מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות הייתה הטכניקה פותחה לראשונה בשנת 1903 ומשמש היום כשיטה ללמוד ביטוי גנים וגם לייצר מודלים תלת-ממדי או 4-D של רקמות דגימות^1,2,3. שיטה הדמיה זו משתמשת סדין דק של אור כדי להאיר מטוס בודד של מדגם כך רק את המטוס הוא נלכד על ידי הגלאי. המדגם יכול להיות עבר לכיוון-צירית ללכוד כל שכבה, מקטע אחד בכל פעם, ועיבוד דגם תלת-ממדי לאחר עיבוד שלאחר של תמונות רכשה⁴. עם זאת, עקב ספיגת פיזור של פוטונים, LSFM הוגבלה על דוגמאות או מיקרונים אחדים עבה או שטיחות שקוף¹.

המגבלות של LSFM הובילו מחקרים מקיפים של אורגניזמים בעלי רקמות שקופים אופטים, כגון דג זברה. מחקרים שכללו פיתוח לב ובידול נערכות לעיתים קרובות על דג זברה מאז ישנם גנים שנשמרת בין בני האדם לבין דג זברה^5,6. למרות מחקרים אלו הובילו ההתקדמות במחקר הלב הקשורים^6,cardiomyopathies⁷, יש עדיין צורך לערוך מחקר דומה על אורגניזמים ברמה גבוהה יותר כגון יונקים.

יונקים ברקמת הלב מהווה אתגר עקב עובי האטימות של הרקמה, קליטתם עקב המוגלובין כדוריות דם אדומות, וכן את פיזור המתרחשת עקב תאורה חד צדדית של הדגימה תחת LSFM מסורתיים שיטות^{1 , 8}. כדי לפצות על מגבלות אלה, הצענו להשתמש תאורה דו-צדדית, גרסה מפושטת של טכניקה בבהירות⁹ בשילוב עם מקדם שבירה התאמת פתרון (חישוקים). לכן, מערכת זו מאפשרת ההדמיה של מדגם זה גדול מ- 10 x 10 x 10 מ מ³ תוך שמירה על רזולוציה באיכות טובה צירית, לרוחב מטוסים⁸.

מערכת זו היה מכויל תחילה באמצעות חרוזים פלורסנט מסודרים תצורות שונות בתוך הצנרת זכוכית. לאחר מכן, המערכת שימשה תמונה אחרי לידה ומבוגרים מאתר לבבות. ראשית, בלב העכבר אחרי לידה צולמה ב 7 ימים (P7) כדי לחשוף את חלל חדרית, את עוביו של הקיר חדרית המבנים שסתום, הנוכחות של trabeculation. שנית, נערך מחקר כדי לזהות תאים להתמיין cardiomyocytes באמצעות העכבר אחרי לידה לב ב- 1 יום (P1) עם התווית על-ידי Cre cardiomyocytes, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). לבסוף, עכברים בוגרים בגיל 7.5 חודשים היו עם תמונה כדי לבחון את נוכחותם של כליות אשלגן מדולרי החיצוני ערוצים (ROMK) לאחר טיפול גנטי⁸.

כל ההליכים הקשורים בבעלי החיים אושרו על ידי המוסדיים סקירה ועדות (IACUC) ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, קליפורניה.

1. התקנת מערכת הדמיה

הערה: ראה איור 1 באיור 2.

1. לאחזר לייזר (CW) רציף wave עם אורכי גל 3: 405 ננומטר, 473 ננומטר, 532 ננומטר. מניחים 2 מראות (M1 ו- M2) 150 מ מ לגזרים וליישר אותן עם המטוסים המראה שלהם-45° על הקורה.
   הערה: שלב זה מתבצע כדי לנתב מחדש את הלייזר מן ההגדרה תאורה דו-צדדית. קרן וכתוצאה מכך יהיו באותו כיוון כמו הקרן הראשוני.
2. להעביר את הקרן עד קוטר 25 מ מ איריס הסרעפת/הקדמוניות (PH), מסנן דחיסות נייטרלית בקוטר 50 מ מ (אבחון) עם טווח צפיפות אופטית של 0 - 4.0, במותחן קרן (מושלם), חתך 30 מ מ (S) עם הרוחב של ~ 0 - 6 מ מ, ומראה (M3) , כל מה ממוקם 150 מ מ אחד מהשני. במקום המראה עם המטוס המראה שלה בגיל 45° על הקורה.
3. עוברים את הקרן דרך מפצל קרן 50: 50 הציב 150 מ מ M3. להציב מראה (M6) 150 מ מ המפצל קרן, ליישר אותה כך המטוס המראה שלה הוא ב- 45 מעלות על הקורה הנפלט בכיוון קדימה. השתמש קרן משתקף להקים בצד אחד של גליון אור כפול-תאורה.
4. להציב מראה (M4) 150 מ מ המפצל קרן, ליישר אותה כך המטוס המראה שלה הוא ב- 45 מעלות על הקורה זה היה הנפלטים בזווית של 90° ' מ המפצל קרן. להציב מראה השני (M5) 150 מ מ M4, ליישר אותה כך המטוס המראה שלה הוא ב- 45 מעלות על הקורה שמשתקף M6. השתמש קרן הנפלטים M5 כדי ליצור את הצד השני של הגיליון אור כפול-תאורה.
5. להגדיר את מערכת תאורה דו-צדדית באופן סימטרי (ראה איור 1). מקום אחד עדשה גלילית (CL1) [קוטר (ד) = 1; אורך המוקד (נ) = 50 מ"מ] 150 מ מ בקו אחד עם קרן הנפלטים M5 בצד אחד ואת עוד עדשה גלילית זהים (CL2) 150 מ מ בקו אחד עם קרן הנפלטים M6 בצד השני של setu כפול-תאורה עמ' למקם 2 מראות (M7, M8) כל קו עם עדשות גלילי במרחקים של 50 מ מ כדי לשקף את הקרן ב- 90 °.
6. טופס של כפיל אכרומטי מזוג עדשות. מקם את העדשה הראשונה, L1 (d = 1; f = 100 מ מ), 100 מ מ M7, העדשה השניה, L2 (d = 1; f = 60 מ"מ), 160 מ מ L1. חזור על שזה בצד השני של כפול-התאורה עם עדשות זהה (L3, L4) להציב את המרחק אותו M8.
7. המקום שיקוף, M9 ו- M10, 60 מ מ עדשות L2 ו- L4, בהתאמה, ובהתאם את הקרן. להציב מטרות תאורה, OL1 ו- OL2 (d = 2; f = 150 מ מ), 150 מ מ M9 M10 ו בקנה אחד עם הקרן. קרן הנפלטים מן המטרות טפסים הגיליון אור הדמיה הדגימות.
8. להשתמש במדפסת תלת-ממד כדי להדפיס את בעל מדגם styrene טבעי בוטאדיאן (ABS). להטביע חתיכת כיסוי זכוכית [מקדם שבירה (RI) = 1.4745] בכל צד של החדר, הניצב על הקורה תאורה, כדי למזער את השבירה mismatching תשואה. אחיד במקום התא בין הקורות הנפלטים העדשות אובייקטיבי.
9. התקנת מיקרוסקופ סטריאו עם הספרה 1 X הגדלה אובייקטיבית, מצלמה מדעי משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (sCMOS) בניצב ההארה מטוס (ראה איור 2).

2. הדמיה מערכת כיול

1. אחזר חרוזי פוליסטירן פלורסנט שאינן μm 0.53 בקוטר.
2. הכן את הדגימה פלורסנט חרוז על ידי דילול הפתרון חרוז בפתרון תואמות מקדם שבירה (חישוקים) עם agarose הצבעה נמוך-להמיס 1% כדי 1:150, 000. חותכים פיסת זכוכית בורוסיליקט אבובים עם הקוטר הפנימי של 12 מ"מ וקוטר החיצונית של 18 מ מ לאורך של 30 מ מ.
   הערה: לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט משמש כדי להתאים את מקדם שבירה (1.47).
3. לערבב את הדגימה חרוז מדולל עם 1% agarose, pipette הפתרון חרוז/agarose אל הצנרת בורוסיליקט. אפשר את agarose לגבש בטמפרטורת החדר (23 ° C).
4. למלא את התא ABS (מתוך שלב 1.7) פתרון גליצרול 99.5%. מקם את צינורות זכוכית בורוסיליקט המכיל את החרוזים בתוך החדר. מקום תא ABS מערכת ההדמייה כך שיהיה במרכז קרן גאוסיאנית שנוצרו על ידי מערכת תאורה כפולה.
5. לצרף שלב translational ממונע תלת-ממדי לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט כדי לקבוע את התנועה והכיוון של המדגם בתוך תא ABS (ראה תוספת איור 1).
6. לרכוש תמונות באמצעות מצלמת ה-sCMOS בקצב של 30 מסגרות לשנייה (fps). באמצעות הבקר מוטוריים, הזז את הדגימה 1 מ מ בכיוון לרוחב, לרכוש תמונות על כל תוספת 1 מ מ באמצעות מצלמת ה-sCMOS. המשך עד המדגם כולו עם תמונה.
7. ערימת תמונות נרכשות באמצעות תוכנת ויזואליזציה (ראה טבלה של חומרים). למדוד את הפונקציה הליין (PSF) של המערכת באמצעות הדימויים חרוז. השתמש הזה PSF deconvolution במהלך עיבוד בשלבים מאוחר יותר התמונה.

3. הכנת הדוגמא

1. לנתח לבבות עכבר פראי סוג P1, זוגית משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים sarcolipin-Cre knockin עם העכבר הגן Rosa26-YFP (Sln^{Cre / +}; R26^{YFP כתב / +})-P7.
   הערה: המתת חסד בוצעה באמצעות פנטוברביטל בטכניקה המתוארת על ידי רובינס. et al. ¹⁰. הקרע בוצעה על פי בטכניקה המתוארת על ידי ה הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI)^10,11.
2. לבצע חומר כימי ניקוי של לבבות מאתר כפי שתואר על ידי קווין סונג. et al. ¹².
   הערה: השלבים הבאים יש לבצעו בשכונה fume מאז הכימיקלים בשימוש רעילים.
   1. לשטוף את הלבבות 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) 3 x 10 דקות. לאחר השטיפה, למקם את הלבבות בפתרון paraformaldehyde 4%, דגירה הדוגמיות הללו ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   2. מקם את הדגימות פתרון 4% אקרילאמיד המכילה 0.5% w/v של 2, 2'-Azobis dihydrochloride. לאפשר את הדוגמאות כדי דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר לילה הדגירה, להסיר את הדגימות, דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 h.
   3. לשטוף את הדגימות עם PBS ולאחר מכן למקם אותם בפתרון של 8% w/v dodecyl נתרן גופרתי, חומצה בורית w/v 1.25%. דגירה בדגימות ב 37 ° C עד הם טהורים. זה יכול לארוך מספר שעות תלוי בעובי של המדגם. לאחר ניקוי, להסיר את הדגימות ומניחים 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח ליום 1.
   4. להכין עם מקדם שבירה התאמת פתרון עם 40 גר' nonionic צפיפות בינונית הדרגתי (ראה טבלה של חומרים) ב- 30 מ ל ז 0.02 נקודות פוספט מאגר (PB), אזיד הנתרן Tween-20, ו- 0.01% 0.1%. להביא את הפתרון pH של 7.5 עם נתרן הידרוקסידי.
3. מקם את הדגימה שנוקה חישוקים עם מדד השבירה agarose 1.46-1.48 ו 1%. הכנס את הדגימה לתוך צינורות זכוכית בורוסיליקט ולאפשר את agarose לגבש בטמפרטורת החדר (23 ° C).
4. לצרף שלב translational ממונע תלת-ממדי לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט כדי לשלוט על תנועת והודפס הכיוון של המדגם בתוך תלת-ממד ABS קאמרית (ראה תוספת איור 1).

4. דימות הלב למבוגרים

1. להזריק 8.7 x 10 וירוסים¹² של סוג וירוס adeno-הקשורים וקטור 9 (AAV9) המכילה יזם ספציפיות הלב טרופונין T (cTnT), חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באמצעי אחסון 100-μL לתוך וריד הזנב עכבר 2-חודש פראי סוג (C57BL/6).
   הערה: AAV9 פותחה על פי בטכניקה המתוארת על ידי יואן. et al. ¹³. זה גורם GFP לאגד הערוץ כליות אשלגן מדולרי החיצוני (ROMK) בהפקת AAV9-cTnT-ROMK-GFP (ראה טבלה של חומרים).
2. לנתח את הלבבות העכבר למבוגרים-7.5 חודשים של גיל על פי בטכניקה המתוארת על ידי NHLBI¹¹. הכינו את הדגימות באמצעות צעדים 3.1-3.3.
3. להתחבר הבקר מנוע מנוע במפעיל. לצרף במפעיל לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט כדי לשלוט על תנועת והודפס הכיוון של המדגם בתוך תלת-ממד ABS קאמרית.
4. מקם את הדגימה כך זה במרכז קרן גאוסיאנית שנוצרו על ידי מערכת תאורה כפולה. לרכוש תמונות באמצעות מצלמת ה-sCMOS בקצב של 100 fps.
5. באמצעות הבקר מוטוריים, להעביר את הדגימה 1 מ"מ לכיוון צירית, לרכוש תמונות על כל תוספת קבועה של 1 מ מ עם המצלמה sCMOS. המשך עד המדגם כולו עם תמונה.
   הערה: המערכת נשלטת על ידי תוכנת בקרת מכשיר מפותחות מותאם אישית.
6. ערימת תמונות נרכשות באמצעות תוכנת ויזואליזציה (ראה טבלה של חומרים). לפתח תמונות תלת-ממד באמצעות אוספי תמונות אלה, תוכנת ויזואליזציה¹⁴. Deconvolve את PSF מהשלב 2.6 עם אוסף תמונות רכשה. הגדר ערך פיקסל עוצמת סף כדי לבחון את קווי המתאר של הלב ולהוסיף צבע מדומה תמונות בהתבסס על זה עוצמת גווני אפור.

בטכניקה המתוארת כאן להשתמש קרן דו-צדדית תאורה בשילוב של ניקוי אופטי של דגימות רקמות הלב העכבר כדי להשיג עמוק יותר לעומק הדמיה הדימות נפח גדול יותר עם רזולוציה מספקת הדמיה (איור 1). כדי לכייל את המערכת, חרוזים פלורסנט הונחו בתוך הצנרת זכוכית ובתוך מערכת הדמיה. החרוזים ואז היו עם תמונה, דמיינו במישור x-y, y-z המטוס, ולהפיץ במישור x-z, כדי להשיג את הנקודה פונקציה (PSF) עבור מערכת8. כיול המערכת המיוצר רזולוציה בכיוון לרוחב של ≈ dלרוחב 2.8 µm ופתרון בכיוונים צירית של מיקרומטר 17.4 dXZ ≈ ו dyz ימאהה ≈ 17.9 מיקרומטר בעת שימוש גליצרול כ ההטבעה בינוני-8.

לאחר החרוזים פלורסנט שימשו לצורך כיול, מערכת ההדמייה השתמשו בתמונה העכבר לבבות-יום 1-7 ימים אחרי לידה (איור 2)8. מידות חלל חדרית שסתומי הלב, trabeculation חדרית ניכרות בתמונות האלה של הלב העכבר. ללמוד הבחנה cardiomyocyte בתוך הלב, משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים knockin עכברים עם התווית על-ידי Cre cardiomyocytes היו עם תמונה אחרי לידה. התמונות של cardiomyocytes התווית על-ידי Cre הן לכל כיוון טיסה יחד עם תמונה תלת מימדית של הלב8 (איור 3).

בנוסף למדתי עכברים אחרי לידה, מערכת ההדמייה שימש גם ללמוד את הלב העכבר למבוגרים. בתחילה, ריפוי גנטי שימש להציג ערוצי מתויג GFP ROMK לתוך הלב העכבר. ב- 7.5 חודשים, בלב העכבר היה עם תמונה, ערוצים ROMK אלה היו דמיינו בקיר חדרית (איור 4). שלב זה בתוך השגרה מדגים את היכולת של מערכת זו תמונה מדגמים גדולים, להבדיל מבנים לא ראיתי עם צביעת היסטולוגית בתוך הלב. איור 4 מציג את ערוצי ROMK מ לכל כיוון טיסה יחד עם תמונה תלת מימדית של הלב8.

איור 1 : תרשים סכמטי של מערכת מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה. זהו מודל תלת-ממדי של אור גיליון פלורסצנטיות מיקרוסקופ המערכת, כולל את המרחקים בין הרכיבים של אורכי מוקד של הרכיבים בשימוש במערכת. איור זה שונה מ- Yichen דינג. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : מבט של מערכת מיקרוסקופ אור גיליון עם זיהוי מלמעלה. זה הנוף העליון של מערכת מיקרוסקופ תאורה דו-צדדית כאשר האזור הכחול הכהה מייצג את הקורה בכל מקום בתוך המערכת. כלול הוא מקטע מוגדלת 2-מימדי המציג את אחד מאזורי המורכב doublets אכרומטי ויעד תאורה. סעיף זה מוגדל מציג גם העיקרון של יצירת גליון אור, כיצד הקורות משולבים להארה טופס דו-צדדית. איור זה שונה מ- Yichen דינג. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : תמונות תלת-ממדיות של הלב מאתר אחרי לידה- () לוח זה מראה תמונה של הלב העכבר אחרי לידה ביום 7 מציג את חלל החדר. (b) לוח זה מראה תמונה של הלב העכבר אחרי לידה ביום 7 מציג את עובי הקיר החדר. (ג) לוח זה מראה את התמונה של הלב העכבר אחרי לידה-יום 1 מציג את המיקום של המבנים שסתום. (ד) תמונה זו מציגה את מקטע מוגדלת מהלב העכבר אחרי לידה-יום 1 מציג את השריר pectinate הממוקם באטריום של הלב. (e) תמונה זו מציגה trabeculation בחלל בתוך הלב העכבר אחרי לידה ביום 1. סרגל קנה מידה: 1 מ מ. האזור אדום הקיף תוך שיבוץ מראה שני לבבות העכבר שקוף לאחר עוברת את הטכניקה בהירות, להיות מוכנס לתוך לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט. איור זה שונה מ- Yichen דינג. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : תמונות של cardiomyocytes התווית על-ידי Cre ב עכבר אחרי לידה הלב של כל מטוס. בלב העכבר P1 צולמה עם התווית על-ידי Cre cardiomyocytes במישור כל חתך הרוחב: () XY, (b) yz ימאהה, ו- (ג) XZ. אלה תמונות חתך הרוחב להציג את הנוכחות של התווית על-ידי Cre cardiomyocytes האטריום ואת הנוזלים של העכבר P1. (ד) התמונות מוזגו גם כדי ליצור תמונה תלת מימדית של הלב. האזור אדום הקיף תוך שיבוץ מראה שני לבבות העכבר שקוף לאחר עוברת את הטכניקה בהירות, להיות מוכנס לתוך לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט. סרגל קנה מידה: 1 מ מ. איור זה שונה מ- Yichen דינג. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : תמונות של הלב העכבר למבוגרים מציג את ערוצי ROMK של כל מטוס. בלב העכבר צולמה ב 7.5 חודשים של גיל להראות נוכחות ומיקום של ערוצי ROMK. הלב היה עם תמונה של כל מטוס חתך הרוחב: () XY, (b) yz ימאהה, ו- (ג) XZ. הערך סולם אפור מציין את עוצמת אופטי בתוך התמונה, עם והאזורים הבהירים המתאים יותר עוצמת אור ואזורים כהים המתאים פחות עוצמת האור. (ד) התמונות מוזגו גם כדי ליצור תמונה תלת מימדית של הלב, התמונות המקוריות grayscaled היו מדומים צבעוניים כך הערוצים ROMK יופיעו ירוק. האזור אדום הקיף תוך שיבוץ מראה לב עכבר אחת שקוף למבוגרים לאחר עוברת את הטכניקה בהירות, להיות מוכנס לתוך לאורך צינור זכוכית בורוסיליקט. סרגל קנה מידה: 1 מ מ. איור זה שונה מ- Yichen דינג. et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה איור 1: תמונת החדר ABS עם הצנרת בורוסיליקט בתוך הגיליון אור של מערכת ההדמייה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

המחברים אין לחשוף.