מאמר שיטה

וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה מודדים פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של תאי שריר הלב לאחר היפוקסיה/Reoxygenation

DOI:

10.3791/57725

⸱

13 ביולי 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה JC-1 צבע כדי להעריך את פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של התאים לאחר נחשפים היפוקסיה/reoxygenation עם או בלי סוכן מגן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה reperfusion מתוזמן ויעיל של העורק הראשי occluded היא האסטרטגיה הטובה ביותר עבור הפחתת גודל לאוטם שריר הלב בחולים עם מקטע ST גבוהות אוטם שריר הלב. עם זאת, פגיעה reperfusion כשלעצמה יכול לגרום עוד יותר cardiomyocyte מוות, תופעה הידועה כ פגיעה reperfusion פציעה. הפתח של הנקבובית המעבר חדירות מיטוכונדריאלי (mPTP), עם ירידה של קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים (MMP) או מיטוכונדריאלי דפולריזציה, אוניברסלית מזוהה כמספר השלב הסופי של פגיעה פגיעה reperfusion, אחראי על מיטוכונדריאלי ומוות cardiomyocyte. JC-1 הוא צבע cationic lipophilic שמצטבר בתוך המיטוכונדריה בהתאם לערך של MMP. הוא MMP גבוה יותר, וככל JC-1 מצטבר בתוך המיטוכונדריה. כמויות הולכות וגדלות של JC-1 בתוך המיטוכונדריה יכולים להשתקף על-ידי שינוי פליטת קרינה פלואורסצנטית מירוק (~ 530 ננומטר) אדום (~ 590 ננומטר). לכן, ההפחתה של היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית אדום/ירוק ניתן לציין את דפולריזציה של המיטוכונדריה. כאן, אנחנו לוקחים את היתרון של JC-1 כדי למדוד MMP, או הפתח של mPTP של תאי שריר הלב האנושי לאחר היפוקסיה/reoxygenation, זוהה על ידי cytometry זרימה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת לב כלילית היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. טיפול הבחירה עבור הפחתת איסכמי והגבלת גודל לאוטם בחולים עם ST-קטע גבוהות אוטם שריר הלב הוא בזמן ויעילים שריר הלב פגיעה reperfusion דרך הראשית התערבות כלילית מלעורית (PCI)1, 2. עם זאת, פגיעה reperfusion גורמת לנזק נוסף, אשר יכול להסביר עד 30 אחוזים של גודל לאוטם הסופי3. זה הוא טרטוריות כי הנקבובית המעבר חדירות מיטוכונדריאלי (mPTP) אינה רק המרכזית נזק מיטוכונדריאלי ומוות תא במהלך איסכמיה/פגיעה reperfusion (אני / R), אבל הוא גם יעד משולבות של נמצא איתות4 , 5. כמו הפתח mPTP תמיט דפולריזציה של הממברנה הפנימית מיטוכונדריאלי (MMP) פוטנציאל4, הבחנו mPTP פתיחה באמצעות ה-5, יונקות, בתו 6′-בסדר-1, 6, 3, 3′-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) וזמינותו.

וזמינותו JC-1 היא שיטה cytofluorimetric כי הוא גם איכותי וגם כמותית, זה אומתה עוד יותר על-ידי ניתוח של MMP ברמה של המיטוכונדריה יחידה6. JC-1 קיים טופס צבור, מניב אדומה תפוזים בצבע פליטה (590 ± 17.5 ננומטר) המטריצה של המיטוכונדריה עם MMP נורמלי; עם אובדן MMP, JC-1 מומר לטופס monomeric המניבה פלורסצנטיות ירוק עם פליטה של 530 ± 15 ננומטר. לכן, ירידה ברמת היחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית אדום/ירוק יכול להצביע על ההפחתה של MMP במצבים כגון איסכמיה/פגיעה reperfusion (אני / R).

בנוסף JC-1, MMP למד גם אצל קרום חדיר קטיונים lipophilic כגון Rhodamine 123 ו- 3, 3′-dihexyloxadicarbocyanine יודיד [DiOC6(3)]. עם זאת, בהשוואה לאלה שני רגשים, JC-1 הוא אמין יותר לניתוח MMP. Rhodamine 123 יש רגישות הדלה יחסית (במיוחד ב שכבתה מצב7,8) וספציפיות המסכן. התזוזה בממוצע rhodamine 123 לפעמים הוא כל כך קטן כי זה קשה עבור חוקרים או ציוד להתבונן/לזהות. חוץ מזה, בתא בודד, ישנם אתרי קישור מיטוכונדריון שונים עבור rhodamine 123, אז זה עשויה להיות פליטת קרינה פלואורסצנטית שונים9. DiOC6(3) אינו מומלץ לגילוי MMP או כפי זה מגיב ברגישות דפולריזציה של קרום פלזמה10.

לכן, כאן אנו משתמשים וזמינותו JC-1 כדי להעריך את MMP HCMs לאחר נחשפים היפוקסיה/reoxygenation עם או בלי סוכן מגן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

  1. להכין בינוני מלא האנושי של תאי שריר הלב (HCMs) על-ידי הוספת 25 מ של מדיום הגידול Myocyte תוספת לערבב עד 500 מ"ל של מדיום הגידול Myocyte לפי הוראות היצרן. החנות 4 ° C וחמים עד 37 ° C לפני השימוש.
  2. הכנת Tongxinluo (TXL) פתרון על ידי המסת אבקת חדה במיוחד TXL סרום/גלוקוז ללא של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (DMEM) ולהתאים את ריכוז TXL כדי µg 400/mL על-ידי הוספת DMEM (לקבלת פרטים נוספים, ראה11). החנות 4 ° C וחמים עד 37 ° C לפני השימוש.
  3. להכין 5 מ של הפתרון עובד JC-1 על-ידי הוספת µL 25 מניות פתרון (200 x) JC-1, 4 מיליליטר מים הנדסה גנטית ו 1 מ"ל של מניות מכתים מאגר (5 x) בשפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל בחושך. Pipette את התערובת לאורך מספר פעמים וחם עד 37 ° C לפני השימוש.
  4. הכנת 30 מ של עובדים מאגר צביעת על-ידי הוספת 24 מ ל מים הנדסה גנטית 6 מ של מניות מכתים מאגר (5 x) בשפופרת צנטרפוגה 50 מ. השתמש פתרון זה קרה כקרח.

2. הקמת מודל היפוקסיה/Reoxygenation

  1. צלחת 1.0 x 105 תאים לכל באר עם HCM להשלים במדיום צלחת טוב 6. לגדול כדי להגיע עם confluency של 70% חממה התא המכיל 5% CO אוויר2 ו- 95% ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. לשטוף HCMs עם פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS). חושפים אותם בפני טיפולים שונים (400 µg/mL TXL או לא) ב 2 מ של סרום/גלוקוז ללא DMEM למשך 30 דקות לפני היפוקסיה ב חממה התא המכיל 5% CO אוויר2 ו- 95% ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. דגירה HCMs בצנצנת אטום של חמצן (2.5 L) מצוידים עם זרז ניקוי חמצן חופשי, זירוז היפוקסיה עבור 18 h (איור 1 א'), ומחוון אנאירובית כדי למדוד את המתח חמצן בינוני11,12, 13, בחממה התא המכיל 5% CO אוויר2 ו- 95% ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: זה לוקח בערך 1.5 h עבור catalyst ל ניקוי חמצן חופשי בצנצנת. לכן, HCMs נשמרים בצנצנת עבור 19.5 h לפני פתיחת הצנצנת. הצבע של מחוון אנאירובית משתנה מכחול בהיר בסביבה normoxic לבן חיוור במצב ובשפתיים (איור 1B).
  4. Reoxygenate HCMs על-ידי הזזת את הצלחת היטב 6 בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס המכילה 5% CO אוויר2 ו- 95% עבור 2 h.

3. הכנה של HCMs עבור Cytometry זרימה

  1. לחמם את פתרון חומצה (EDTA) טריפסין-ethylenediaminetetraacetic 0.25% ו- PBS כדי 37 מעלות צלזיוס.
  2. וביופסיה בינוני מכל טוב, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ולהוסיף 0.5 מ של 0.25% טריפסין לאורך החומה של הבאר.
  3. דגירה ב 37 ° C עד כל HCMs כמעט מנותק (בערך 1 דקות).
  4. להוסיף 1 מ"ל DMEM מלאה בינוני (DMEM בינוני עם 10% סרום שור עוברית) הבארות לנטרל את טריפסין. להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, גלולה HCMs על ידי צריך שתוציאו ב 500 g x למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.
  6. להוסיף 0.5 מ"ל של HCM בינוני מלא ו- 0.5 מ של הפתרון עובד JC-1 כל שפופרת. Resuspend את HCMs על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  7. מכסה כל הצינורות ברדיד אלומיניום, כדי למנוע הלבנת המחוון פלורסנט, תקופת דגירה HCMs בתנאים נורמליים (ב 37 מעלות צלזיוס המכילה 5% CO2 ו- 95% אוויר) של 20 דקות.
  8. HCMs צנפה מאת צריך שתוציאו ב 500 g x עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.
  9. לשטוף HCMs פעמיים עם 2 מ"ל כקרח מאגר מכתימים JC-1.
  10. Resuspend HCMs באמצעי אחסון הסופי של µL 300 קר כקרח מכתימים המאגר בצינור מדגם (12 מ"מ x 75 מ"מ) ולהשתמש התאים לניתוח בתוך 30 דקות.
    הערה: השתמש קרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), מעכב חזק של שרשרת הנשימה תחבורה אלקטרון, טיפול HCMs h 1 ריכוז של 20 מיקרומטר, עבור הפקד חיובי.

4. זרימה Cytometer ההתקנה

  1. להתחיל את cytometer זרימה ולהבטיח כי התוכנה מחובר אליו.
  2. לבצע אתחול פלואידיקה, להתחיל את הזרם ולהגדיר את breakoff.
  3. החלונות הפתוחים של מגרש נקודה שני בתוכנה cytometry זרימה.
    1. קדימה בחר פזורים אור (FSC) בציר ה-X ואת הצד מפוזרים האור (האס) על ציר Y בחלקה הראשון ' נקודה ' כדי לייצג את המאפיינים של התאים מבחינת גודלם, צפיפות שלהם, בהתאמה.
    2. בחר PE (575 ± 26 ננומטר) זיהוי הערוץ עבור ציר Y ו- FITC (530 ± 30 ננומטר) עבור ציר ה-X באמצעות לוגריתמי בעלילה נקודה שנייה, אשר נמצא בשימוש כדי למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית JC-1 צבע בתאים.

5. לזרום Cytometry מדידה וניתוח נתונים

  1. לחץ על ביטול טעינה לתת את הצינור לתמוך בזרוע ומקם את ריק (HCMs זה לא היה כבר לצבוע עם JC-1) מדגם צינור על זה. לחץ על טען כדי להחזיר את הזרוע תמיכה צינור למיקום העבודה.
  2. לחץ על רשומה כדי לאסוף חלקיקי מהשעיה בצינור מדגם ריק ואז שער האוכלוסייה תא (P1) לצורך ניתוח נוסף בעלילה נקודה ראשונה (איור 3).
  3. לאסוף HCMs צינורות אחרים דוגמת ולמטב את המדידה על-ידי התאמת החשמלי של ערוצי פלורסצנטיות, כדי לוודא כי הנקודה תא ממוקם באזור מרכזי של העלילה נקודה שנייה.
  4. הצגת הנתונים הסטטיסטיים של כל שפופרת מדגם ולחשב את MMPs של כל דגימה על-ידי חלוקת היחס בעוצמה פלואורסצנטי אדום על ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק בעוצמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפני ביצוע וזמינותו JC-1 כדי להעריך את השינויים של MMP, מומלץ מאוד כי ניסויים להתבצע כדי לאשר את התנאים בהצלחה הגדר על ידי החוקרים. כפי שמוצג על ידי התוצאות cytometry זרימה (איור 2), בהשוואה עם הקבוצה נורמלי, היפוקסיה/reoxygenation (H/R) המושרה באופן משמעותי את אפופטוזיס של HCMs (Annexin V + /PI±), המציין כי אנו שהוקם מודל המבוסס על תאים של אני / R (45.00 ± 2.13% לעומת. 11.50 ± 0.18% בקבוצה רגילה, p < 0.05). Tongxinluo, הרפואה הסינית המסורתית עם ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה JC-1 צבע כדי להעריך את MMP של תאים לאחר חשיפה H/ר זוהה על ידי assay JC-1, MMP של תאים הוא עצמאי של גורמים כגון גודל מיטוכונדריאלי, הצורה צפיפות שעשוי להשפיע על רכיב יחיד קרינה פלואורסצנטית אותות14. כתוצאה מכך, התוצאות של JC-1 assay אמינים יחסית. חוץ מזה, זה נוח, לחיסכון בזמן כדי לבצע את הבדיקה JC-1. Assay הזה יש דרישה נמוכה עבור חומרים, ריאגנטים, והוא בדרך כלל, זה לוקח פחות מ 1.5 h לעשות צביעה, של ניתוק התא למדידה MMP.

לא ניתן להפריז כמה צ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקים המחקר מפתח הלאומי, פיתוח תוכנית של סין (מספר 2017YFC1700503), התכנית הלאומית למחקר בסיסי (תוכנית 973) של סין (No.2012CB518602), נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מס 81370223 ו 81573957 מס), Postgraduates' קרן מחקר חדשניים של פקין האיגוד הרפואי המכללה (2016-1002-01-02).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בדיקת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית עם JC-1Beyodtime, סיןC2006בערכה יש פתרון מלאי JC-1 (200 פעמים;), מאגר צביעה מלאי (5&) ו-CCCP (10mM)
Tongxinluo אבקה אולטרה-דקהShijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., סין071201
Annexin V-FITC/PI KITבקטון-דיקינסון, ארה"ב556547
DMEMLife Technologies, Grand Island Biological Company, ארה"ב11966-025
מיוציט לב אנושי, גרמניהC-12810
מדיום גידול מיוציטים
(SupplementMix)		Promocell, גרמניהC-39275
מדיום גידול מיוציטים (מוכן לשימוש)Promocell, גרמניהC-22070בשימוש עם מדיום גידול מיוציטים SupplementMix
GENboxBioMé rieux, מרסי ל' אטואל, צרפת961272.5 ליטר
(AnaeroPack)מיצובישי גז כימיקלים  חברה, בע"מ , יפן  C-1
אינדיקטור אנאירוביBioMé rieux, מרסי ל' אטואל, צרפת96118
ציטומטר זרימהבקטון-דיקינסון, ארה"בFACSAria 2
BD FACSDiva SoftwareBecton-Dickinson, ארה"בגרסה 8.0.1
צינור דגימהמדע קורנינג, ארה"ב352054 12*75 מ"מ
PBSHyclone, ארה"בSH30256.01
פרומוסל קטליזטור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
  3. Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
  4. Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
  5. Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
  6. Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
  7. Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
  8. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  9. Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).
  10. Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
  11. Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).
  12. Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
  13. Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
  14. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
  15. Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
  16. Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).
  17. Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
  18. Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
  19. Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
  20. Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
  21. Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
  22. Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
  23. El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).
  24. Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Flow Cytometry AssayJC 1 DyeRed Green RatioMitochondrial DepolarizationPermeability Transition PoreCell IsolationFluorescence Detection

מאמרים קשורים