כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה JC-1 צבע כדי להעריך את פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של התאים לאחר נחשפים היפוקסיה/reoxygenation עם או בלי סוכן מגן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה מודדים פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של תאי שריר הלב לאחר היפוקסיה/Reoxygenation
במאמר זה
סיכום
תקציר
פגיעה reperfusion מתוזמן ויעיל של העורק הראשי occluded היא האסטרטגיה הטובה ביותר עבור הפחתת גודל לאוטם שריר הלב בחולים עם מקטע ST גבוהות אוטם שריר הלב. עם זאת, פגיעה reperfusion כשלעצמה יכול לגרום עוד יותר cardiomyocyte מוות, תופעה הידועה כ פגיעה reperfusion פציעה. הפתח של הנקבובית המעבר חדירות מיטוכונדריאלי (mPTP), עם ירידה של קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים (MMP) או מיטוכונדריאלי דפולריזציה, אוניברסלית מזוהה כמספר השלב הסופי של פגיעה פגיעה reperfusion, אחראי על מיטוכונדריאלי ומוות cardiomyocyte. JC-1 הוא צבע cationic lipophilic שמצטבר בתוך המיטוכונדריה בהתאם לערך של MMP. הוא MMP גבוה יותר, וככל JC-1 מצטבר בתוך המיטוכונדריה. כמויות הולכות וגדלות של JC-1 בתוך המיטוכונדריה יכולים להשתקף על-ידי שינוי פליטת קרינה פלואורסצנטית מירוק (~ 530 ננומטר) אדום (~ 590 ננומטר). לכן, ההפחתה של היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית אדום/ירוק ניתן לציין את דפולריזציה של המיטוכונדריה. כאן, אנחנו לוקחים את היתרון של JC-1 כדי למדוד MMP, או הפתח של mPTP של תאי שריר הלב האנושי לאחר היפוקסיה/reoxygenation, זוהה על ידי cytometry זרימה.
מבוא
מחלת לב כלילית היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. טיפול הבחירה עבור הפחתת איסכמי והגבלת גודל לאוטם בחולים עם ST-קטע גבוהות אוטם שריר הלב הוא בזמן ויעילים שריר הלב פגיעה reperfusion דרך הראשית התערבות כלילית מלעורית (PCI)1, 2. עם זאת, פגיעה reperfusion גורמת לנזק נוסף, אשר יכול להסביר עד 30 אחוזים של גודל לאוטם הסופי3. זה הוא טרטוריות כי הנקבובית המעבר חדירות מיטוכונדריאלי (mPTP) אינה רק המרכזית נזק מיטוכונדריאלי ומוות תא במהלך איסכמיה/פגיעה reperfusion (אני / R), אבל הוא גם יעד משולבות של נמצא איתות4 , 5. כמו הפתח mPTP תמיט דפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ריאגנטים ופתרונות
- להכין בינוני מלא האנושי של תאי שריר הלב (HCMs) על-ידי הוספת 25 מ של מדיום הגידול Myocyte תוספת לערבב עד 500 מ"ל של מדיום הגידול Myocyte לפי הוראות היצרן. החנות 4 ° C וחמים עד 37 ° C לפני השימוש.
- הכנת Tongxinluo (TXL) פתרון על ידי המסת אבקת חדה במיוחד TXL סרום/גלוקוז ללא של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (DMEM) ולהתאים את ריכוז TXL כדי µg 400/mL על-ידי הוספת DMEM (לקבלת פרטים נוספים, ראה11). החנות 4 ° C וחמים עד 37 ° C לפני השימוש.
- להכין 5 מ של הפתרון עובד JC-1 על-ידי הוספת µL 25 מניות פתרון (200 x) JC-1, 4 מיליליטר מים הנדסה גנטית ו 1 מ"ל של מניות מכתים מאגר (5 x) בשפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל בחו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לפני ביצוע וזמינותו JC-1 כדי להעריך את השינויים של MMP, מומלץ מאוד כי ניסויים להתבצע כדי לאשר את התנאים בהצלחה הגדר על ידי החוקרים. כפי שמוצג על ידי התוצאות cytometry זרימה (איור 2), בהשוואה עם הקבוצה נורמלי, היפוקסיה/reoxygenation (H/R) המושרה באופן משמעותי את אפופטוזיס של HCMs (Annexin V + /PI±), המציין כי אנו שהוקם מודל המבוסס על תאים של אני / R (45.00 ± 2.13% לעומת. 11.50 ± 0.18% בקבוצה רגילה, p < 0.05). Tongxinluo, הרפואה הסינית המסורתית עם ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה JC-1 צבע כדי להעריך את MMP של תאים לאחר חשיפה H/ר זוהה על ידי assay JC-1, MMP של תאים הוא עצמאי של גורמים כגון גודל מיטוכונדריאלי, הצורה צפיפות שעשוי להשפיע על רכיב יחיד קרינה פלואורסצנטית אותות14. כתוצאה מכך, התוצאות של JC-1 assay אמינים יחסית. חוץ מזה, זה נוח, לחיסכון בזמן כדי לבצע את הבדיקה JC-1. Assay הזה יש דרישה נמוכה עבור חומרים, ריאגנטים, והוא בדרך כלל, זה לוקח פחות מ 1.5 h לעשות צביעה, של ניתוק התא למדידה MMP.
לא ניתן להפריז כמה צ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים המחקר מפתח הלאומי, פיתוח תוכנית של סין (מספר 2017YFC1700503), התכנית הלאומית למחקר בסיסי (תוכנית 973) של סין (No.2012CB518602), נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מס 81370223 ו 81573957 מס), Postgraduates' קרן מחקר חדשניים של פקין האיגוד הרפואי המכללה (2016-1002-01-02).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת בדיקת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית עם JC-1 | Beyodtime, סין | C2006 | בערכה יש פתרון מלאי JC-1 (200 פעמים;), מאגר צביעה מלאי (5&) ו-CCCP (10mM) |
| Tongxinluo אבקה אולטרה-דקה | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., סין | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI KIT | בקטון-דיקינסון, ארה"ב | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, ארה"ב | 11966-025 | |
| מיוציט לב אנושי | , גרמניה | C-12810 | |
| מדיום גידול מיוציטים (SupplementMix) | Promocell, גרמניה | C-39275 | |
| מדיום גידול מיוציטים (מוכן לשימוש) | Promocell, גרמניה | C-22070 | בשימוש עם מדיום גידול מיוציטים SupplementMix |
| GENbox | BioMé rieux, מרסי ל' אטואל, צרפת | 96127 | 2.5 ליטר |
| (AnaeroPack) | מיצובישי גז כימיקלים חברה, בע"מ , יפן | C-1 | |
| אינדיקטור אנאירובי | BioMé rieux, מרסי ל' אטואל, צרפת | 96118 | |
| ציטומטר זרימה | בקטון-דיקינסון, ארה"ב | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, ארה"ב | גרסה 8.0.1 | |
| צינור דגימה | מדע קורנינג, ארה"ב | 352054 12*75 מ"מ | |
| PBS | Hyclone, ארה"ב | SH30256.01 |
מקורות
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for th....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
