עבודה זו מספקת שיטה הזיוף של פלטפורמות מבוססות-droplet microfluidic לבין היישום של microspheres לזיהוי עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. שיטת ננו-ספירה-PCR מאפשר לקבל חד גדילי DNA amplicons מבלי המפריד בין שני גדילי ה-DNA.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet מאפשרים ייצור אמין microspheres הומוגנית בערוץ microfluidic, מתן הגודל מבוקרת של המורפולוגיה של ננו-ספירה שהושג. ננו-ספירה copolymerized עם בדיקה acrydite-DNA היה מפוברק בהצלחה. ניתן להשתמש בשיטות שונות כגון PCR אסימטרי, עיכול אקסונוקלאז, בידוד על מצופים streptavidin beads מגנטי לסנתז DNA חד-גדילי (ssDNA). עם זאת, שיטות אלה לא ניתן להשתמש ביעילות כמויות גדולות של ssDNA נקיים במיוחד. כאן, אנו מתארים ננו-ספירה-PCR פרוטוקול המפרט איך ssDNA יכול להיות ביעילות מוגבר, הופרדו dsDNA פשוט על-ידי pipetting של צינורית תגובת ה-PCR. ההגברה של ssDNA יכול להיות מיושם כמו ריאגנטים פוטנציאליים עבור DNA microarray ותהליכים (שיטתית האבולוציה של ליגנדים על ידי העשרת מעריכית) דנ א-SELEX.
מבוא
דנ א חד גדילי (ssDNA) בהרחבה נחשב כרכיב הכרה מולקולרית (MRE) בשל תכונותיו מהותי עבור ה-DNA-DNA הכלאה1,2. פיתוח מערכות סינתטי ssDNA יכול להוביל יישומים ביולוגיים כגון ה-DNA מיקרו-מערכים3, oligotherapeutics, אבחון משולב חישה מולקולרי המבוסס על אינטראקציות משלימים4,5.
עד כה, חלקיקי הפולימר בקנה מידה מיקרומטר בהצלחה הוכחו באמצעות מכשירי microfluidic. מספר טכניקות microfluidic הוכחו להיות חזק להפקת microspheres מאוד הומוגנית על זרימה רציפה ב6,הסביבה microchannel
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור של פלטפורמה Microfluidic PDMS
- הכן 20 מ של נוזל PDMS prepolymer על ידי ערבוב בסיס פולימר ו זרז על יחס נפח של 10:1. יוצקים 10 מ"ל של הנוזל PDMS על גבי תבנית מוכנה SU-8 על רקיק סיליקון עבור החלק העליון של הרשת microfluidic. עבור החלק התחתון שטוח, יוצקים באותו אמצעי אחסון של PDMS נוזלי-פרוסות הסיליקון ללא מבנה עובש.
הערה: הרשת microfluidic הוא תוכנן בתוכנית CAD והוסב ואז photomask על מנת לפברק מאסטר באמצעות תהליך פוטוליתוגרפיה טיפוסי (ראה דמויות משלימה). המאסטר הזה מורכב כייר SU-8 photoresist שלילי פרוסות סיליקון11. - מניחים שתי פרוסות סיליקון מצופים prepolymer PDMS הנוזלי על פלטה ועל התרופה ב 75 מעלות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פלטפורמת ה-microfluidic מבוסס-droplet פולימריים מפוברק מורכב PDMS שתי שכבות (איור 1 א'). שלושה סוגים של רשתות ערוץ microfluidic משמשים ליצירת microspheres: 1) זרימה-התמקדות הגיאומטריה כפי שמוצג איור 1b, 2) ערוץ סרפנטין לערבוב פתרון אני והפתרון II ו- 3) ערוץ הפילמור ננו-ספירה התמצקות. הגובה של כל הערוצים היה 60 μm. אורך הערוץ עבור ערבוב ו הפילמור היו 74.35 מ מ, 94.45 מ מ, בהתאמה. רוחב microchannel עבור שני זורם נוזל immiscible ואח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מזהמים של dsDNA הם נושא מרכזי ב- ssDNA הגברה. זה נשאר קשה למזער את dsDNA הגברה קונבנציונאלי אסימטרי PCR הגברה15. בנוסף, למרות שיפורים טכניים ליצירת ssDNA אפשרו לנו להגדיל את היעילות של תפוקה של הדוגמה, בידוד ssDNA הוא עדיין בעייתי בשל העלויות הגבוהות שלה טיהור לא שלם לקידומם.
PCR אסימטרי הוא אחד מהשיטות המאתגרים ביותר המשמשים לעבודה עם ssDNA. שיטה זו חלה כמויות שוויוני של פריימר (למשל, 20: 1 יחס) על מנת לייצר כמויות גדולות של ssDNA. עם זאת, קשה מאוד למטב את כל .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי פרוייקט שכותרתו "קואופרטיב תכנית המחקר עבור חקלאות מדע & טכנולוגיה פיתוח (פרויקט מס ' PJ0011642) "ממומן על ידי המינהל לפיתוח כפרי, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה נתמכה גם בחלקו על ידי מענק (ה-NRF-2017R1A2B4012253) של התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן (ב- NRF) במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה גם נתמך על ידי מענק (N0000717) של התוכנית לחינוך עבור מדמין והתכנסות תעשייתי ממומן על ידי משרד המסחר, התעשייה, האנרגיה, הרפובליקה של קוריאה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פולידימתילסילוקסן נוזלי, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | רכיבי שבב |
| 40% אקרילאמיד: תמיסת ביס (19: 1) | רכיבי 1610140 ביו-ראד | של אמוניום פרסולפט הניתן לקופולימריזציה | |
| , APS | Sigma Aldrich | A3678 | מקשה של אקרילאמיד: תמיסת ביס |
| N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | זרז של אמוניום פרסולפט |
| שמן מינרלי | סיגמא אולדריץ' | M5904 | טבלה 1. פתרון III. רכיב של ריאגנטים מיקרוספריים |
| Cy3 המסומן בבדיקות אוליגונוקלאוטידים משלימות | Bioneer | סינתז | טבלה 3. מידע על רצף |
| ssDNA אקרידיט שכותרתו בדיקה | Bioneer | סינתזה | טבלה 1. פתרון I. רכיב של ריאגנטים מיקרוספריים |
| Tris | Biosesang | T1016 | רכיבים של מאגר TE, תמיסת חיץ pH |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | רכיבים של מאגר TE, הסרת יונים (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA הגברה |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Carl Zeiss | LSM 510 | זיהוי אוליגונוקלאוטידים חשיפה של משטח המיקרוספרה |
| מיקרוסקופ אור | Nikon Instruments Inc. | ליקוי חמה 80i | חישוב מספר מיקרוספירות |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA הגברה |
| כף יד מטפל בקורונה | אלקטרו-טכני | BD-20AC מעבדה | בקורונה טיפול משטח הידרופילי |
| פלטה חמה | כצלחת | HI-1000 | לריפוי משאבת מזרק PDMS נוזלית |
| kd מדעית | 78-1100 | זרימה אחידה של תמיסה I ופתרון II | |
| מדחס | Kohands | KC-250A | בקרת זרימה של Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | חישוב מספר המיקרוספירות |
מקורות
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatop....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
