מאמר שיטה

שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels

DOI:

10.3791/57698

⸱

7 במאי 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחסום הדם - מוח (BBB) היא רקמה מכשול דינמי המגיבה לגירויים שונים הקשורים pathophysiological ולא תרופתי. שינויים כאלה הנובעות גירוי יכול במידה רבה לווסת את משלוח סמים למוח ולגרום, לפי סיומת, אתגרים ניכרים בטיפול של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות. שינויים BBB רבים המשפיעים על pharmacotherapy, לערב חלבונים לשפות אחרות, בא לידי ביטוי ברמה של תאי אנדותל. אכן, ידיעה על BBB הפיזיולוגיה על בריאות ומחלה עוררה עניין רב במחקר של חלבונים אלה ממברנה. מבחינת מחקר מדע בסיסי, זה מרמז על דרישה עבור שיטה פשוטה אך חזקים לשחזור עבור בידוד של microvessels של רקמת המוח שנקטפו חיות ניסוי. לשם הכנת ממברנה דגימות microvessels טרי מבודד, זה חיוני כי ההכנות המדגם להיות מועשר בתאי האנדותל אבל מוגבלת בנוכחות סוגי תאים אחרים של היחידה נוירו-וסקולריים (קרי, האסטרוציטים מיקרוגלייה, הנוירונים, pericytes). יתרון נוסף הוא היכולת להכין דגימות מבעלי חיים בודדים על מנת ללכוד את ההשתנות נכון של חלבונים ביטוי אוכלוסיה ניסיוני. כתב יד זה, ניתנים פרטים בנוגע שיטה כי הוא מנוצל עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels והכנת דוגמאות ממברנה. Microvessel העשרה, מדגימות נגזר, מושגת באמצעות ארבעה שלבים צנטריפוגה איפה לתוספי נכלל במאגר של הדגימה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות על ידי מעבדות אחרות עבור יישומים ספציפיים משלהם. דוגמאות שנוצר מתוך פרוטוקול זה הוכחו תשואות נתונים ניסיוני של ניסויים ניתוח חלבון זה יכול לסייע מאוד את ההבנה של BBB תגובות לגירויים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological, תרופתי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחסום הדם - מוח (BBB) קיים ממשק בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) את מחזור מערכתי ואת ממלא תפקיד חיוני שמירה על הומאוסטזיס המוח. באופן ספציפי, BBB הפונקציות בדיוק שליטה ממס ריכוזי נוזל חוץ-תאי המוח, לספק ביעילות המזינים הללו הנדרשים על ידי רקמת המוח כדי למלא את דרישות המטבולית ניכר של ה-CNS1. תפקידים אלה לרמוז כי BBB, אשר קיים בעיקר ברמה של תא אנדותל microvascular, צריך להחזיק דיסקרטית מנגנונים המאפשרים כמה חומרים לגשת parenchyma המוח תוך הבטחת ואינטראקציות מזיקים לא יכול לצבור. אכן, תאי אנדותל microvascular המוח אינם fenestrated, התערוכה פינוציטוזה מוגבלת, אשר מבטיחים מחסור של חדירות לא בררניים2. בנוסף, תאי אנדותל של המוח microvessel אקספרס צמוד לצומת, adherens צומת חלבונים לפעול טופס בדיקה גופנית "לאטום" בין תאי אנדותל סמוכים ולהגביל במידה רבה paracellular דיפוזיה של חומרים נישא בדם לתוך המוח parenchyma. אכן, חדירות סלקטיבית של חומרים אנדוגניים ו אקסוגני מחייב ביטוי פונקציונאלי של ספיגת ו בזרימת מובילי3. צמתי הכללית, חזק, צמתי adherens, מסועי לעבוד ביחד כדי לשמור על המאפיינים מכשול ייחודי של BBB.

BBB היא מכשול דינאמי מגיב לגירויים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological, תרופתי. לדוגמה, היפוקסיה/reoxygenation מתח הוכח לווסת ביטוי של חלבונים צומת קריטית חזק (קרי, occludin, zonulae occluden-1 (זואי-1)), אשר מזוהה עם חדירות מוגברת paracellular אל כלי דם סמנים כזה כמו סוכרוז4,5,6. תצפיות דומות שנעשו ב- BBB בסביבה של פגיעה מוחית טראומטית7 ו-8,כאבים דלקתיים היקפיים9. אלה אותן מחלות יכול גם לווסת את מנגנוני הובלה ב BBB10,11,12,13,14. אכן, היפוקסיה/reoxygenation פגיעה מגבירה ביטוי פונקציונאלי אורגני אניון. מעביר מפוליפפטיד 1a4 (Oatp1a4) ב- BBB, אשר יכול להוביל עליות משמעותיות התעבורה דם-כדי-מוח של סובסטרטים תחבורה Oatp ספציפיים כגון taurocholate ו atorvastatin13. מאפייני BBB יכול להשתנות גם ע י pharmacotherapy עצמו, מנגנון זה יכול ליצור בסיס עבור שני שינויים עמוקים של אפקטיביות התרופה במוח, סמים-תרופתיות. לדוגמה, פרצטמול מטרות קולטן גרעיני מנגנוני איתות ב microvascular אנדותל תאי המוח, מגביר ביטוי פונקציונאלי של המשגר בזרימת קריטי P-גליקופרוטאין (P-gp), ומשנה תלויי-זמן שיכוך כאבים שהוענקו מורפיום, כאבים אופיואידים סמים ו P-gp הוקמה תחבורה המצע15. הבנה מעמיקה של שינויים BBB, יכולה להיגרם על ידי מחלות או סמים, דורש גם זיהוי ואפיון של מנגנוני הרגולציה ספציפי לשלוט לבצע שינויים אלה. אכן, דיסקרטית איתות המסלולים זוהו תאי אנדותל microvascular המוח לשלוט הביטוי מולקולרית של צומת חזק חלבונים16,17 ו מובילי15, 18,19. יחדיו, תצפיות אלה מציינים מורכבים מסלולים מולקולריים המעורבים ברגולציה של צמתי צר BBB, מסועי על בריאות ומחלה.

אתגר משמעותי במחקר של BBB היא הדרישה המוחלטת של שיטה פשוטה ויעילה עבור בידוד של microvessels של רקמת המוח נגזר חיות ניסוי והכנה עוקבות של דגימות ממברנה. דגימות אלה חייבים להיות מוכנים כך הם גם מועשר בתאי האנדותל microvascular המוח, מוגבל בנוכחות של סוגי תאים אחרים. במהלך השנים האחרונות, מתודולוגיות מרובים עבור בידוד של microvasculature מהמוח מכרסמים דווחו21,2220,13,הספרות המדעית. מאמר זה מתאר פשוט, חזקה, בעלת שיטה לשחזור עבור בידוד של microvessels מהמוח עכברוש, הכנת דוגמאות מועשרת ממברנה אנדותל שיכול לשמש לניתוח של ביטוי חלבון. יתרון של הפרוטוקול בידוד microvessel היא היכולת להשיג תכשירים לדוגמה באיכות גבוהה ועם תשואה מספיק חלבון של חיה ניסיוני בודדים. פעולה זו מאפשרת השיקול ההשתנות הבין-בעלי חיים בביטוי חלבונים. כזה מקדמה של פרוטוקול זה השתפרה במידה החוסן של BBB מחקרים כי הערכת יתר (או תת הערכה) על המשמעות האמיתית של חלבון שינויים ב- BBB עכשיו ניתן להימנע. בנוסף, הכללת מספר השלבים צנטריפוגה עם לתוספי מאפשר העשרת משופרת של microvessels בדגימות ניסיוני תוך עידוד הסרה של המרכיבים הסלולר לא רצויות כגון נוירונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המתוארים להלן אושרו על-ידי, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC) ו לציית הלאומית המכונים לבריאות (NIH) ומחקר חיה: דיווח ב- Vivo ניסויים (יגיעו) הנחיות. הזרם פרוצדורליים עבור הפרוטוקול מתואר באיור1.

1. הגדרת תהליך

  1. להכין מאגר microvessel המוח (BMB). התחל על ידי שקילה 54.66 g D-מניטול, 1.90 g EGTA ו- 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (קרי, טריס) בסיס לתוך גביע נקי. להוסיף אני 1.0 ליטר מים יונים. לערבב את הרכיבים של המאגר BMB באמצעות של פגים. לאחר הפתרון היה מעורב באופן יסודי, להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 1.0 M HCl.
  2. להכין 26% לתוספי (MW 75,000) פתרון (w/v) לפני מאלחש חיות. הכינו את הפתרון לתוספי כפי שתואר בשלבים הבאים.
    הערה: חשוב באופן קריטי להכין פתרון זה מבעוד מועד כי לתוספי יכול לקחת כ- 1.5-2 h כדי להמיס במאגר מימית.
    1. שוקלים לצאת לתוספי אבקת (26 גרם לכל מאגר 100 מ ל) לתוך גביע נקי.
    2. למדוד את נפח מתאים של BMB, לוותר על תוך גביע נפרדים, נקי.
    3. שופכים לאט BMB לתוך כשהספל המכילה אבקת לתוספי. באופן ידני מערבבים את אבקת לתוספי בזמן מזיגת BMB באמצעות מוט מערבבים זכוכית.
    4. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl M 1.0 מיד מוקדמת לשימוש.
      הערה: בידוד טיפוסי של המוח microvessels מ 12 חולדות ספראג-Dawley בודדים (זכר או נקבה; בגיל 3 חודשים; 200-250 g) דורש 200 מ של פתרון לתוספי (קרי, לתוספי 52 g ב- 200 מ של BMB).

2. מיצוי של רקמת המוח של חולדות ספראג-Dawley

  1. בעקבות ניסיוני הטיפול הרצוי, עזים ומתנגד חולדות ספראג-Dawley באמצעות קטאמין (50 מ"ג/ק"ג; i.p. 2.5 mL/kg) וחריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/מ"ל; 2.5 מ"ל/ק"ג. אני, p.). לדלל קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים ב- saline 0.9% כדי ריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל ו- 4.0 מ"ג/מ"ל בהתאמה. המתת חסד בעלי חיים ע י עריפת ראשו באמצעות גיליוטינה מחודדים בהתאם להנחיות IACUC. השתמש בפרוצדורה זהה עבור חולדות ספראג-Dawley גם זכר וגם נקבה.
  2. נכרות את העור מן הגולגולת חולדה על ידי ביצוע חתך רוחבי אחד באמצעות מספריים כירורגיים.
  3. באמצעות rongeurs, בזהירות הסר את לוחית הגולגולת וחושפים את המוח.
  4. מסירים את המוח בעזרת מרית. לנתק את המוח הגדול ולמקם על רקמת המוח מבודדים לתוך צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 5 מ של BMB. הוסף μL 1.0 של מעכב פרוטאז קוקטייל לכל 1.0 מ"ל BMB מאגר מיד לפני השימוש.

3. המוח עיבוד

  1. העברה על רקמת המוח מהצינור חרוט 50 מ ל צלחת פטרי נקי.
  2. בעדינות באמצעות מלקחיים, לגלגל המוח על 12.5 ס מ קוטר מסנן נייר כדי להסיר את קרומי המוח החיצונית, אשר הם דבקו באופן רופף של קליפת המוח. בעדינות לחץ על רקמת המוח נגד נייר סינון וגלגלי הרקמה שוב. הפעל נייר הסינון לעתים קרובות במהלך שלב זה.
  3. להפריד מקלעת דמית העין בין האונות באמצעות מלקחיים.
    הערה: מקלעת דמית העין מופיע ברור עלי הלוואי קרומיים רקמה מקומי על פני השטח של החדרים מוחי.
  4. בעדינות לשטח על רקמת המוח ולהסיר הנותרים קרומי המוח, הריח נורות באמצעות מלקחיים.
  5. למקם את רקמת מוח קליפתי מרגמה סיינג טאו. להוסיף mL 5.0 של BMB מעכב פרוטאז המכיל קוקטייל המליטה.
  6. שימוש מהמגן חשמל תקורה, homogenize על רקמת המוח באמצעות 15 לאורך קווים-3,700 סל ד. לבצע המגון באמצעות 10 מ"ל ומכתש רקמות מטחנה. בין המגון כל מדגם בודדים, נקה את שהעקב באמצעות אתנול 70%.
    הערה: המגון משיחות צריך להיות עקבי במונחים של קצב ובהיקף.
  7. שופכים את homogenate לתוך צנטריפוגה שכותרתו צינורות.

4. צנטריפוגה צעדים

  1. להוסיף 8.0 מ של 26% לתוספי פתרון כל שפופרת צנטריפוגה שכותרתו המכיל homogenate במוח.
  2. היפוך הצינור פעמיים ולאחר מכן ביסודיות מערבולת המדגם. לנהל את vortexing של כל דגימה באמצעות זוויות מרובים כדי להבטיח ערבוב יסודי של המוח פתרון homogenate 26% לתוספי פתרון....
  3. צנטריפוגה דגימות ב x 5,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
    הערה: עבור כמה ניתוחים, זה שימושי להשוות בין המוח microvessels עם parenchyma המוח. צריך להיות להערכת ביטוי חלבון המוח parenchyma הנדרשים, תגובת שיקוע של שלב זה צנטריפוגה (קרי, המוח parenchymal שבר) יכול להיות נאספים ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
  4. הסר את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק, זכוכית פסטר פיפטה.
    הערה: זהירות יש לנקוט כדי לא להפריע בגדר. אחרת, כמות microvessels המוח שנאספו יקטן, אשר יקטין באופן משמעותי את התשואה חלבון של הליך זה.
  5. Resuspend בגדר ב mL 5.0 של BMB המכילה פרוטאז מעכב קוקטייל (קרי, 1.0 μL פרוטאז מעכב קוקטייל לכל 1.0 מ"ל BMB מאגר). מערבולת בגדר כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  6. להוסיף 8.0 מ של 26% לתוספי כל שפופרת צנטריפוגה ו מערבולת כמתואר בצעדים 4.1-4.2 של פרוטוקול זה.
  7. צנטריפוגה דגימות ב x 5,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
  8. באמצעות תרמוס פיפטה מזכוכית, תשאף תגובת שיקוע ולהבטיח את גלולה המכילה microvessel המוח לא מופרת.
    הערה: חומר עודף יש דבקה הקיר צינור אינו מכיל microvessels, צריך להיות בזהירות מנקים את הסיר.
  9. חזור על שלבים 4.5 עד 4.8 נוספים פעמיים.
  10. פעם צעדים צנטריפוגה לתוספי 4 הושלמו, להוסיף 5.0 מיליליטר BMB צניפה כל המערבולת כדי resuspend את הדגימה.
    הערה: לאחר השלמת שלב 4.10, microvessels כל ניתן לאסוף לניתוח של חלבון לוקליזציה. זה יכול להתבצע על-ידי לקיחת μL 50 aliquot של microvessel מחדש על תנאי צניפה מורחת על משטח זכוכית מיקרוסקופ. Microvessels הם ואז חום-קבוע ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על בלוק חימום ואחריו קיבוע באתנול קר כקרח עבור שקופיות נוספות 10 דקות ואז ניתן לאחסן ב 4 ° C עד הדרושים עבור הדמיה מחקרים.

5. Ultracentrifugation להכין דגימות של ממברנות Microvascular מוחי מוחלט

  1. העברת דגימות מהמגן סיינג טאו.
  2. שימוש מהמגן חשמל תקורה, homogenize רקמת המוח באמצעות 8-10 לאורך קווים ב-3000 סל ד. המגון מתנהל באמצעות 10 מ"ל ומכתש רקמות מטחנה. לנקות את שהעקב באמצעות אתנול 70% בעקבות המגון כל דגימה בודדת.
  3. העברת דגימות לנקות צינורות ultracentrifuge. מספר ולשקול כל שפופרת בודדים. איזון, זוג הצינורות לפני טעינה אל הרוטור ultracentrifuge.
    הערה: כל שקילה, זיווג של צינורות ultracentrifuge שחייבת להתנהל עם הפקקים כדי להבטיח מדידה מדויקת של שפופרת משקולות.
  4. צנטריפוגה דגימות ב x 150,000 g עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
  5. באמצעות flask ואקום זכוכית פסטר פיפטה, תשאף תגובת שיקוע באמצעות טיפול לא להפריע בגדר ממברנה נימי.
  6. בהתבסס על גודל צניפה, להוסיף אמצעי אחסון המתאים מאגר אחסון, אשר מורכבת BMB ומים יונים על יחס 1:1 (v/v). בדרך כלל, כדורי הם resuspended ב 400-500 μL מאגר אחסון. להוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז מאגר אחסון על יחס של 1.0 μL לכל 1.0 מ"ל של מאגר אחסון.
  7. מערבולת דגימות resuspend צנפה מאגר אחסון.
  8. באמצעות כוס פסטר פיפטה, העברת דגימות ממברנה נימי צינור microcentrifuge שכותרתו mL 1.5.
  9. מעבר מדגם באמצעות מחט מזרק 5 x כדי להבטיח המדגם באופן יסודי מעורב כי אין אגרגטים סלולרית קיימת.
  10. חנות דגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד הנדרש לצורך ניתוח.
    הערה: תכולת החלבון של כל מדגם ממברנה microvessel נמדד באמצעות שיטת ברדפורד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרם ניסיוני עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה microvessel מוצג באיור1. באמצעות ההליך המובאת כאן, בידוד מוצלחת של microvessels ללא פגע מן מוח עכברוש הוא הפגין (איור 2 א). כלים אלה התקבלו לאחר סיום צנטריפוגה עם לתוספי, מיד לפני התחלת ultracentrifugation להכין דגימות ממברנה (קרי, לאחר סיום שלב 4.10). בתמונה זו, microvessel זה ישאר באמצעות נוגדן נגד Oatp1a4, נהג זה הוכח לבוא לידי ביטוי גם ב קרום הפלזמה של ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה מתוארת שיטה פשוטה ויעילה של הכנת דגימות חלבון ממברנה microvessels טרי מבודד מן החולדה רקמת המוח. דווח על מספר גישות עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels ו/או דור של ההכנות ממברנה מ microvasculature מבודדים21,22 20,13,ספרות , 24. פרוטוקול בידוד microvessel המתואר לעיל אמנם דומה עקרונית, גישה זו מוטבה כדי לאפשר הכנת ממברנה דגימות עם חלבון מעולה התשואה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (R01-NS084941), אריזונה הנציבות מחקר ביו-רפואי (ADHS16-162406) PTR. ווה קיבל בעבר תמיכה של פגישה מראש הדוקטורט נבחרת מוסדות של בריאות הכשרה למענק (T32-HL007249).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קוקטייל מעכב פרוטאזסיגמא-אולדריץ'#P8340מרכיב של מאגר מיקרו-כלי דם במוח
D-מניטולסיגמא-אולדריץ'#M4125מרכיב של מאגר מיקרו-כלי דם במוח
EGTASigma-Aldrich#E3889מרכיב של מאגר מיקרו-כלי דם במוח
Trizma BaseSigma-Aldrich#T1503מרכיב של מאגר מיקרו-כלי דם במוח
Dextran (MW 75,000)Spectrum Chemical Mftg Corp#DE125דקסטרן המשמש בשלבי צנטריפוגה להפרדת כלי דם מפרנכימה מוחית
זטאמיןMWI בריאות בעלי חיים#501072הרדמה כללית
קסילזיןWestern Medical Supply#5530הרדמה כללית
0.9% תמיסת מלחWestern Medical SupplyN/Aהרדמה כללית
נייר סינון מדלל (קוטר 12.5 ס"מ)VWR#28320-100משמש להסרת קרומי המוח מרקמת המוח
צינורות צנטריפוגהSarstedt#60.540.386צינורות חד פעמיים המשמשים למדרגות צנטריפוגה דקסטרן
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) AssayThermoFisher Scientific#23236מדידת ריכוז חלבון בתכשירי ממברנה
Wheaton Overhead Power HomogenizerDWK Life Sciences#903475נדרש להומוגניזציה של דגימות
10.0 מ"ל מרגמה מזכוכית ומטחנת רקמות עליDWK Life Sciences#358039נדרש להומוגניזציה של דגימות
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אולדריץ'#H1758נדרש להתאמת pH של חוצצים
סרום בקר אלבומיןThermoFisher Scientific#23210תקן חלבון לבדיקת ברדפורד
מלקחייםסטנדרטיים כלי מדע עדין#91100-12משמש לדיסקציה של רקמת המוח
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools#16020-14משמש לפתיחת גולגולת לבידוד המוח
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםThermoFisher Scientific#352070משמש לאיסוף רקמת מוח לאחר בידוד
פיפטות פסטר זכוכיתThermoFisher Scientific#13-678-20Cמשמש לשאיבת פסולת תאית בעקבות ספינים דקסטרניים
אתנול,סיגמא-אולדריץ'#459836משמש לניקוי מטחנת רקמות; מדולל ל-70% במים
מזוקקיםצינורות אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטר#41121703משמשים לאולטרה-צנטריפוגה של דגימות
נטול מים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802(2017).
  3. Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
  4. Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
  5. McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
  6. Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
  7. Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
  8. Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
  9. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  10. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  11. Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
  12. Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
  13. Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
  14. Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
  15. Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
  16. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  17. Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
  18. Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
  19. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  20. Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
  21. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
  22. McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
  23. Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
  24. Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
  25. Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
  26. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  27. Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים