור בקנה מידה גדול של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs)-נגזר לב אבות, cardiomyocytes זה מהווה דרישה מוקדמת עבור טיפולים מבוססי תאי גזע1, מחלת מידול2,3 ואפיון מהירה הרומן משעולים ויסות בידול לב4,5,6 , פיזיולוגיה7,8. למרות מספר מחקרים9,10,11,12,13,14,15 יש שתואר קודם לכן יעיל ביותר פרוטוקולים בידול לב hPSCs, אף אחד לא שלח המקור תחום הלב של cardiomyocytes וכתוצאה מכך, למרות הזיהוי של הבדלים משמעותיים מולקולרי בין שמאל (שדה הלב הראשון) ימינה (שדה הלב השני) cardiomyocytes חדרית16 וקיומו של הלב ספציפיים לשדה מחלות לב מולדים; קרי, שמאלי תסמונת17 או arrhythmogenic דיספלזיה חדרית18. לפיכך, הדור של לב אבות, cardiomyocytes ממוצא שדה מוגדר הלב של hPSCs הופך להיות הכרח כדי להגביר את הרלוונטיות שלהם כמו טיפולית ומחלות כלי מידול.

פרוטוקול זה מסתמך על ביטוי המכונן של Id1, שזוהה לאחרונה5 הראשון לב ציון שדה רמז אשר בשילוב עם Activin A, הן חיוני ומספיק ליזום cardiogenesis ב hPSCs. ראוי לציין, קנינגהם. et al. (2017) 5 מראים כי אבות Id1-induced במיוחד להביע בשדה הלב הראשון (HCN4, TBX5) אבל לא שני סמנים לב שדה (SIX2, ISL1) כפי הם עוברים התמיינות הלב. בנוסף, המחברים גם מראים כי עוברי העכבר הטרנסגניים חסר לכל המשפחה מזהה של גנים (Id1-4), לפתח ללא ויוצרים הראשון הלב שדה לב אבות, בזמן (אבות לב המדיאלי, אחורי נוסף לב השדה השני) יכולים ליצור עדיין, ובכך רומז כי מזהה חלבונים חיוניים ליזום הראשון הלב שדה cardiogenesis ויוו. בנוחות, אבות הנוצרות על-ידי Id1 יכול להיות cryopreserved, להבדיל באופן ספונטני לתוך cardiomyocytes הצגת מאפיינים כמו חדרית, כולל ביטוי סמנים ייחודיים חדרית (IRX4, MYL2), פוטנציאל פעולה כמו חדרית.

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה, וניתן להרחבה כדי ליצור הראשון הלב כמו שדה (FHF-L) אבות לב וחדרית דמוי cardiomyocytes מתוך Id1 overexpressing hPSCs. תכונה חשובה של פרוטוקול זה הוא האפשרות לנתק לב דור מייצור cardiomyocyte הבאים באמצעות צעד הקפאה קריוגנית נוח. לסיכום, פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הדרושים (1) ליצור hPSCs Id1 overexpressing (2) ליצור את אבות לב FHF-L מ- hPSCs, (3) cryopreserve אבות וכתוצאה מכך, (4) לחדש את הבידול לב FHF-L וצור מאוד מועשר (> 70-90%) להכות cardiomyocytes דמוי חדרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Id1 וירוס והכנה זיהום

  1. צור Id1 lentivirus overexpressing על ידי שיתוף transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G, pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: פלסמיד #107735) לתוך התאים HEK293T. לאסוף חלקיקי נגיפי, filtrate, לטהר מ תגובת שיקוע, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס כמו קיטאמורה. et al. (2003) 19. לחלופין, לייצר מסחרית Id1 lentivirus על-ידי שליחת pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR ליצרן לייצר lentivirus.
    התראה: אנא עקוב אחר תקנות הבטיחות lentiviral ופרוטוקולים סטנדרטיים מבצע.
    הערה: חשוב: כייל נוגדנים אופטימלית וירוס צריך להיות לפחות 108 עד 109 Transducing יחידות/mL (טו/mL).
  2. לפני ההדבקה, מעיל אחד טוב של צלחת טוב 96 עם 50 µl של ציפוי ריאגנט, בדרך כלל תערובת חלבונים כמו ג'לי, מופרש על ידי Engelbreth-הולם-נחיל העכבר סרקומה תאים (ראה טבלה של חומרים).
  3. מביצועם טוב אחד של גזע pluripotent גדל לתוך צלחת טוב 6 על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS ללא Ca2 + ו- Mg2 + ועם 0.5 מ מ EDTA.
    הערה: זמן דיסוציאציה נע בין 3 – 10 דקות. כאשר יותר מ- 80% של התאים הם צמודי קרקע מהחלק התחתון של הלוח, המשך לשלב הבא.
  4. לאסוף תא הבולם עם pipet סטרילי לתוך צינור פלסטיק צנטריפוגה 15 מ"ל.
  5. לנטרל דיסוציאציה מגיב עם 5 מ של Ca המכילות PBS2 + ו- Mg2 +.
  6. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה (200 גרם x במשך 3 דקות).
  7. להסיר את תגובת שיקוע וחבוט בעדינות את הצינור כדי לסלק את גלולה.
  8. להשעות מחדש תאים 1 מ"ל של תאי גזע מדיה.
  9. לספור תאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית בעקבות הוראות הספק.
  10. צלחת 20,000 התאים קיימא לכל מצופה היטב (96-ובכן צלחת) 50 µL של תאי גזע מדיה בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב (ראה טבלאות 1 ו- 2).
  11. לאחר 24 שעות, לפקח על התא מצורף ולהחליף מדיה עם 100 מדיה תאי גזע µl, בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב ו 6 ng/mL hexadimethrine ברומיד (ראה טבלאות 1 ו -2), h אחד לפני זיהום lentiviral.
    הערה: תאים צריך להיות מחובר היטב לתחתית של הצלחת.
  12. הפשרת Id1-lentivirus על הקרח.
  13. להוסיף 3 µL של lentivirus מטוהרים לכל טוב (וירוס כייל צריך להיות בין 108 עד 109 טו/mL), ולאחר מכן להעביר את הצלחת לחזור חממה התרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 20% O2).
  14. זיהום פוסט-ויראלי 24 שעות ביממה, להוסיף 100 µL של תאי גזע טריים מדיה לתאים נגועים.
  15. זיהום שלאחר lentiviral 48 שעות, החלף וירוס המכיל מדיה עם 200 µL של תאי גזע טריים מדיה בתוספת 1 puromycin µg/mL.
  16. רענן מדיה מדי יום עם 200 µL של תאי גזע מדיה בתוספת 1 puromycin µg/mL.
  17. כאשר תרבויות מגיעים 80% confluency, מביצועם תאים באמצעות µL 200 ל- PBS ללא Ca2 + ו Mg2 + + 0.5 מ מ EDTA (עבור טוב אחד של צלחת 96-ובכן).
  18. איסוף תאים ההשעיה לתוך שפופרת צנטרפוגה.
  19. לנטרל דיסוציאציה מגיב עם 5 מ של Ca המכילות PBS2 + ו- Mg2 +.
  20. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה (200 גרם x במשך 3 דקות).
  21. להסיר את תגובת שיקוע וחבוט בעדינות את הצינור כדי לסלק את גלולה.
  22. להשעות מחדש תאים 1 מ"ל של תאי גזע מדיה בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב.
  23. העברת כל התאים (1 מ"ל) מצופה היטב של צלחת 12-. טוב.
  24. לאחר 24 שעות, צג עבור התא מצורף לתקשורת. ובכן והחלף עם 1 מ"ל של תאי גזע מדיה בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב ו 6 ng/mL hexadimethrine ברומיד, h אחד לפני התמרה חושית.
  25. הפשרת Id1-lentivirus על הקרח.
  26. להוסיף 5 µL של וירוס מטוהרים לכל טוב (12-ובכן צלחת).
  27. זיהום פוסט-lentiviral 24 שעות ביממה, החלף וירוס המכיל מדיה עם 1 מ"ל של תאי גזע טריים מדיה בתוספת 3 puromycin µg/mL.
  28. 48 שעות פוסט זיהום lentiviral, החלף וירוס המכיל מדיה עם 1 מ"ל של תאי גזע טריים מדיה בתוספת 6 puromycin µg/mL.
  29. כאשר תרבויות מגיעים 80% confluency, מביצועם תאים באמצעות µL 500 ל- PBS ללא Ca2 + ו- Mg2 + ועם 0.5 מ מ EDTA (עבור טוב אחד של צלחת 12-טוב).
  30. העברת מחצית (250 µL) של התליה תא ל אחד טוב של ריאגנט ציפוי מצופה צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ"ל של תאי גזע מדיה בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב.
  31. השתמש בחצי השני (250 µL) של המדגם עבור החילוץ-RNA ולרביעיית-PCR על מנת לקבוע lentiviral בתיווך Id1 רמות הביטוי, כמו קולה. et al. (2012) 4.
    הערה: חשוב: אם Id1 mRNA ביטוי רמות נמוכות מ- 0.005 קיפול של רמות הביטוי GAPDH (ראו טבלה 3 צבעי יסוד לרביעיית-PCR), חזור זיהום התהליך כמתואר לעיל עד רמות הביטוי Id1 יעלה הסף.

2. hPSCsId1 תחזוקה

  1. תרבות hPSCsId1 ב 6 מצופה היטב-פלטות ולגדול ב- 3 מ לכל טוב של תאי גזע מדיה בתוספת 6 puromycin µg/mL.
  2. כאשר hPSCsId1 מגיעים 80% confluency, מעבר תאים כמו אגרגטים (פיצול-יחס של 1:6) באמצעות ריאגנט דיסוציאציה ללא אנזים בעקבות הנחיות הספק ולגדול ב- 3 מ לכל טוב של תאי גזע מדיה בתוספת 6 puromycin µg/mL.

3. הכנה של hPSCsId1 בידול

  1. מעיל צלחת 12-טוב עם µL 500 לכל טוב של ריאגנט ציפוי.
  2. כאשר hPSCsId1 להגיע 90% confluency מביצועם תאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS ללא Ca2 + ו- Mg2 + ועם 0.5 מ מ EDTA לכל טוב עבור 5 – 10 דקות לבדוק דיסוציאציה תהליך כל דקה, פעם 80% של התאים הם לזהויות את הצלחת , המשך לשלב הבא.
  3. איסוף תאים ההשעיה לתוך שפופרת צנטרפוגה.
  4. לנטרל דיסוציאציה מגיב עם 5 מ של Ca המכילות PBS2 + ו- Mg2 +.
  5. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה (200 גרם x במשך 3 דקות).
  6. להסיר את תגובת שיקוע וחבוט בעדינות את הצינור כדי לסלק את גלולה.
  7. להשעות מחדש תאים 2 מ"ל של תאי גזע מדיה בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב.
  8. ספירת תאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית.
  9. צלחת 300,000 תאים לכל באר 1 מ"ל של תאי גזע מדיה בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב 6 puromycin µg/mL, ואת הצלחת העברת לתוך החממה תרביות רקמה.
  10. רענן מדיה מדי יום עם 2 מ"ל של תאי גזע מדיה בתוספת 6 µg/mL puromycin עד תרבויות מגיעים 90% confluency. בשלב זה, ליזום בידול הלב (השלב הבא).

4. הבידול של hPSCsId1 לתוך הלב הראשון שדה דמוי לב אבות (CPs FHF-L)

  1. עבור תבנית לוח 12-ובכן, בידול אתחול (יום 0) על-ידי החלפת מדיה תא גזע 1.5 מ של אינדוקציה מדיה (טבלה 1) בתוספת Activin של (100 ננוגרם למ"ל) (ראה בטבלה 2 עבור מומלץ Activin A ואמצעי ריכוזים עבור צלחת שונה תבניות).
  2. יום 1 (24 שעות לאחר בידול מאותחלת), להחליף מדיה 2 מ"ל של אינדוקציה מדיה ללא Activin A (לכל טוב של צלחת 12-טוב).
  3. יום 3, החלף מדיה 2 מ"ל של אינדוקציה מדיה ללא Activin A (לכל טוב של צלחת 12-טוב).
  4. יום 5, לאסוף CPs FHF-L עבור הקפאה קריוגנית (השלב הבא).
    הערה: חשוב: הקפאה קריוגנית הוא מועדף בנקודה זו, כפי שהיא מאפשרת לנתק לב דור מ- cardiomyocyte הבאים ייצור, biobank קבוצות גדולות של תאים. הערה כך לחלופין, יום 5 FHF-L CPs ניתן להעביר את צלחת טרי מצופה להמשיך בידול, עיין צעדים 5.1 – 5.5 לשל passFHF-L, לאחר מכן המשך שלב 6.5 עבור בידול.

5. הקפאה קריוגנית של CPs FHF-L

  1. תשאף כל המדיה מבארות המכיל יום 5 CPs FHF-L במהירות להוסיף 1 מ"ל חמים (37 מעלות צלזיוס) 1 x המכיל אנזים ריאגנט דיסוציאציה (ראה טבלה של חומרים). מניחים צלחת בחממה תרביות רקמה.
  2. לאחר 1 דקות, לנער צלחת לצד בחממה.
  3. לאחר 2 דקות (סה כ זמן), הסר את לוחית מן החממה ולהוסיף 1 מ"ל של 10% FBS מדיה.
  4. בעדינות pipet תאים למעלה ולמטה עם pipet מ ל כדי להקל על ניתוק התא לצלחת.
  5. לאסוף ההשעיה התא לתאים צניפה ובשעות צנטריפוגה על ידי צנטריפוגה ב g x 200 למשך 3 דקות
  6. מחדש להשעות תא גלולה ב 2 מ של ריאגנט הקפאה קריוגנית.
  7. ספירת תאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית.
  8. הוספת ריאגנט הקפאה קריוגנית (ראה טבלה של חומרים) בווליום מספיק כדי cryopreserve תאים על הריכוז הרצויה (בדרך כלל 5 – 10 x 106 תאים/mL).
  9. העברת תאי הקפאה קריוגנית בקבוקונים, מניחים צלוחיות קירור ההתקן (1 ° C/דקה) ומכניסים קירור למכשיר למקפיא-80 ° C בן לילה.
  10. לאחר 24 שעות, להעביר בקבוקונים קפוא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

6. FHF-L בידול CP לתוך Cardiomyocytes דמוי-חדרית

  1. להעביר יום 5 CPs FHF-L קפוא בקבוקונים אחסון בחנקן נוזלי לתוך מיכל קרח יבש.
  2. מקום בקבוקונים 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים למשך 2-3 דקות, עד מופשר תא ההשעיה הוא לחלוטין.
    הערה: חשוב: תהליך שהביקושים רגיש בזמן. חשיפת תאים לכלי התקשורת הקפאה קריוגנית עבור כמות מוגזמת של זמן (קרי, 10 דקות) יקטן תא הכדאיות.
  3. העברת תאים 15 או 50 מ"ל צנטריפוגה שפופרת, בהתאם למספר בקבוקונים המופשרים.
  4. לוותר על dropwise (5 טיפות כל 30 שניות) מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס) קרדיוגני מדיה (טבלה 1) תא פתרון. המשך בתהליך זה עד 1:3 הקפאה קריוגנית מדיה: יחס התקשורת קרדיוגני מתמלאת. בשלב זה, להגביר את קצב הוספת מדיה קרדיוגני עד 1:10 הקפאה קריוגנית מדיה: יחס התקשורת קרדיוגני מתמלאת.
    הערה: חשוב: שינויים osmolarity מהירה יגדל מות תאים במהלך תהליך שהביקושים; לפיכך, תוספת dropwise של המדיה קרדיוגני כמתואר לעיל מומלץ מאוד.
  5. צנטריפוגה תאי השעיה וגלולה התא על ידי צנטריפוגה (200 גרם x במשך 3 דקות).
  6. להסיר את תגובת שיקוע וחבוט בעדינות צנטריפוגה צינור מכך תא גלולה.
  7. להשעות מחדש תאים עם מדיה קרדיוגני בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב.
    הערה: תא הכדאיות יכול להשתנות להפשיר הפשרה, באופן כללי, > 65% הכדאיות מנבאת ציפוי טוב יעילות.
  8. שתדללו מרוכז תא הבולם עם מדיה קרדיוגני בתוספת 2 מיקרומטר, רו-רוק מסלול מעכב להשגת ריכוז התא הרצוי עבור ציפוי (ראו טבלה 2 תבניות צלחת שונה).
    הערה: חשוב: שימו לב כי יעילות בידול הלב עלולה לרדת אם התאים נמצאים נזרע גם בדלילות.
  9. תאי הזרע על הצלחת.
  10. להשאיר צלחת בשכונה תרביות רקמה כעשרים דקות לפני העברת אותו חממה תרביות רקמה.
  11. ביום 6 של בידול, לפקח על התא מצורף.
    הערה: דום לב אבות הם cryopreserved ביום 5 של הבידול. 24 שעות לאחר מפשיר את התאים יהיה ביום 6 של הבידול.
    הערה: הנוכחות של תאים (מתים) צף נפוץ.
  12. יום 7, תשאף 50% של המדיה ולהחליף עם כמות שווה של מדיה קרדיוגני טריים.
    הערה: התוספת של RHO/רוק מסלול מעכב את התקשורת קרדיוגני אין צורך לאחר הנקודה הזו.
  13. להחליף 50% של המדיה מדיה קרדיוגני בכל יום אחר.
  14. הערה להכות ספונטני זה מופיע בין היום ה-11 יום 13.
  15. ביום 15, לכמת בידול לב יעילות על-ידי immunofluorescence באמצעות דאפי (גרעין כתם) ו- ACTC1 (סמן פאן-לב).

7. העברת ותחזוקה של Cardiomyocytes דמוי-חדרית

הערה: מאת ביום 14 – 16, טפט להידבקות באופן ספונטני כמו חדרית cardiomyocytes צריכה להתקבל. בשלב זה, הוא הציע מביצועם של מחדש צלחת cardiomyocytes כדי homogenize את התרבות ולמנוע תאים ניתוק מהצלחת.

  1. תשאף כל המדיה מבארות ולהוסיף במהירות 1 מ"ל של טרום ומחוממת (37 מעלות צלזיוס) 1 x המכיל אנזים ריאגנט דיסוציאציה.
    הערה: 1 x המכיל אנזים דיסוציאציה ריאגנט אחסון משתנים בהתאם לתבנית צלחת, אבל לחלוטין אמור לכסות את החלק התחתון של השטח היטב.
  2. להעביר את הצלחת לתוך חממה תרביות רקמה.
  3. בעדינות לנער צלחת לצד כל 2 דקות בתוך החממה כדי להאיץ את תהליך הניתוק.
  4. לאחר 5-15 דקות, כאשר 80% עד 100% מהתאים הם צמודי קרקע מהחלק התחתון של הלוח, הסר את הלוחית של החממה, לעכב 1 x המכיל אנזים דיסוציאציה ריאגנט פעילות על-ידי הוספת אמצעי שווים של 10% FBS מדיה.
    הערה: זמן הדגירה עם דיסוציאציה המכיל אנזים x 1 עבור תהליך זה ישתנו מן אצווה-כדי-אצווה.
  5. לאסוף תא ההשעיה שפופרת צנטרפוגה.
  6. מערבבים תא הבולם עם pipet, ספירת תאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית.
  7. לדלל תא ההשעיה כדי ריכוז התא הרצוי (ראה טבלה 2 תבניות שונות צלחת) עם תחזוקה מדיה בתוספת 2 מיקרומטר RHO/רוק מסלול מעכב.
  8. לאחר זריעה cardiomyocytes לצלחת, פזר את התאים באופן שווה ולאפשר את התאים לצרף 10 – 20 דקות לפני העברת צלחת חממה תרביות רקמה.
  9. 24 שעות לאחר ציפוי מחדש, לפקח על התא מצורף ושחזור.
    הערה: הנוכחות של תאים (מתים) צף נפוץ. 48-72 שעות לאחר ציפוי מחדש, cardiomyocyte צריך לחדש את התכווצות ספונטנית.
  10. כדי לשמור על התרבות cardiomyocyte, להחליף 50% של התקשורת עם התקשורת תחזוקה כל יומיים עד השימוש חדרית דמוי cardiomyocytes לניסויים הבאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דור של hPSCs Id1 קווים
hPSCs נגוע lentivirus תיווכה ביטוי Id1 (איור 1א'). ברגע hPSCId1 נוצרים, transgene ביטוי לכמת על ידי לרביעיית-PCR (איור 1B). רק hPSCId1 שורות לבטא Id1 mRNA ברמות גדול מ- 0.005 קיפול של GAPDH צריך לשמש עבור בידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Differentiations מוצלח, ודא לעקוב מקרוב אחר ההוראות המפורטות לעיל. בנוסף, כאן אנחנו מדגישים פרמטרים מרכזיים אשר משפיעים מאוד על תוצאות בידול. לפני שמתחילים הבחנה, להתייחס הפרמטרים הבאים מורפולוגי שלושה: מורפולוגיה גזע של hPSCsId1, דחיסה גבוהה הסלולר ועל זרימה גבוהה (> 90%) של התרבות ביום 0. בהקשר הזה, תנאים אופטימליים בידול נוצרים בצורה הטובה ביותר על ידי ציפוי הפומבית hPSCsId1 כמו תאים בודדים, המאפשר להם טופס בחוזקה התקבצו monolayers לגדול כדי הנהרות ~ 90% במהלך 2-3 ימים. לעומת זאת, אם hPSCId1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים חברי המעבדה קולה לדיונים מועיל, ביקורות קריטי של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי NIH/NIEHS R44ES023521-02, CIRM DISC2-10110 מעניקה ד ר קולה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן ACTC1SigmaA7811
Activin Aטכנולוגיות תאי גזעHu Recom Activin A
אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית (אנטי)Thermo Fisher Scientific15240062
B27Thermo Fisher Scientific17504044
תוסף B27 ללא אינסוליןThermo Fisher ScientificA1895601
תוסף B27 ללא ויטמין AThermo Fisher Scientific12587001
נוגדן CDH5R& D SystemsAF938
CryoStor CS10Stem Cell Technologies7930מגיב לשימור בהקפאה
DMEM גלוקוז גבוהMediatech10-013-CV 
DPBS עם Ca & MgCorning21-030-CV
EDTAThermo Fisher Scientific15575-038
FBSVWR89510-186
ערכת פוטנציאל ממברנה FluoVolt   Thermo Fisher ScientificF10488לרכישת פוטנציאל פעולה אופטית, עיין ב-McKeithan et al. 2017
החלפת סרום נוקאאוטGibco10828010
Matrigel, גורם גדילה מופחתCorning356231ציפוי ריאגנט
mTeSR1 ערכת מדיהStem Cell Technologies5850
PBS w/o Ca & מ"גקורנינג21-040-CV
פניצילין-סטרפטומיציןג'יבקו
פורומיצין Acros227422500
ReLeSRStem Cell Technologies5872מגיב דיסוציאציה ללא אנזים
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
נוגדן TAGLNAbcamab14106
ThiazovivinStem Cell Technologies72254מעכב מסלול RHO/ROCK
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605 -0101X מגיב דיסוציאציה המכיל אנזים
Tyrodes תערובת תמיסות חבילות   SigmaT2145-10X1L(לרכישת פוטנציאל פעולה אופטית, עיין ב-McKeithan et al. 2017)
תוסף תזונה

מקורות

  1. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  2. Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
  3. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  4. Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
  5. Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
  6. McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 1, Unit 1F 13(2012).
  7. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766(2017).
  8. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
  9. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
  10. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
  13. Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
  14. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  15. Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
  16. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
  17. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
  18. Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
  19. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Id1Activin ACryopreservation
הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.