מאמר שיטה

גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons

DOI:

10.3791/57703

⸱

14 בנובמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Natural Sciences, Chungbuk National University, 2Department of Biomedical Engineering, Inje University, 3Institute of Digital Anti-Aging Healthcare, Inje University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מספקת שיטה הזיוף של פלטפורמות מבוססות-droplet microfluidic לבין היישום של microspheres לזיהוי עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. שיטת ננו-ספירה-PCR מאפשר לקבל חד גדילי DNA amplicons מבלי המפריד בין שני גדילי ה-DNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet מאפשרים ייצור אמין microspheres הומוגנית בערוץ microfluidic, מתן הגודל מבוקרת של המורפולוגיה של ננו-ספירה שהושג. ננו-ספירה copolymerized עם בדיקה acrydite-DNA היה מפוברק בהצלחה. ניתן להשתמש בשיטות שונות כגון PCR אסימטרי, עיכול אקסונוקלאז, בידוד על מצופים streptavidin beads מגנטי לסנתז DNA חד-גדילי (ssDNA). עם זאת, שיטות אלה לא ניתן להשתמש ביעילות כמויות גדולות של ssDNA נקיים במיוחד. כאן, אנו מתארים ננו-ספירה-PCR פרוטוקול המפרט איך ssDNA יכול להיות ביעילות מוגבר, הופרדו dsDNA פשוט על-ידי pipetting של צינורית תגובת ה-PCR. ההגברה של ssDNA יכול להיות מיושם כמו ריאגנטים פוטנציאליים עבור DNA microarray ותהליכים (שיטתית האבולוציה של ליגנדים על ידי העשרת מעריכית) דנ א-SELEX.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנ א חד גדילי (ssDNA) בהרחבה נחשב כרכיב הכרה מולקולרית (MRE) בשל תכונותיו מהותי עבור ה-DNA-DNA הכלאה1,2. פיתוח מערכות סינתטי ssDNA יכול להוביל יישומים ביולוגיים כגון ה-DNA מיקרו-מערכים3, oligotherapeutics, אבחון משולב חישה מולקולרי המבוסס על אינטראקציות משלימים4,5.

עד כה, חלקיקי הפולימר בקנה מידה מיקרומטר בהצלחה הוכחו באמצעות מכשירי microfluidic. מספר טכניקות microfluidic הוכחו להיות חזק להפקת microspheres מאוד הומוגנית על זרימה רציפה ב6,הסביבה microchannel7.

במחקר של Lee. et al. 8, פלטפורמה מבוססת-droplet microfluidic לסינתזה microfluidic של הגברה oligo-ננו-ספירה, ssDNA copolymerizable, דווח. פלטפורמת microfluidic מורכב שתי שכבות PDMS (polydimethylsiloxane): חלק עליון עם רשת ערוץ microfluidic ליצירת ננו-ספירה ו תחתון חלק שטוח. הבאנדש שלושה סוגים של ערוצי fluidic PDMS: 1) זרם התמקדות ערוץ לדור droplet 2) ערוץ סרפנטין לערבוב שני פתרונות, 3) ערוץ הפילמור רציפים התמצקות ננו-ספירה. לאחר שני זורם immiscible הם הציגו לתוך ערוץ fluidic PDMS אחד, שאפשר להכריח את הזורם דרך מבנה צר דיזה. ההתנהגויות זרימה כגון ערוץ גאומטריה, קצב הזרימה צמיגות להשפיע על הגודל ועל מורפולוגיה של ננו-ספירה. לכן, ניתן לחלק לזרם המרכזי נוזלי microscale monospheres9,10.

. הנה, ננו-ספירה מפורט-PCR פרוטוקול מסופק עבור ההגברה של ssDNA. ראשית, מתואר תהליך עיצוב של התקן מבוסס-droplet microfluidic. לאחר מכן, הדרך באילו לזיהוי microspheres יכול להיות functionalized עם תבנית ה-DNA אקראית באופן משלים הוא הסביר. לבסוף, מוצג עבור הגברה ssDNA פרוטוקול ננו-ספירה-PCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור של פלטפורמה Microfluidic PDMS

  1. הכן 20 מ של נוזל PDMS prepolymer על ידי ערבוב בסיס פולימר ו זרז על יחס נפח של 10:1. יוצקים 10 מ"ל של הנוזל PDMS על גבי תבנית מוכנה SU-8 על רקיק סיליקון עבור החלק העליון של הרשת microfluidic. עבור החלק התחתון שטוח, יוצקים באותו אמצעי אחסון של PDMS נוזלי-פרוסות הסיליקון ללא מבנה עובש.
    הערה: הרשת microfluidic הוא תוכנן בתוכנית CAD והוסב ואז photomask על מנת לפברק מאסטר באמצעות תהליך פוטוליתוגרפיה טיפוסי (ראה דמויות משלימה). המאסטר הזה מורכב כייר SU-8 photoresist שלילי פרוסות סיליקון11.
  2. מניחים שתי פרוסות סיליקון מצופים prepolymer PDMS הנוזלי על פלטה ועל התרופה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    1. באופן ידני לקלף את השכבה PDMS ריפא מ כייר SU-8. ישר בקוטר 1.5 מ מ סביב החור כלי חבטות אל יציאת שמן על הרשת microfluidic משוכפל עבור התממשקות בקנה מידה מיקרון ערוצי זרימה עם דגימות הנוזל מאקרו. אגרוף החוצה דרך-החור באופן ידני.
    2. חזור על פעולה זו ניקוב תהליך שלוש פעמים על היווצרות שני פתרונות והנמל עודפים.
  3. מבצע הטיפול הידרופילית המשטח העליון והן PDMS הפקדות באמצעות treater corona ידניים12 עבור מספר שניות עבור כל דגימה.
    1. מחסנית שני שטופלו פלזמה PDMS השכבות ומחממים ב 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות צלחת חמה עבור תהליך האיחוי PDMS-אל-PDMS. אספקת מים בלחץ באמצעות המשאבה מזרק לתוך שלוש יציאות כניסת מליטה מבניים ולבדיקה דליפה של המכשיר מפוברק.

2. הפקת לזיהוי Oligo-Microspheres

  1. להכין חרוז-תערובת מפורט בטבלה1.
  2. מערבולת, בקצרה צנטריפוגה acrydite ssDNA תקן תוויות החללית (Ap, 100 μM) ואת acrylamide:bis (19:1) מניות פתרון.
  3. להכין פתרון אני על ידי ערבוב 25 μL של 40% אקרילאמיד המחייבת פתרון, 10 μL של ssDNA (acrydite העצמית), μL 10 5 מאגר x TBE (1.1 מ' טריס; מ מ 900 בוראט; 25 מ מ EDTA) ו- 5 μL של מים. להכין את הפתרון השני עם 50 μL של 20% קירור.
  4. להכין שני מזרקים בנפרד מלא פתרון אני והפתרון II, והר אותם לתוך למשאבה להציג פתרון זורם לתוך פלטפורמת microfluidic. להכין שמן מינרלי מעורבב עם 0.4% TEMED על משטח ייבוש של ננו-ספירה.
    הערה: TEMED הינו ידוע כמייצב רדיקלים חופשיים. רדיקלים חופשיים יכולים להאיץ את קצב היווצרות פולימר עם קירור (APS) על מנת לעודד אקרילאמיד הפילמור.
  5. למלא בקבוק זכוכית עם 4 מ של שמן מינרלי כדי ליצור זרימה רצופה.
  6. להוסיף שני צינורות כדי שתי יציאות הפקק של הבקבוק זכוכית כמו מאגר microfluidic: הנמל פנאומטיים להחלת ואוויר דחוס לתוך בקבוק הזכוכית את מדחס אוויר והנמל נוזלים לאספקת הנפט מווסת לרשת מיקרו ערוץ מהבקבוק זכוכית. לחבר את הצינורות בין בקבוק הזכוכית את נמל הנפט במכשיר microfluidic.
    1. להתחבר הצינורות פתרון שתי היציאות בהתקן microfluidic כדי לספק את הפתרונות שני ממשאבות מזרק. להכניס צינורות ליציאת ה-outlet כדי להעביר את ננו-ספירה שנוצר לתוך הספל.
  7. הגדר את קצב הזרימה של משאבת מזרק 0.4 - 0.7 מ ל/ה, התאם אוויר דחוס בלחץ של מדחס באמצעות הרגולטור (82-116 kPa). הגדר את מהירות הסיבוב (500 סל ד) של שורת פגים במיכל זכוכית על פלטה חמה. לנתח את משאבת מזרק והענק ואוויר דחוס שנוצר על ידי מדחס חיצוני לתוך בקבוק הזכוכית באמצעות הפקד ON/OFF של שסתומים אלקטרומגנטית13.
  8. להתבונן היווצרות של microspheres ב גאומטריה זרימה-התמקדות ומיצוק של microspheres שנוצר במיכל זכוכית עם מיקרוסקופ דיגיטלי.
    הערה: גודל וייצור ממהירות ננו-ספירה תלויים flowrate של פתרונות, למידת הלחץ המופעל על זרימת שמן מינרלי (טבלה 2).

3. ביצוע לזיהוי Oligo-Microspheres נחשב

  1. על כימות hemocytometer, לקחת כמות קטנה (כ-100 μL) של תמיסה מימית לזיהוי oligo-microspheres ומקום על hemocytometer זכוכית, ומלא בעדינות ההשעיה ננו-ספירה את הבאר לשכת ספירה.
    הערה: לקבלת פרטים נוספים, עיין http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
  2. השתמש מונה טלי מיקרוסקופ ויד לספור microspheres במערכת אחת 16 ריבועים. לאחר מכן, להעביר hemocytometer את הסט הבא של התא, תמשיכו לספור עד כל ארבע קבוצות של 16 פינות נספרים.
  3. לקבוע את ספירת הממוצע ננו-ספירה, לחשב את מספר microspheres חרוז ההשעיה המקורית.
  4. העברת μL 100 של microspheres צינור microcentrifuge 1.5 mL. הסר את תגובת שיקוע דרך עדין צריך שתוציאו (400 x גרם) ו pipetting.

4. ביצוע את ה-DNA הכלאה על פני השטח של Oligomicrosphere לזיהוי

הערה: זהות DNA בדיקה עם 5'-NH2-הקבוצה, במקום 5'-acrytide שינוי נוסף לתוך פתרון אני ונבדק המכילות Ap microspheres במקביל. תוצאות הדנ א הכלאה מוצגים באיור2. הפתרון רגשים (cAp) התווית על-ידי Cy3 oligonucleotide משלימים יוצב בחדר חשוך.

  1. Resuspend Cy3-קאפ באמצעות μL 100 1xTE מאגר (TE מאגר: 10 מ מ EDTA טריס, 1μM, pH 8.0) על מנת להשיג ריכוז סופי של 100 μM. לדוגמה, resuspend pmol 1 של קאפ ב- 100 מ של מאגר TE ואת העברת צינור microcentrifuge מכוסה ברדיד אלומיניום.
    הערה: רצפים סטרנד, עיין בטבלה 3.
  2. להוסיף 100 μM של Cy3-קאפ צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי המכיל microspheres Ap-copolymerized.
  3. הקש על הצינור כמה פעמים כדי לערבב דגירה בטמפרטורת החדר בחושך 1 h.
  4. למחוק את תגובת שיקוע ולהסיר מאגר שיורית דרך pipetting.
  5. לשטוף שלוש פעמים עם μL 500 טה המאגר.
  6. Resuspend microspheres על-ידי הקשה בעדינות את הצינור microcentrifuge. . אז, חזור על שלב 4.4.
  7. במקום microspheres על שקופיות זכוכית (75 מ"מ x 50 מ"מ) ומכסים ברדיד אלומיניום לפני הדמיה.

5. אסימטרית PCR עבור הגברה ssDNA

  1. להכין תערובת ריאגנט PCR אסימטרי הגברה ssDNA כדי להיות מנותח. להפשיר את ריאגנטים בטבלה 4 על קרח. אל תשמור את האנזים פולימראז Taq (U 50/µL) על קרח, אבל מעדיף לאחסן אותו ב-20 ° C עד שהוא נדרש.
  2. מערבולת בעדינות כל ריאגנטים, אז בקצרה צנטריפוגה צינורות ב 10,000 g x 10 s.
  3. שילוב כל ריאגנטים כפי שמתואר בטבלה 4.
  4. למקם את דגימות thermocycler ולהתחיל את ה-PCR אסימטרי בתנאים הבאים: 25 מחזורי (95 ° C ל 30 s, 52 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s), 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק ב 4 º C.

6. ננו-ספירה-PCR עבור הגברה ssDNA

הערה: סעיף זה מתאר הפרוטוקול עבור הגברה ssDNA בשפופרת תגובת ה-PCR. ננו-ספירה-PCR תגובות בוצעו ב- 50 μL של התגובה האחסון. רצפי מפורט נהגה להגביר ssDNA מפורטים בטבלה 5. במקרה זה, Ap על פני השטח של microspheres יכולים anneal לתבניות DNA אקראית באופן משלים. זהו צעד חשוב מאוד לייצור גדילי DNA משלימים (צירוף ד. נ antisense, איור 3). ה-DNA מורחב משמש כתבנית עבור הגברה ננו-ספירה-PCR.

  1. להכין תערובת ריאגנט ננו-ספירה-PCR. להפשיר את ריאגנטים טבלה 6 על הקרח; עם זאת, אל תשמור את האנזים פולימראז Taq על הקרח. אחסן אותו ב-20 ° C עד שהוא נדרש.
  2. מערבולת בעדינות כל ריאגנטים, אז בקצרה צנטריפוגה צינורות ב 10,000 g x 10 s.
  3. להשיג כ ~ 25 microspheres דרך ספירת מיקרוסקופיים.
    הערה: מספר microspheres בצינור אחד תגובה מחושבים באמצעות מיקרוסקופ אור עם 40 X הגדלה. על 25 ~ microspheres משמשים עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. מידע מפורט יותר הוא בשלב 3.
  4. שילוב כל ריאגנטים כפי שמתואר טבלה 6-
  5. למקם את דגימות thermocycler ולהתחיל את ה-PCR אסימטרי בתנאים הבאים: 25 מחזורי (95 ° C ל 30 s, 52 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s), 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק ב 4 º C.
  6. הגברה הבאים, להוסיף 8 μL של 6 x טעינת מאגר וטען μL 15 של כל מדגם לתוך 2% agarose ג'ל. לאחר מכן, לבצע אלקטרופורזה ב- 100 וולט למשך 35 דקות ב- 1 x TAE (טריס-אצטט-EDTA, 40 מ מ טריס אצטט, 1 מ מ EDTA, pH 8.2) מאגר.

7. מיקרוסקופיה קונפוקלית רכישה

הערה: התוצאות של ננו-ספירה-DNA בדיקה הכלאה הם עם תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. ניתוח תמונות מתבצעת באמצעות ImageJ.

  1. לתקן את microspheres hybridized לשלב של המיקרוסקופ בעל.
  2. בחר את הלייזר (לייזר הליום/ניאון, 543 קו ננומטר) ולהדליק בשליטה לייזר.
  3. בחר את העדשה המטרה בשליטה מיקרוסקופ.
  4. בחר את המסנן הרצוי עבור Cy3 וערוץ בבקרת תצורה.
  5. להתחיל את הניסוי ולבחון את הדגימה. הגדרות עבור מיקרוסקופ קונפוקלי מסוכמות בטבלה 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלטפורמת ה-microfluidic מבוסס-droplet פולימריים מפוברק מורכב PDMS שתי שכבות (איור 1 א'). שלושה סוגים של רשתות ערוץ microfluidic משמשים ליצירת microspheres: 1) זרימה-התמקדות הגיאומטריה כפי שמוצג איור 1b, 2) ערוץ סרפנטין לערבוב פתרון אני והפתרון II ו- 3) ערוץ הפילמור ננו-ספירה התמצקות. הגובה של כל הערוצים היה 60 μm. אורך הערוץ עבור ערבוב ו הפילמור היו 74.35 מ מ, 94.45 מ מ, בהתאמה. רוחב microchannel עבור שני זורם נוזל immiscible ואח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מזהמים של dsDNA הם נושא מרכזי ב- ssDNA הגברה. זה נשאר קשה למזער את dsDNA הגברה קונבנציונאלי אסימטרי PCR הגברה15. בנוסף, למרות שיפורים טכניים ליצירת ssDNA אפשרו לנו להגדיל את היעילות של תפוקה של הדוגמה, בידוד ssDNA הוא עדיין בעייתי בשל העלויות הגבוהות שלה טיהור לא שלם לקידומם.

PCR אסימטרי הוא אחד מהשיטות המאתגרים ביותר המשמשים לעבודה עם ssDNA. שיטה זו חלה כמויות שוויוני של פריימר (למשל, 20: 1 יחס) על מנת לייצר כמויות גדולות של ssDNA. עם זאת, קשה מאוד למטב את כל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי פרוייקט שכותרתו "קואופרטיב תכנית המחקר עבור חקלאות מדע & טכנולוגיה פיתוח (פרויקט מס ' PJ0011642) "ממומן על ידי המינהל לפיתוח כפרי, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה נתמכה גם בחלקו על ידי מענק (ה-NRF-2017R1A2B4012253) של התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן (ב- NRF) במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה גם נתמך על ידי מענק (N0000717) של התוכנית לחינוך עבור מדמין והתכנסות תעשייתי ממומן על ידי משרד המסחר, התעשייה, האנרגיה, הרפובליקה של קוריאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פולידימתילסילוקסן נוזלי, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184רכיבי שבב
40% אקרילאמיד: תמיסת ביס (19: 1)רכיבי 1610140 ביו-ראדשל אמוניום פרסולפט הניתן לקופולימריזציה
, APSSigma AldrichA3678מקשה של אקרילאמיד: תמיסת ביס
N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine, TEMEDSigma AldrichT9281זרז של אמוניום פרסולפט
שמן מינרליסיגמא אולדריץ'M5904טבלה 1. פתרון III. רכיב של ריאגנטים מיקרוספריים
Cy3 המסומן בבדיקות אוליגונוקלאוטידים משלימותBioneerסינתזטבלה 3. מידע על רצף 
ssDNA אקרידיט שכותרתו בדיקהBioneerסינתזהטבלה 1. פתרון I. רכיב של ריאגנטים מיקרוספריים
TrisBiosesang  T1016רכיבים של מאגר TE, תמיסת חיץ pH
EDTASigma AldrichEDSרכיבים של מאגר TE, הסרת יונים (Ca2+)
Ex taqTakaraRR001AssDNA הגברה
מיקרוסקופ קונפוקלי Carl ZeissLSM 510זיהוי אוליגונוקלאוטידים חשיפה של משטח המיקרוספרה
מיקרוסקופ אורNikon Instruments Inc.ליקוי חמה 80iחישוב מספר מיקרוספירות
T100 Thermal CyclerBio-rad1861096ssDNA הגברה
כף יד מטפל בקורונהאלקטרו-טכניBD-20AC מעבדהבקורונה טיפול משטח הידרופילי
פלטה חמהכצלחתHI-1000לריפוי משאבת מזרק PDMS נוזלית
kd מדעית78-1100זרימה אחידה של תמיסה I ופתרון II
מדחסKohandsKC-250Aבקרת זרימה של Solution III
Bright-Line HemacytometerSigma AldrichZ359629חישוב מספר המיקרוספירות
טיפול חימום

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
  2. Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays. Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).
  3. Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
  4. Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
  5. Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
  6. Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
  7. Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
  8. Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).
  9. Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
  10. Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
  11. McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
  12. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
  13. Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
  14. Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6(2003).
  15. Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRPDMSDNA SELEX

מאמרים קשורים