מאמר שיטה

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

DOI:

10.3791/57758

⸱

1 ביוני 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות זיהומיות המועברת על ידי וקטורים arthropod ימשיכו להוות איום משמעותי על בריאות האדם ברחבי העולם. פתוגנים גרימת מחלות אלו, אינם קיימים בבידוד כאשר הם ליישב את הווקטור; במקום זאת, הם כנראה לעסוק אינטראקציות עם מיקרואורגניזמים תושב ב לומן מעיים. Microbiota וקטור הוכח כדי לשחק תפקיד חשוב בפתוגן שידור עבור מספר מחלות נישאות וקטור. בין אם תושב חיידקים בבטן של השניה Ixodes scapularis , הוקטור של מספר פתוגנים האנושי כולל Borrelia burgdorferi, להשפיע על השידור שנתות של פתוגנים לא נקבע. אנחנו דורשים שיטות עבור אפיון ההרכב של חיידקים הקשורים עם הבטן שנתות כדי להקל על הבנה טובה יותר של פוטנציאל אינטראקציות בין זנים בבטן שנתות. שימוש כולה-הר בחיי עיר הכלאה להמחיש תעתיקים RNA הקשורים למין מסוים חיידקי מאפשר האוסף של נתונים איכותיים לגבי שפע והפצה של microbiota בתוך הרקמה ללא פגע. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבחון שינויים וחשש microbiota הבטן במהלך שנתות האכלה, ניתן להחיל גם לנתח את הביטוי של גנים שנתות. צביעה של כל שנתות אומץ התשואה מידע אודות התפלגות מרחבית ברוטו היעד RNA ברקמה ללא צורך שחזור תלת מימדי, מושפע פחות זיהום סביבתי, אשר לעיתים קרובות מבלבל את מבוסס על רצף שיטות שימוש תכוף ללמוד קהילות מיקרוביאלי מורכבים. בסך הכל, טכניקה זו היא כלי רב ערך שיכול לשמש טוב יותר להבין וקטור-פתוגן-microbiota אינטראקציות ותפקידם העברת מחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האדם ובעלי פתוגנים ששודרו על-ידי וקטורים arthropod מצויים ברחבי העולם בחשבון כ- 20% של מחלות זיהומיות ברחבי העולם1, אך יעיל ואני בטוח חיסונים נגד רוב פתוגנים אלה אינן זמינות. הבנתנו תפקידה החשוב של מיקרואורגניזמים commensal, סימביוזה, פתוגניים, המכונה באופן קולקטיבי microbiome2, להתכוונן בעיצוב הבריאות של metazoans כמעט כל3 מתרחבת. עכשיו זה ברור arthropod וקטורים של פתוגנים הנמל גם בטן microbiota microbiota הקשורות וקטור אלה הוכחו השפעה מגוונים פתוגנים בעקיצות וקטור4,5. Microbiome arthropod מורכב eubacteria, ארכאונים, וירוסים, חיידקים האיקריוטים כגון חד-תאיים, נמטודות פטריות6. עם זאת, מוקד מחקר השולט כבר ב eubacteria נובע, בין השאר, את הזמינות של סמן גנים ובסיסי התייחסות לזהות חברי חיידקי ספציפי.

עם דגש על Ixodes scapularis, וקטור שנתות של פתוגנים האנושי מרובים כולל Borrelia burgdorferi7, סוכן סיבתי של מחלת ליים, אופטימיזציה של טכניקה ויזואליזציה מיקרוביאלי היה מכוון שיפור ההבנה שלנו של microbiota בטן שנתות בהקשר של אינטראקציות פתוגן-וקטור. מספר שאלות נותרו להיענות בשדה microbiome שנתות. הוא האתר של המורחבת המפגש הראשון בין השניה את הפתוגן נכנסות בהקשר של פתוגנים המועברים אופקית; לכן, להבין את התפקיד של וקטור microbiota בטן ב להתכוונן פתוגן-וקטור אינטראקציות תחשוף תובנות משמעותיות. קרציות יש מצב ייחודי של עיכול ארוחת דם, עיבוד של ארוחת דם רכיבים לוקח המקום intracellularly8. לומן מעיים לכאורה משמש קיבול להכיל את ארוחת דם כמו ההזנות שנתות, והוא מזין עיכול והטמעה ensue לאורך מספר ימים של האכלה ולהמשיך כסיגנל שלאחר. פתוגנים שרכשה את תקתוק שהאכילה הזן לומן הבטן יחד עם bloodmeal והופך ובכך לומן אתר ראשי של אינטראקציות בין שנתות, הפתוגן, תושב microbiota. כמו עיכול ממשיך דרך כסיגנל שנתות Ixodid משיר, הבטן עובר שינויים מבניים ופונקציונליים9. את ההרכב ואת הארגון המרחבי של חיידקים במעיים סביר גם משתנים בתיאום עם הבטן משתנה הסביבה שבה התרחשה. חשוב, לכן להבין את הארכיטקטורה של תושב חיידקים בבטן שנתות כדי להבין באופן מלא את הגומלין של שנתות הפתוגן, הבטן microbiota.

טכניקות מולקולריות כדי לתאר microbiota מארח-הקשורים באופן שגרתי לנצל אסטרטגיות רצפי מקביל בתפוקה גבוהה10 כדי להגביר את רצף ה-DNA חיידקי מטוסי אף-16 30s ריבוזומלי (rDNA). אלה אסטרטגיות רצפי לעקוף את הצורך להשיג axenic תרביות של חיידקים מסוימים מספקים תיאור מעמיק של כל חברי חיידקי ייצג במדגם. למרות זאת, אסטרטגיות מעין אלו הם מבולבל על ידי חוסר היכולת להבחין בין הסביבה מציג מתושבים bona פיד ה . עוד יותר, כאשר הערכת במדגמים, כגון קרציות, הינם קטני מידות ומכילות ומכאן DNA ספציפיים microbiota נמוך התשואות, הסבירות של הגברה של מזהמים סביבתיים מוגברת11 ותוצאות של פרשנות חד משמעיים של ההרכב microbiome. אפיון פונקציונלי בשיתוף עם הפריט החזותי של חיידקים קיימא ספציפי, לכן, תהיה קריטית כדי להגדיר ולהבחין את microbiome של שנתות חנותם והמרגשים. לעבר המטרה הזו, אנחנו ניצלו את העובדה RNA כולה-הר בחיי עיר הכלאה. טכניקה זו משמשת באופן שגרתי כדי להעריך את ג'ין תבניות ביטוי איברים, העוברים12,13,14 ומאפשר ניתוח semiquantitative של הביטוי על המדגם בכל עניין. זה שונה מסורתי בחיי עיר טכניקות הכלאה אשר לנצל את מקטעי רקמת ולעיתים קרובות דורשים ניתוח מקיף של חומר משרטוטי עם אסיפה חישובית לחזות ביטוי איברים כל15. בעוד כולה-הר מתייחס בדרך כלל אורגניזמים כל12, כאן כולה-הר מתייחס כל אומץ או איברים. יתרונות השימוש כולה-הר RNA בחיי עיר הכלאה הגישה כדי להעריך את הארכיטקטורה של שנתות בטן microbiota הם multifold. הבטן שנתות מורכב 7 זוגות diverticula, כל זוג משתנה גודל16. ההבדלים פונקציונלי, אם בכלל, בין אלה diverticula, אינם מובנים בהקשר של שנתות ביולוגיה, לתקתק אינטראקציות microbiota או פתוגן-שנתות. המניפולציות של המעיים, זה קרע את diverticula בטן תחסיר microbiota נוכח לומן מעיים או אלה הקשורים באופן רופף הבטן ואת התוצאה פירוש מוטעה של לוקליזציה המרחבי של microbiota. התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה יש כבר מנוצל קודם לבחון שנתות בטן תעתיקים17 על-ידי תיקון ופתיחה diverticula בטן בודדים כדי להבטיח בדיקה הכלאה וכדי להתאים לשפה burgdorferi דרב תעתיקים באמצעות חלוקתה פרפין-מוטבע כל קרציות18. שתי גישות אלה דורשים מניפולציות של הרקמות שנתות לפני הכלאה שישפיעו על הארכיטקטורה microbiota בטן.

בדו ח זה, נתאר בפירוט את פרוטוקול לבחון microbiota בטן שנתות קיימא באמצעות כולה-הר בחיי עיר הכלאה (WMISH). השימוש של ה-RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר מאפשר הבנה גלובלית של נוכחות ושפע של הבטן ספציפי חיידקים באזורים שונים של המעיים, עשויה לדרבן תובנות חדשות שנתות ביולוגיה בטן בהקשר של פתוגן קולוניזציה ושידור. עוד יותר, השימוש של הגששים RNA נגד RNA חיידקי ספציפי מאפשר זיהוי של קיימא חיידקים בבטן שנתות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תבניות DNA

  1. להוריד את רצף rRNA מטוסי אף-16 ספציפי על כל סוגים חיידקי NCBI מסד נתונים ועיצוב תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) תואם קדימה ולהפוך תחל זה יגביר את אזורים סוגים (~ 200-250 זוג בסיסים ארוך) כמתואר קודם לכן 19. להתייחס גם קוד פתוח מסדי נתונים סילבה20,21 ו- probeBase22 המשאבים המקוונים, ממוקדות rRNA oligonucleotide הגששים, תחל RNA זונדי כמה סוגים חיידקי עלולה להיות מסחרית אפשרות זו זמינה.
    הערה: חשוב בחר גנים באזורים ספציפיים כדי ספציפי סוגים ולהבטיח כי תחל מעוצב לא להגביר קשורים סוגים חיידקי. זה חיוני כדי לקבל ג'ין/סוגים-ספציפיות בדיקה הכלאה.
  2. להאכיל קרציות במשך 24 שעות ביממה, 48 או 72 h על עכברים, לנתח שנתות אומץ ולהכין RNA ו- cDNA של אומץ שנתות כמו שתואר קודם23. השתמש cDNA תבנית ל- PCR להגביר amplicons סוגים ספציפיים באמצעות של thermocycler. לרוץ על aliquot של ה-PCR-המוצר/אמפליקון על 1.5% agarose ג'ל ולאשר אמפליקון המתאים לגודל הצפוי על ידי החזותיים מתחת לאור אולטרה סגול (UV), באמצעות ג'ל מערכת הדמיה.
  3. לשכפל את אמפליקון ribosomal RNA בקטריאלי מטוסי אף-16 עניין לתוך וקטור TA זמינים מסחרית (טבלה של חומרים) המכיל RNA פולימראז היזמים מתאים bacteriophage polymerases (SP6, T7 או T3). רצף שיבוטים כדי לאשר את הזהות של אמפליקון. הכיוון של השיבוט ביחס לכל אחד היזמים. על סמך זה, לקבוע המקדם של בחירה כדי ליצור תחושה או antisense RNA רגשים (איור 1).
  4. Linearize 1 מ ג של פלסמיד עם אנזים ההגבלה המתאימה נפח התגובה של עד 30 µLfor 2 h בטמפרטורות המומלץ על ידי היצרן. לבחור אנזימי הגבלה המבוססת על יזם ב'טבלת כדי ליצור את התחושה או בדיקה antisense (איור 1). לאמת לינאריזציה על ידי ויזואליזציה של µL 2 תקציר לתגובה על ג'ל agarose 1%.
  5. לטהר את µL 28 הנותרים של DNA מעוכל בעזרת זמינים מסחרית PCR המוצר עמודת ערכת טיהור ולכמת את ריכוז הדנ א על ידי ספקטרופוטומטרים.
    הערה: כמה הגששים הגיוני עלול לגרום רקע מכתים גבוהה בהרבה מזו החללית antisense המתאימים, אפשרויות אחרות ייתכן שתצטרך להבטיח את הזמנתכם. פקדים שלילי חלופי כוללים פלסמידים קידוד רצפים אינו מיוצג המדגם או בדיקה אחרת המניבה דפוס ייחודי של הכלאה.

2. בניית Digoxygenin-UTP RNA הגששים

  1. מכינים את תערובת נוקלאוטיד על-ידי שילוב µL 7.5 מ"מ UTP, 25 µL של 10 מ מ digoxygenin-UTP, 10 µL כל של 100 מ מ ATP, GTP ו- CTP בשפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.
  2. לבצע תמלול במבחנה באמצעות זמינים מסחרית ערכות T7 או Sp6 RNA פולימראז, באמצעות µL 1 של המיקס נוקלאוטיד (שלב 2.1) ו- 0.25 - 1 µg של תבנית ה-DNA. להביא את אמצעי האחסון עד 20 µL עם מים. קפיצי צינור כדי לשלב, דופק ספין. דגירה ב 37 ° C עבור 2.5-3 h.
    הערה: בדיקה הבנייה הוכתרה בהצלחה עם מתעכל פלסמיד ריכוזים המתחילים 7 ng/µL, אבל ריכוזים טיפוסי בטווח לשלב הזה מ- 15-25 ng/µL. התגובה שעתוק גם מודגרות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, אך זה לא להגדיל באופן משמעותי את התשואה RNA.
  3. להוסיף 1 µL של DNase (2,000 יחידות/µL) דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לא יעלה על 10 דקות, או האנזים יכולה להתחיל משפילים RNA.
  4. להוסיף 30 µL של קרח 7.5-8 מ' ליתיום כלוריד ו 30 µL של מים נטולי נוקלאז צוננת, כדי לזרז את הרנ א. קפיצי צינור כדי לערבב. לאפשר משקעים של RNA להמשיך בין לילה ב-20 ° C.
  5. לאסוף RNA על ידי צנטריפוגה-17,000 g x עבור 20 דקות ב 4 º C. לשטוף את גלולה פעם אחת עם 1 מ"ל אתנול 75% שזה עתה הוכנו במים pyrocarbonate (DEPC) Diethyl, ולאחר מכן לחזור צנטריפוגה.
  6. להסיר למחוק את תגובת שיקוע, להפוך את הצינורית על מגבת נייר נקי ו אפשר להתייבש במשך 10 דקות Resuspend בגדר במים נטולי נוקלאז. אם בגדר גלויים בקלות, resuspend ב 25 µL. אם בגדר קטנה מאוד או שאינו גלוי, resuspend µL 15-20. לקבל הערכה של RNA ריכוז על-ידי ספקטרופוטומטרים.
    הערה: RNA טיפוסי ריכוזים נע בין 200-500 ng/µL.

3. הדמיה של RNA רגשים על ידי RNA פורמלדהיד בג'ל כדי להעריך RNA טוהר

התראה: פורמלדהיד מהווה סיכון שאיפה; לכן, ליצור את הפתרונות הדרושים לניתוח ג'ל RNA בשכונה fume. אתידיום ברומיד הוא קרצינוגן חשד; . לטפל.

  1. הכנת ג'ל agarose 1% פורמלדהיד כפי שתואר קודם לכן24 . והשליכו את הג'ל בתוך קופסת ג'ל ללא RNases. ברגע מגניב, למלא את הקופסא ג'ל 1 x הפעלת מאגר (1 x MOPS ב- pH 7.0, 5% פורמלדהיד).
  2. הכנת המאגר מדגם (5 µL 400 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד, µL 20 10 x המגבים, פורמלדהיד µL 35 ו- 100 µL formamide). לשלב 2 µL של RNA בדיקה (שלב 2.6) עם µL 8 דוגמת המאגר. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. להכין RNA טעינת מאגר על ידי שילוב של גליצרול 50% מ ל, 1 מ ל 10% פורמלדהיד, 40 מ"ג bromophenol כחול, 40 מ"ג קסילן cyanol ו- µL 20 של EDTA 0.5 M (pH 7.5). לאחר השימוש, לאחסן המאגר ב-20 ° C.
  4. להוסיף 3 µL של טעינת מאגר המדגם RNA-3.2 שלב ומערבבים. לשמור על צינורות מדגם על קרח.
  5. לטעון את אמצעי האחסון מדגם כולו מ 3.4 שלב לתוך הג'ל. לטעון aliquot של הסולם RNA חד-גדילי לצד כדי לוודא גודל ה-RNA. הפעל את הג'ל ב- 100 וולט או נמוך עד צבען כחול נודד כ- 75% של הדרך למטה הג'ל. דמיינו את הרנ א תחת אור UV באמצעות מערכת הדמיה ג'ל.
    הערה: בדיקה RNA באיכות טובה אמורה להופיע כלהקה דיסקרטית עם ניידות המתאימים לגודל הצפוי של המכשיר (איור 2, ליין 1). אם המכשיר מופיע ' מאטום לשקוף ', smeary להקה (איור 2ליין 2) זה לא אמור לשמש.

4. לסמן איסוף הבטן של קיבעון

  1. לאסוף נימפות Ixodes scapularis אשר ניזונה על עכברים במשך הזמן מוקדי עניין.
    הערה: לצורך של טכניקה זו, קרציות להזנה 48 או 72 שעות עבודה בצורה הטובה ביותר.
  2. מחלקים הבטן מן השניה MEMFA (טבלה 1) על משטח זכוכית תחת מיקרוסקופ לנתיחה, הימנעות נזק לאיבר ככל האפשר. המקום קרצייה בשקופית מיקרוסקופ נקיים ב- 20-30 µL של MEMFA. בעזרת זוג עקר גבוהה-פחמן פלדה גילוח #11 פרוסה אזור הראש scutum של השניה העוזב את הגוף של השניה. לחץ בעדינות את הגוף כדי לדחוף את הבטן diverticula ואת בלוטות הרוק החוצה הקוטיקולה הגוף. נפרדים בלוטות הרוק, הבטן ולאסוף את האומץ על הלהב גילוח.
  3. לאסוף ביצים לתוך צינור 1.5 mL המכיל 500 µL MEMFA. דגירה הצינור בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין לשעה או למשך הלילה ב 4 º C.
    הערה: בלוטות הרוק שנתות עשוי גם להיות גזור באופן דומה קבוע, צבעונית.
  4. מייבשים את הרקמה ע י שטיפת בעדינות 3 פעמים עם 1 מ"ל אתנול 100% קר כקרח. תן את האומץ כיור בטבעיות לתחתית הצינור בין כל כביסה, כמו צנטריפוגה עלול לגרום נזק הרקמה. לאחסון לטווח ארוך, שומרים את הדגימות 100% אתנול ב-20 ° C.

5. בניית רשת מדגם סלים ו מחזיק סל 24-ובכן

  1. חותכים תחתיות מחוץ 2 mL או 5 מ ל צינורות צנטריפוגה snap-העליון בעזרת סכין גילוח מחוממת עם קצוות יחיד על אזמל.
    התראה: הלהב ייתכן שתצטרך להיות מחוממים מספר פעמים לפני השלמת החתך.
  2. חותכים ריבועים של רשת ניילון מיקרומטר 110 מעט גדול יותר מאשר פתיחת צינור חדש. בונד רשת השינוי לתחתית הצינור על ידי לחיצה על אותם יחד בקלות על גבי צלחת חמה על אש בינונית-נמוכה עד סגירה. ומצננים, להבטיח שלא יהיו מרווחים בין הרשת לבין הצינור ולחיתוך רשת עודף מסביב לקצוות.
  3. חותכים חורים עטיפת צלחת 24-ובכן כך השפה של הסל מדגם ב 5.2 שלב לשבת על החור, לא ליפול דרך, מניב מלכודת איפה שהסוליות של הסלים מדגם יושב עד הסוף הבארות כאשר הם מוכנסים חורים במכסה.
  4. השתמש הזה מחזיק סל מצויד כדי העברת סלים של לוח אחד למשנהו בקלות יחסית על מכלול של פרוטוקול הכלאה בחיי עיר . השתמש שתי צלחות 24-ובכן כך בזמן הדגירה אחד מתרחש, הלוחית השנייה ערוכה בכביסה הבאה.

6. הכלאה בחיי עיר : יום 1 (תזמון: 4-5 שעות)

  1. העברת האומץ תוויות. מדגם סלים, מופרדים על-ידי תנאי נסיוני ומיועד RNA בדיקה.
    הערה: כתם אומץ לפחות 5 לכל תנאי להביא בחשבון וריאציה טבעי בין משכפל.
  2. נתרענן הדגימות בעדינות כדי להימנע מהחדרה בועות אוויר לתוך הרקמה על ידי בהדרגה הגדלת היחס של באגירה פוספט תמיסת מלח עם 0.1% ללא יונית חומרים פעילי שטח (PTw; טבלה 1) כדי אתנול ב- שוטף.
    הערה: להשלים את כל שוטף ב בעל 24-ובכן סל בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין אלא אם נכתב אחרת. Aliquot 500-600 µL של פתרונות לשטוף כל טוב של בעל כזה כי האומץ בסל כל לחלוטין טובע. להכין את כל הפתרונות במים שטופלו DEPC כדי למנוע השפלה RNA.
    1. לשטוף את הדגימות עבור 5 דקות 500 µL 100% אתנול.
    2. הכנת µL לפחות 500 לכל סל הדגימה של 75%, 50% ו- 25% אתנול PTw. נוזלים הדגימות על ידי שטיפה עבור 5 דקות בפתרון כל אתנול, לנוע אתנול הריכוז הגבוה ביותר לנמוך.
    3. לשטוף את הדגימות 4 פעמים במשך 5 דקות ב PTw.
  3. Permeabilize את הדגימות עם Proteinase K (10 µg/mL) ב PTw במשך 5 דקות.
  4. להכין את הרקמה הכלאה עם הגששים RNA.
    1. לשטוף את הדגימות פעמיים כמתואר ב- 6.2 ב בעל 24-ובכן סל בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין למשך 5 דקות כל במאגר הידרוקסיאתיל 500 µL (0.1 M, pH 7.0-8.0) (טבלה 1) כדי לשמור את הדוגמאות סביבה נטולת אמין.
    2. מתייחסים הדגימות פעמיים עם 500 µL 0.25% אנהידריד אצטי במאגר הידרוקסיאתיל (0.1 M, pH 7.0-8.0) למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף את הדגימות פעמיים ב PTw למשך 5 דקות.
      הערה: אנהידריד אצטי acetylates אמינים חינם לנטרל מטען חיובי, אשר חיוני כדי למנוע שאינם ספציפיים אלקטרוסטאטיות ולהבטיח איגוד ספציפי של המכשיר ל mRNA.
    3. לתקן את האומץ כעשרים דקות עם 500 paraformaldehyde 4% µL ב PTw ולאחר מכן לשטוף 5 פעמים ב PTw למשך 5 דקות.
    4. Prehybridize על ידי המקננת הדגימות ב 500 µL הכלאה מאגר /in בעל 24-ובכן סל בצלחת טוב 24 (טבלה 1) עבור 1.5-2.5 h ב 60 מעלות צלזיוס עם עצבנות עדין באמבט מים חזק. לשמור את המאגר הכלאה המשמש עבור השלב prehybridization לעשות שימוש חוזר בפרוטוקול ביום 2 (שלב 7.1).
    5. הכן פתרונות הכלאה בדיקה על ידי דילול RNA הגששים במאגר הכלאה כדי ריכוז סופי של 1 µg/mL.  דגירה בדגימות עם פתרונות הכלאה בדיקה של בעל 24-ובכן סל ב 60 מעלות צלזיוס עם עצבנות עדין בן לילה בתוך אמבט מים חזק (טבלה 2). מכסים את הצלחת נושא בעל סל בנוחות עם רדיד אלומיניום כדי למנוע אידוי של הפתרון הכלאה.

7. הכלאה בחיי עיר : יום 2 (תזמון: 4.5-5.5 h)

  1. להסיר את הדגימות פתרונות הכלאה של החללית, למקם אותם לתוך המאגר השמור הכלאה של היום הקודם. דגירה ב 60 מעלות צלזיוס עם עצבנות עדין למשך 3 דקות.
    הערה: בדיקה הכלאה פתרונות ניתן לאחסן ב-20 ° C לשימוש חוזר עד 3 פעמים.
  2. להכין 2 x מאגר תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) על-ידי 20 המדללת x SSC במים שטופלו DEPC (טבלה 1). לשטוף את הדגימות פעמיים במשך 3 דקות עם 2 x האס, אז 3 פעמים במשך 20 דקות עם 2 x SSC ב 60 ° C כדי להסיר כל עקבות של מאגר החללית ואת הכלאה.
  3. להתייחס RNase (20 µg/mL) ו- RNase T1 (10 µg/mL) ב 2 x האס למשך 30 דקות ב 37 ° C כדי להסיר אחת תקועים בדיקה RNA המייצג חינם ללא-hybridized RNA.
  4. תשטוף פעם אחת עם 2 x SSC 10 דקות בטמפרטורת החדר. להכין 0.2 x SSC על-ידי 2 המדללת x SSC במים שטופלו DEPC, ואז לשטוף פעמיים עם 0.2 x SSC למשך 30 דקות ב 60 ° C כדי להסיר את עודף RNases.
  5. לשטוף פעמיים עם 500 µL חומצה maleic מאגר (MAB; טבלה 1) 10 דקות כל אחד.
  6. דגירה בדגימות עם חסימת פתרון (2%, חסימה ריאגנט ב MAB) 1.5-2 h.
    הערה: הכימית חסימה יכולה להיות קשה להמיס; חימום עדין עזרי התפרקות.
  7. החלף את הפתרון חסימה אלקליין anti-digoxigenin µL 500 מצומדת פוספטאז של נוגדן-1:3,000 לדילול בחסימה פתרון, דגירה בטמפרטורת החדר במשך כ 4 שעות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

8. הכלאה בחיי עיר : ביום השלישי (תזמון: 6-אייץ ' ללון)

  1. לשטוף את הדגימות לפחות 5 פעמים במשך 30 דקות כל עם 500 µL MAB כדי להסיר עודפי נוגדנים.
    הערה: שוטף אלה הם גמישים, יורחב כדי h 1-2, או 3-4 שוטף יכול להיות מוחלף על שטיפת לילה אחד ב 4 ° C עם השפעה מזערית על היעילות.
  2. לשטוף פעמיים במשך חמש דקות עם מאגר phosphatase אלקליין, pH 9.5 (AP המאגר; טבלה 1).
  3. מתחילים את תגובת צבע על-ידי החלפת בכביסה האחרונה µL 500 של המצע הדפסות כסף עבור phosphatase אלקליין (טבלה של חומרים). לכסות את הצלחת מדגם ברדיד אלומיניום ולתת ההכתמה להמשיך בטמפרטורת החדר במשך 3 - 5 שעות או לילה ב 4 º C. נטר את התגובה מכתימים מעת לעת על-ידי הצגת הרקמה תחת מיקרוסקופ ויבתר כדי להימנע overstaining.
    הערה: כאשר ההכתמה תושלם, גוון סגול הוא לזיהוי בעין הדגימות ובחן antisense מתחת למיקרוסקופ, אבל הרקמה אסור להיות כהה מאוד. צביעת מתקדם מאוד לאט ב 4 ° C, עשויה להימשך עד 20-24 שעות.
  4. לעצור את תגובת צבע על ידי שטיפה עבור 5 דקות ב- 500 µL MAB ולאחר מכן את הרקמה בן לילה בפתרון של Bouin.
    התראה: להתמודד עם הפתרון של Bouin בשכונה fume; הוא קרצינוגן קורוזיבית.

9. הכלאה בחיי עיר : יום 4 (תיזמון: 3-3.5 שעות)

  1. להכין לפחות 7 מ לכל סל דגימה של 1 x SSC ב-20 המדללת x SSC במים שטופלו DEPC. להסיר את הפתרון של Bouin על ידי נטילת הדגימות 4 עד 6 פעמים עם אתנול 70% 1 x SSC עד הרקמה הוא כבר לא צהוב.
  2. להכין µL 500 לכל דגימה סל של פתרונות אתנול 75%, 50% ו- 25% 1 x SSC. לשטוף את הדגימות עבור 5 דקות בפתרון כל, לנוע ריכוז האתנול הגבוהה לנמוכה כדי להחזיר נוזלים הרקמה. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות 1 בתוך כל x SSC.
  3. תקופת דגירה בדגימות בפתרון אקונומיקה (טבלה 1) של 90 דקות על אור ומכשיר בשכונה fume.
    הערה: שלב זה מאפשר כל פיגמנטציה דוגמאות או הגיוון מהפתרון Bouins יוסרו ומגבירה את אות בדיקה עבור פריט חזותי ברור.
  4. לשטוף את הדגימות פעמיים עם 500 µL 1 x SSC במשך 5 דקות.
  5. להעביר את האומץ עם נזק מינימלי על-ידי היפוך הסל מדגם לבאר של צלחת 24-ובכן חדשה, לשטוף עם 70% אתנול דרך תחתית רשת שינוי באמצעות פיפטה של העברה. לאחסן ב-20 ° C, במידת הצורך.
  6. כדי לקבל מבט כולל על הדפוסים מכתימים מספר דוגמאות של מוצג באיור 3, לשמור על האומץ אתנול 70% 24 פלייט-ובכן, תצוגה עם כל מיקרוסקופ שדה בהיר. כדי לבחון את האומץ בודדים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כפי שמוצג באיור 4, איור 5, ו איור 6, הר האומץ ב- 100% גליצרול תחת coverslips. השתמש מרית פלסטיק בעדינות לתפעל את הרקמה עם נזק מינימלי.
    הערה: צמיגות גבוהה של גליצרול מסייע בהגנה על הרקמה מפני נזק על ידי דחיסה ומאפשר המיקום זהיר של diverticula כזה ניתן להציג את הרקמה בצורה אופטימלית-הגדלה גבוהה יותר.
  7. ללכוד תמונות במיקרוסקופ באמצעות תוכנה ללכידת תמונה ספציפית מיקרוסקופ (טבלה של חומרים) ולייצא כמו תמונות Tiff לתמונה כללית תוכנה לעריכת. כדי לכמת את ההבדלים מכתימים היחסי בין טיפולים ניסיוניים, להוריד תוכנת ניתוח תמונה כללית (טבלה של חומרים). פתחו את התמונה בתוך התוכנה ניתוח ולהשתמש את ההוראות בתוך התוכנה כדי למדוד את עוצמת פיקסל ההכתמה ולחישוב היסטוגרמה חלקות להכתים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידה, הערכה של איכות הגששים RNA הם קריטיים לפני תחילת ההכתמה. במבחנה שעתוק יעילות מאוד תלוי כמות ואיכות תבנית ה-DNA. אנחנו באופן שגרתי דמיינו את הגששים RNA על ג'ל פורמלדהיד כדי לאמת את הטוהר ואת כמות בדיקה שנוצר על ידי התגובות שעתוק. הגששים אמור להופיע כרצועות בהיר, דיסקרטית (איור 2). מדידות spectrophotometric ריכוז ה-RNA היו מאוד מעידה על איכות המכשיר מתואם היטב עם המראה של הלהקות הג'ל. לפיכך, הצעד ויזואליזציה ג'ל ייתכן יבוצע במידת הצורך לאחר היכרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זהו השימוש הראשון טכניקה הכלאה (WMISH) כולה-הר בחיי עיר ללמוד את microbiota של וקטור arthropod של פתוגנים. פרוטוקול שלנו הותאם מאחד המשמשות ללימוד פיתוח בדרוזופילה וב -צפרדע עוברי25,26. RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר נעשה שימוש באופן שגרתי כדי להתאים לשפה ג'ין תעתיקים במרחב, חנותם27 והדמיה של תעתיקים יכול להיעשות על-ידי שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אימצנו לשעבר לקראת זיהוי של microbiota במעיים שנתות. חשוב לציין...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ד ר מוסטפא Khokha, אוניברסיטת ייל, למתן את השימוש במשאבים המעבדה שלו. אנו מודים על מר מינג-ג'יאה-וו לסיוע טכני מעולה. EF הוא חוקר HHMI. עבודה זו נתמכה על ידי מתנה ג'ון Monsky ואת קרן המחקרים של מחלת ליים Monsky של ג'ניפר וייס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Sefar NITEX ניילון רשת, 110 מיקרוןאמזון03-110/47
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360
Digoxygenin-11-UTPRoche1209256910
dNTPניו אינגלנד Biolabs N0447S
DNAse I (ללא RNAse)ניו אינגלנד ביולאבסM0303S
HiScribe SP6 ערכת סינתזת RNAניו אינגלנד ביולאבסE2070S
HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA בעלת תפוקה גבוההניו אינגלנד ביולאבסE2040S
מים, ללא RNase, מטופל ב-DEPCביואנליטי אמריקאיAB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0אמריקן ביואנליטיAB00502-01000
פורמלדהיד, 37%JT Baker2106-01
פורממידביואנליטי אמריקאיAB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS, 10XGibco14300-075
Tween-20Sigma AldrichP1379-25ML
פרוטאינאז Kסיגמא אולדריץ'3115879001
טריאתנולאמין הידרוכלורידסיגמא אולדריץ'T1502-100G
אנהידריד אצטיסיגמא אולדריץ'320102-100 מ"ל
פרפורמלדהידThermoScientific/Pierce28906
SSC, 20XAmerican BioanalyticalAB13156-01000
RNA משמריטורולהסיגמא אולדריץ'R3629-5G
הפרין, מלח נתרןסיגמא אולדריץH3393-10KU
הפתרון של דנהרדט, 50Xסיגמא אולדריץ'D2532-5ML
CHAPS הידראטסיגמא אולדריץ'C3023-1G
RNase Aסיגמא אולדריץ'10109142001
RNase T1ThermoScientific EN0541
חומצה מאליתסיגמא אולדריץ'M0375-100G
מגיב חוסםסיגמא אולדריץ'11096176001
אנטי-דיגוקסיגנין-AP, שברי פאבסיגמא אולדריץ'11093274910
לבמיסול הידרוכלורידסיגמא אולדריץ'31742-250MG
מצע כרומוגני לפוספטאז אלקלייןסיגמא אולדריץ'הפתרון
של11442074001 Bouin Sigma AldrichHT10132-1L
מי חמצןMallinkrodt Baker, Inc2186-01
סולם RNA חד גדיליאמביון -MilleniumAM7151
 #11 להבי פלדה עתירי פחמן C ו-A בכורה מדעית#11-9411
ThermocyclerBioRad, CA1851148
ספקטרופוטומטרThermoScientific NanoDrop 2000C
שייקר אורביטליVWRDS-500E שייקר
דיגיטלי רועד אמבט מים BELLCOGlass, IncHot Shaker-7746-12110
Gel  מערכת תיעודBioRadGel Doc XR+ מערכת
מיקרוסקופ שדה בהיר NikonNikonSM2745T
מיקרוסקופ שדה בהיר ZeissAXIO Scope.A1
מיקרוסקופ דיסקציה ZeissSTEMI 2000-C
  קופסת אורVWR102097-658
ערכת טיהור PCR Qiagen28104
תוכנת לכידת תמונותZeissZen lite
תוכנת עריכת תמונה אדובי Adobe Photoshop CS4 גרסה 11.0
תוכנת ניתוח תמונותהמכונים הלאומיים לבריאותImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
מכשור תואם אוטומציהIntavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). Intavis, Biolane HT1.16v
ערכת סינתזת RNA של של ' אורביטליתיעוד ג'ל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573(2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87(2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184(2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38(2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole MountRNAMEMFASSC

מאמרים קשורים