Method Article

מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוק לדמיין Effectors מועברת בין חיידקים במהלך זיהום

DOI:

10.3791/57719

⸱

May 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים, אחד מסוכני סיבתי החשוב ביותר של מחלות שונות, מפרישים קבוצת אפקטור חלבונים בתא צמח המארח כדי לערער את המערכת החיסונית של הצמח. במהלך זיהום cytoplasmic effectors מועברות ציטוזול מארח דרך סוג מערכת הפרשת השלישי (T3SS). לאחר הלידה בתא צמח, effector(s) מטרות של compartment(s) ספציפיים כדי לווסת את תהליכי התא מארח עבור הישרדות, שכפול של המחלה. אמנם יש כבר כמה מחקרים לוקליזציה subcellular אפקטור חלבונים בתאי המארח כדי להבין את תפקידם בפתוגניות באמצעות חלבונים פלורסנט, חקירה של הדינמיקה של effectors מוזרק ישירות מחיידקים מאתגרת בשל בעיית אי התאימות בין T3SS לבין חלבונים פלורסנט.

כאן, אנו מתארים את השיטה האחרונה שלנו מפוצל ממוטב superfolder חלבון פלואורסצנטי ירוק במערכת (sfGFPהכבושים) לדמיין הלוקליזציה של effectors באמצעות T3SS חיידקי התא המארח. SfGFP11 (11ה β-גדיל של sfGFP)-אפקטור מתויג מופרש דרך T3SS יכול להיות שהתכנסה עם אברון ספציפי ממוקד sfGFP1-10OPT (1-10בתאנון β-גדיל של sfGFP) מוביל פליטת קרינה פלואורסצנטית באתר. פרוטוקול זה מספק הליך להמחיש את האות זריחה sfGFP משוקם עם חלבון אפקטור מ Pseudomonas syringae אברון מסוים את הצמחים תודרנית , טבק benthamiana .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמחים הם אורגניזמים sessile המפגש פתוגנים פולשים רבים, כולל חיידקים, פטריות, וירוסים, חרקים, נמטודות לאורך כל מחזור החיים שלהם. בקרב phytopathogens, פתוגנים חיידקי גראם שליליים כגון Pseudomonas spp. ו- Ralstonia spp., להדביק צמחים פונדקאים שלהם על-ידי הזנת דרך פצעים או פתחים טבעיים, כגון הפיוניות, hydathode1. ליישב בהצלחה צמחים פונדקאים, פתוגנים חיידקיים התפתחו לפתח מגוון של גורמים התקפה אלימה2. כאשר חיידקים לפלוש צמח המארח, הם מזריקים סדרה של התקפה אלימה חלבונים – המכונה effectors — ישירות לתוך תאי צמחים כדי לקדם פתוגניות שלהם. Effectors האלה לדכא או לווסת את הצמח מולדת חסינות ולטפל התהליכים הסלולר מאר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הפעולות מבוצעות בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.

1. הכנה של חומרים צמח (4 שבועות)

  1. הכנה הצמחים benthamiana ש
    1. לזרוע 2 זרעי benthamiana (ש ע) על פני אדמת כל הסיר, מכסים את המגש עם כיפה פלסטיק, ולאפשר הזרעים לנבוט ב- 25 ° C, 60% לחות הצמיחה קאמרית עם מחזור 16/8-h/כהה photoperiod.
    2. אחרי שבועיים, לבחור למחוק שתיל הקטן ביותר בכל סיר ו להמשיך לגדל צמחים בתנאים צמיחה אותו כפי שהוא מיושם עבור הנביטה בשלב 1.1.1. להוסיף 1 ליטר של מים למגש כל יומיים.
      הערה: תנאי גידול הצמחים עשויים להשתנות על פני מעבדות. לכן, לפי התקנון השקיה רגיל כדי לגדל את הצמח במצב בריא.
    3. בעוד שבוע, להעביר את הצמחים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המבנה β-חבית של GFP מורכב של קווצות β 11 ואת ניתן לחלק שני קטעים, 1-10בתאנון סטראנד (GFP1-10OPT) ומלון סטראנדth (GFP11) 11. למרות של פלורסנט בכוחות עצמם שני קטעים, sfGFP עצמית שהורכב שמתרגל את זריחה כאשר קיימים שני קטעים בסמיכות (איור 1 א'). במערכת זו, sfGFP1-10OPT-צמחים תודרנית או benthamiana ש מחוסנים עם Pseudomonas נושא של אפקטור sfGFP11 מתויג. אפקטור sfGFP11 מתויג מועברים על ידי Ps.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן משמש לניטור לוקליזציה מדויק של החלבונים אפקטור מוזרק על ידי רופא חיידקי T3SS לתוך התא הפונדקאי צמח על זיהום. בעבר, מערכת ה-GFP פיצול שימש ככלי ללמוד את subcellular לוקליזציה של יונקים חלבונים23,36, סלמונלה T3E לוקליזציה ומסירת Agrobacterium VirE2 דרך T4SS לתוך צמח תאים37. כדי להחיל מערכת זו בתאי הצמח, מחקרים קודמים משמש הטרנסגניים תירס צמח צורונים שיבטא את GFP1 cytoplasmic-10 ופטריות מהונדס, פחמון.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר מדע בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע, ICT תכנון עתידי (ה-NRF-2018R1A2A1A05019892) הבירה ועל ידי מענק של מרכז רבייה מולקולרית של צמחים ( PMBC) של התוכנית 21 Biogreen ' הדור הבא ' של המינהל לפיתוח כפרי (PJ013201) כדי EP. אנו מודים למרכז הדמיה של המרכז הלאומי מכשור לניהול סביבתי לספק מיקרוסקופ קונפוקלי לצלם.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Arabidopsis קווים טרנסגניים Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
<חזק>ממוקד אברונים sfGFP1-10OPT פלסמידפארק, א., לי, ה.י., וו, ג'יי., צ'וי, ד. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-tagged וקטור תואם שער עבור מערכת אספקת אפקטורים מבוססת T3SSפארק, א., לי, ה.י., וו, ג'יי., צ'וי, ד. & Dinesh-Kumar, S. P. ניטור מרחבי-זמני של אפקטורים של Pseudomonas syringae באמצעות הפרשה מסוג III באמצעות שברי חלבון פלואורסצנטי מפוצלים. תא צמחי. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני קנמיצין (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; עמיד בפני גנטמיצין (25 ug/ml)
<זני חיידקים חזקים>
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz and Jeff Schell, המקדם של גן TL-DNA 5 שולט בביטוי הספציפי לרקמה של גנים כימריים הנישאים על ידי סוג חדש של וקטור בינארי Agrobacterium. מול ג'נט ג'נט. 204,383-396 (1986); עמיד בפני גנטמיצין (50 ug/ml) וריפמפיצין (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. et al. מחיקות ברפרטואר של Pseudomonas syringae pv. עגבניות DC3000 סוג III של גנים אפקטור הפרשה חושפות חפיפה תפקודית בין אפקטורים. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; עמיד בפני ריפמפיצין (100 ug/ml)
<חזק>רכיבי מדיה
<חזק>מצע נביטת צמחיםהוסף 2.165 גרם/ליטר Murashige & אבקת סקוג, 10 גרם/ליטר סוכרוז למים. התאימו ל-pH 5.8 והוסיפו 2.2 גרם/ליטר פיטגל. אוטוקלבה.
מוראשיג'ה & Skoog בינוני כולל ויטמיניםDuchefa BiochemieM0222חנות ב -4 מעלות צלזיוס.
סוכרוזDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
<חזק>LB מדיהלהוסיף 10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl למים. למדיה מוצקה, הוסף 15 גרם/ליטר מיקרו אגר. אוטוקלאב.  יש לאפשר לתמיסה להתקרר ל-55 מעלות; C, ולהוסיף אנטיביוטיקה במידת הצורך.
TryptoneBD Bioscience211705
תמצית שמריםBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
מיקרו אגרDuchefa BiochemieM1002
King's B media10 גרם/ליטר פרוטאז פפטון #2, 1.5 גרם/ליטר K2HPO4, 15 גרם/ליטר אגר למים. חיטוי. להתקרר ל-55 מעלות; C ולהוסיף למדיום 15 מ"ל/ליטר גליצרול סטרילי, 5 מ"ל/ליטר MgSO4. הוסף אנטיביוטיקה במידת הצורך.
פרוטאוז פפטוןBD Bioscience212120
נטול מים K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
גליצרולDuchefa BiochemieG1345
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Bacto AgarBD Bioscience214010
חומר נוזלי <חזק>מניטול-גלוטמט (MG) הוסף 10 גרם/ליטר מניטול, 2 גרם/ליטר חומצה L-גלוטמית, 0.5 גרם/ליטר KH<תת>2PO<תת>4, 0.2 גרם/ליטר NaCl ו-0.2 גרם/ליטר MgSO<תת>4 למים. התאם ל-pH 7
מניטולDuchefa BiochemieM0803
חומצה L-גלוטמיתDuchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
מאגר10 מ"מ MES (2-(N-morpholino)-אתאן חומצה סולפונית), 10 מ"מ MgCl2, 150 ומיקרו; M אצטוסירינגון. pH 5.6; הכן חיץ טרי לפני השימוש.
MESDuchefa BiochemieM1503הכינו מלאי של 100 מ"מ (pH 5.6) במים. מסננים לעקר.
MgCl2Sigma-AldrichM8266הכן מלאי של 100 מ"מ במים. חיטוי.
אצטוסירינגוןסיגמא-אולדריץ'D134406הכן מלאי של 150 מ"מ ב-DMSO.
מיקרוסקופ קונפוקלי ציוד/חומרים
710 סריקת לייזר מערכת קונפוקליתCarl Zeiss
Axio observer Z1 מיקרוסקופ הפוךCarl Zeiss
Propidium iodideThermoFisherP1304MP
הסתננות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invas....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Split GFP SystemEffector Protein DeliveryType III Secretion SystemConfocal MicroscopyPseudomonas SyringaeArabidopsis ThalianaNicotiana BenthamianasfGFP11 TagOrganelle TargetingFluorescence Reconstitution

Related Articles