Method Article

תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף+ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

DOI:

10.3791/57776

⸱

September 25th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1US Military HIV Research Program, Henry M. Jackson Foundation, Walter Reed Army Institute of Research, 2Vaccine Research Center, NIAID, NIH

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיאר מתודולוגיה quantitate את הביטוי של גנים 96, 18 פני שטח חלבונים על ידי תאים בודדים לשעבר vivo, המאפשרות הזיהוי באופן שונה באה לידי ביטוי גנים, חלבונים בתאים הנגועים בנגיף ביחס תאים נגוע. אנו מיישמים את הגישה ללימוד CD4 הנגועים סיב+ T תאים מבודד קופי מקוק רזוס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח מתא בודד הוא כלי חשוב ניקוד אוכלוסיות הטרוגניות של תאים. זיהוי ובידוד של תאים נדיר יכול להיות קשה. כדי להתגבר על האתגר הזה, שילוב מתודולוגיה באינדקס cytometry זרימה, פיתחה תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים מרובבת תפוקה גבוהה (qPCR). המטרה היתה כדי לזהות ולאפיין הקופי הכשל החיסוני (SIV)-נגוע תאים מתנה בתוך קופי מקוק רזוס. באמצעות כימות של חלבונים פני השטח על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), ה-mRNA מאת qPCR, תאים הנגועים בנגיף מזוהים על ידי ביטוי גנים ויראלי, אשר בשילוב עם המידות גנים וחלבונים המארח כדי ליצור פרופיל רב-ממדי . אנו המונח את הגישה, הערכה תא בודד Proteo-תעתיק יישוב או tSCEPTRE. כדי לבצע את השיטה, התאים קיימא מוכתמים פלורסנט נוגדנים ספציפיים עבור סמני פני השטח המשמש לבידוד FACS תא משנה ו/או ניתוח פנוטיפי במורד הזרם. תאים בודדים מסודרים שהופעלו על ידי פירוק מיידי, שעתוק במהופך מולטיפלקס (RT), הגברה קדם PCR qPCR תפוקה גבוהה של עד 96 הפרוטוקולים. מדידות FACS הקליט בזמנו של מיון, ולאחר מכן לקשר את הנתונים ביטוי גנים לפי מיקום טוב כדי ליצור חלבון בשילוב פרופיל תעתיק. ללמוד הנגועים SIV תאים ישירות vivo לשעבר, תאים זוהו על ידי זיהוי qPCR של מספר מינים RNA נגיפי. השילוב של תעתיקים ויראלי את הכמות של כל אחת לספק מסגרת לסיווג תאים לשלבים ברורים של מחזור חיי ויראלי (למשל, היצרני לעומת לא פרודוקטיביים). יתר על כן, tSCEPTRE של תאים סיב+ היו תאים בהשוואה נגוע מבודד מן הדגימה זהה כדי להעריך המארח באופן שונה ביטוי גנים, חלבונים. ניתוח הנתונים גילה הטרוגניות ביטוי RNA נגיפי קודם לכן לא מוערך בין תאים נגועים וכן ויוו בתיווך סיב post-transcriptional הכונה ברזולוציה של תא בודד. שיטת tSCEPTRE רלוונטי לניתוח של כל התושבים תא לבצע זיהוי על ידי ביטוי של חלבונים פני השטח marker(s), מארח או פתוגן gene (s) או צירופם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתוגנים תאיים רבים מסתמכים על מכונות התא המארח כדי לשכפל, לעתים קרובות שינוי ביולוגיה של התא המארח או פילוח subpopulations מאוד ספציפי של התאים המארחים כדי להגדיל את סיכוייהם של התפשטות. כתוצאה מכך, תהליכים ביולוגיים תא הם בדרך כלל משובשות, עם השלכות מזיקות על הבריאות הכללית של המחשב המארח. הבנת את האינטראקציות בין וירוסים התאים מארח שבו הם לשכפל לאיפיון מנגנוני המחלה עשוי לסייע בפיתוח של טיפולים משופרים ואסטרטגיות כדי למנוע זיהום. כלים אנליטיים ישירה המאפשרים חקר אינטראקציות פתוגן-פונדקאי חיוניים לצורך כך. ניתוח מתא בודד מספק את האמצעי היחיד לייחס הסלולר פנוטיפ חד משמעית גנוטיפ מסוים או זיהום בסטאטוס1. לדוגמה, זיהומים פתוגניים לגרום לעתים קרובות הן ישירים והן עקיפים שינויים בתוך התאים המארחים. לכן, הבחנה תאים נגועים מהקבצים המקבילים נגוע הכרחי לשינויים התא המארח התכונה זיהום ישירה או השפעות משניות, כגון מוכללת דלקת. יתר על כן, עבור גורמי מחלה רבים, כמו SIV ווירוסים הכשל החיסוני האנושי (HIV), זיהום התא המארח ממשיך דרך שלבים מרובים, כגון מוקדם, מאוחר, או סמויה, שכל אחד מהם עשוי להיות מאופיין על ידי גנים נפרדים פרופילי ביטוי חלבון2 , 3 , 4 , 5. ניתוח בצובר של תערובות תא ייכשל ללכוד זה הטרוגניות6. לעומת זאת, מאוד מרובב תא בודד ניתוחים היכולת לכמת את הביטוי של שניהם ויראלי, מארח את הגנים מציעים אמצעים כדי לפתור לפליטת הסלולר זיהום ספציפיים, כולל וריאציות על פני שלבים זיהום. עוד, ניתוח האינטראקציות פתוגן-פונדקאי פיזיולוגית הגדרות רלבנטיות הינה קריטית לצורך זיהוי אירועים המתרחשים אורגניזמים נגועים. לכן, שיטות שניתן להחיל ישירות שמחוץ הם סביר להניח הטובה ביותר ללכוד ויוו תהליכים.

SIV ו- HIV היעד CD4+ T תאים, שבו הם לנטרל גורמים אנטי-ויראלי "הגבלה" המארח ו downregulate אנטיגן הצגת מולקולות ליצור זיהום פרודוקטיבי ולהימנע מעקב המערכת החיסונית7,8, 9,10,11. ללא טיפול, הזיהום גורמת לאובדן מסיבי CD4+ T תאים, בסופו של דבר לשיאה רכשה כשל חיסוני תסמונת (איידס)12. בהגדרה של טיפול תרופתי, התא הנגוע לחשוף מאגרים להימשך עשרות שנים, מתחזה מחסום אימתני אסטרטגיות המרפא. הבנה של מאפייני ויוו תאים HIV/סיב-הנגועים יש פוטנציאל לחשיפת תכונות התא המארח אינסטרומנטלי פתוגנזה והתמדה. עם זאת, זה מאוד מאתגרת, בעיקר בשל את low frequency של תאים נגועים וחוסר ריאגנטים בקלות להזדהות איתם. תאים לתמלל RNA נגיפי, מוערך להיות נוכח-0.01 – 1% של CD4+ T תאי דם, רקמת הלימפה13,14,15. תחת טיפול מדכא, תאים נגועים לחשוף שכיחים פחות בגיל 10-3–10-7 16,17,18. חלבון נגיפי מכתים assays כי פועלות היטב עבור הלומדים חוץ גופית בתוך זיהומים, כגון איסור פרסום תאיים, הם שיוצרת בשל הרקע מכתים של 0.01 – 0.1%, דומה או גבוה יותר התדירות של תאים נגועים13, 14. צביעת משטח החלבונים Env באמצעות נוגדנים חד-שבטיים סיב/HIV Env ספציפיים מאופיין היטב גם הוכח להיות קשה, ככל הנראה מסיבות דומות. לאחרונה, כלים חדשניים שואפים לשפר את הגילוי של תאים המבטאים את הבדיחה על-ידי שילוב מבחני ספציפי עבור החלטורה RNA או על-ידי שימוש חלופי הדמיה טכנולוגיות14,15,19. עם זאת, גישות כאלה נשארים מוגבל במספר מדידות כמותיים מתבצע על כל תא.

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה (1) המזהה תאים הנגועים בנגיף בודדים ישירות שמחוץ מאת ג'ין ויראלי רגיש וספציפי כמותית qPCR ו- (2) מכמת את הביטוי של חלבונים פני שטח עד 18, גנים 96 לכל נגוע ( תא נגוע). מתודולוגיה זו משלב חלבון משטח תא בודד מדידה על ידי FACS ואחריו פירוק התא מיידית, ביטוי גנים באמצעות ניתוח מרובב יישוב qPCR במערכת Biomark. הטכנולוגיה מעגל משולב fluidic (IFC) מאפשר כימות מרובבת של גנים 96 מדגימות 96 בו זמנית, על ידי מטריצה של צ'יימברס 9,216 שבו מתבצעות תגובות qPCR בודדים. המיון תא חי FACS רשומות מדידות שפע חלבון גבוהה-תוכן תוך שמירה על transcriptome כולה לניתוח מתבצעת באופן מיידי במורד הזרם. כדי לזהות תאים הנגועים בנגיף, מבחני ספציפי עבור RNAs ויראלי, לחלופין משולבים, unspliced (vRNA) הינם כלולים בניתוח qPCR, יחד עם פאנל של מבחני על-ידי המשתמש, בהיקף של עד 96 גנים, המספר המרבי של מבחני השוהים כיום על IFC. ביטוי גנים ומידע חלבון שנאספו עבור כל תא מקושרות על-ידי מיקום טוב. אנחנו קודם לכן דיווח תוצאות של ניתוח זה במקום20. כאן, אנו מספקים יותר מפורטות הנחיות מתודולוגי, כמו גם עוד יותר תיאורי phenotyping של CD4 הנגועים סיב+ T תאים.

גישה זו, אשר אנו המונח tSCEPTRE, ניתן ליישם את המתלים של כל האוכלוסייה קיימא תא תגובתי נוגדנים fluorescently שכותרתו, ביטוי של transcriptome תואם עם מבחני qPCR זמין. לדוגמה, זה יכול לשמש עבור אפיון גנים דיפרנציאלית וביטוי חלבונים תאים נדיר או תאים לא ברצון מכובד על ידי הדם שלה. הכנת הדוגמא מסתמכת על תקן מכתים פרוטוקול באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית. Cytometers עם יכולת מיון תא בודד הינם גם זמינים מסחרית, אך אמצעי אבטחה נוספים נדרשים לעיבוד זיהומיות תאים חיים. מקליט את פרופיל ביטוי יחיד – התא חלבון עבור כל תא על-ידי מיקום טוב, התייחס בזאת כפי באינדקס מיון, היא תכונה נפוצה FACS זמינים מסחרית מיון תוכנה. ניתוח חישובית של המארח באופן שונה ביטוי גנים בין אוכלוסיות תאים עניין לא מתואר כאן, אבל הפניות מסופקים לשיטות שפורסמו בעבר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: תיאור סכמטי של פרוטוקול זרימת העבודה מוצג באיור1. הוא מורכב משלושה שלבים עיקריים: FACS, RT cDNA קדם הגברה, ו qPCR עבור גנים עד 96 בו זמנית. שתי גרסאות של הפרוטוקול, מיון תאי דילולים ולהרחיב תאים בודדים, מתוארים בפירוט רב יותר בין שלב 5 שלב 6, בהתאמה. אסטרטגיות אלו שאלות מחקריות שונות אך לבצע נהלים דומים.

1. תנאים מוקדמים או מוקדמת

  1. אמת כל מבחני ביטוי הגן כדי לשמש שתואר לעיל6.
    הערה: שלב זה נעשה הרבה לפני התאריך הניסוי. אימות של כל מבחני, מסחר, מותאם אישית, נדרש כדי להבטיח הגברה יעיל וארוך של RNA רלוונטי עד לרמת התא היחיד. מבחני זמינים מסחרית ומותאמות אישית רבים להיכשל לפגוש מפרטים אלה. עיבוד פריסטלטיות אוטומטיות עבור הכשרה סימולטני של מבחני ביטוי של גנים עד 96 הינם מסופקים בחדרי משלימה קידוד קבצים 1 – 5, אך מבחני בודדים יכול להיות מוסמך באמצעות R2 והשיפוע של התאים ליניארי. נציג assay שהצליחו ושנכשלו הכשרה חלקות מוצגים באיור2.
  2. לפתח פאנל cytometric זרימה של נוגדנים כתם סמני פני שטח התא עניין.
    1. Titrate נוגדנים על ידי צביעת מדגם רלוונטי, לדוגמה, רזוס היקפיים תאי תאי דם (PBMCs), עם כל נוגדן. להתחיל עם µL 20 של נוגדנים לכל מבחן ב- 100 µL מכתים התגובה וליצור שמונה דילולים טורי כפולה. לזהות את ריכוז אופטימלי זה המוצגים המרבי מכתים בעוצמה תוך שמירה על הפרדה ברורה בין האוכלוסיות שליליים או חיוביים.
    2. הערכת ההכתמה משולב על sample(s) תא נוספים באמצעות התערובת של נוגדנים כל-ריכוז אופטימלי שנקבע בשלב 1.2.1. ודא כי ההכתמה דומה לזה שנצפה על כתמי נוגדן בודדים. אם ההכתמה היא פחות מ תצפית כאשר כל נוגדן שימש בבידוד, שקול fluorochrome חלופי conjugates להחליף נוגדנים כאלה.

2. גנים ביטוי Assay הכנה

  1. ביטוי גנים 96 לשלב assays לתוך RNase/DNase ללא צינור 1 – 15 מ"ל (בגודל עשויה להשתנות עם מספר לוחות מיון). הפאנל של מבחני השתמשו במחקר זה צוין טבלה 1 ו לטבלה 2. החומר המתקבל מכונה "המיקס Assay". להוסיף כל assay ריכוז סופי של 180 ננומטר של תחל ואחורה. להוסיף מאגר ההשעיה דנ א כדי להשיג דילול המתאים של המיקס וזמינותו.
    הערה: למטרות פרקטיות, מניות assay (גולשים) מותאמים אישית שתהיה מוכנה-מיקרומטר 18 עולה בקנה אחד עם הריכוז של מבחני qPCR ביטוי גנים זמינים מסחרית "x 20" (טבלה של חומרים). 18 מיקרומטר תערובות של פריימר ואחורה מותאמים אישית עבור כל הגן עשויים פתרונות מניות במאגר המתלים של ה-DNA. מבחני זמינים מסחרית (טבלה של חומרים) כוללים גם הגששים, אבל הגששים אינם הכרחיים לצורך RT או הגברה קדם cDNA והוא יכול ובכך להיות מושמט עבור מבחני מותאם אישית. מומלץ לכלול אחד או יותר גנים משק בית בשביל להשתמש בבקרת איכות להערכת היעילות של מיון, תא שחזור של cDNA סינתזה. השימוש אקראי תחל לייצר cDNA טרם נקבע, אך צפוי להיות פחות יעילה מאשר תחל גנים ספציפיים.
  2. להכין את 2 x assay צלחת לשימוש בשלב 7.1 (מולטיפלקס qPCR). על כל מערך השבבים, 96x96 הצפוי, פיפטה 6 µL של כל assay לתוך כל איזור טוב של צלחת PCR 96-ובכן. לדוגמה, עבור שבבי 5, 30 µL של כל assay יתפוס לבאר בודדת בצלחת 96-ובכן. אם באמצעות מבחני 96, כל טוב של צלחת 96-ובכן יכיל וזמינותו. חותם את הצלחת בחותם דבק.
    הערה: באופן אידיאלי, שלבים 2.1 ו- 2.2 מבוצעים בו-זמנית, כדי להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה מרובים עבור מבחני ביטוי גנים. כל הגנים בתוך הצלחת assay בטח גם היה נוכח המיקס Assay (שלב 2.1). המיקס assay והן את הצלחת assay שניתן לאחסן ב-20 ° C או 4 ° C לשימוש לטווח ארוך או קצר, בהתאמה.

3. שטח הכתם התאים קיימא

הערה: תאיים מכתים permeabilization, קיבוע אינן תואמות בשיטה זו כפי שהם להתפשר RNA.

  1. הכינו את הדגימות פיצוי על-ידי הוספת כל נוגדן המפורטים בטבלה של חומרים כדי µL 40 של פיצוי חרוזים-2.5-fold ריכוז גבוה יותר מאשר בשימוש עבור תא מכתים. תקופת דגירה של 20 דקות ב- 25 ° C מוגן מפני אור. להוסיף 3 מ"ל של PBS חרוזים, צנטריפוגה ב 500 x g למשך 3 דקות ב 25 º C. האחות של PBS, resuspend את החרוזים ב ~ 300 µL ל- PBS.
  2. להכין את סדרן התא cytometric זרימה לעיבוד מדגם: לרכוש צינורות פיצוי, ליצור במטריצת פיצוי ולהחיל מטריקס לקבצים רכישה עבור דגימות ניסיוני.
  3. הכינו את התמהיל מאסטר של קוקטייל פלורסנט נוגדנים על ידי שילוב של נפח מתאים של כל נוגדן כמפורט בטבלה של חומרים, צינור 1.5 מ ל ענבר עבור כל הדגימות להיות מוכתם. מערבולת, צנטריפוגה אגרגטים הקוקטייל ב 21,000 x g למשך 2 דקות ב- 25 ° C עד הצניפה הנוגדן.
    הערה: נוגדנים המשמש כאן מפורטים בטבלה של חומרים.
  4. להפשיר את התאים cryopreserved באמבט מים 37 ° C עבור 2 דק הוסף 2-0.5 מ"ל של התליה תא 12 מ של PBS בשפופרת 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 500 x g למשך 3 דקות 25 ° c, מחוק לגמרי מגניב. Resuspend ב 3 מ"ל של PBS, העברת צינור פוליסטירן מ. צנטריפוגה כאמור לעיל, תשאף PBS, עוזב ~ 20 µL PBS שיורית.
    הערה: הטמפרטורה מכתימים שעשוי להיות מותאם לטמפרטורות חם או קר לפי הצורך עבור יישומים ספציפיים על-ידי שינוי טיטרציה נוגדן מכתים תנאים בהתאם (ראה שלב 1.2).
  5. Resuspend עד 2 x 107 שטף בתאים µL 80 של נוגדן קוקטייל, תקופת דגירה של 20 דקות ב- 25 ° C מוגן מפני אור. עבור דוגמאות העולה על 2 x 107 תאים, להגביר את עוצמת התגובה מכתימים בהתאם כדי לשמור על < 2 x 107 תאים/100 µL.
  6. לשטוף את התאים על ידי הוספת 3 מ"ל של PBS, צריך שתוציאו ב x 500 g למשך 3 דקות, וכ רפה בעברית את תגובת שיקוע.
  7. ביסודיות resuspend תאי µL 300 – 500 של PBS ואת מסנן על-ידי pipetting דרך 35 מיקרומטר ניילון תא מסננת כובע. להשאיר את התאים על קרח, מוגן מפני אור עד המיון.

4. מכינים תא אוסף צלחות לבצע מיון FACS, צור cDNA

  1. לשלב את המרכיבים תערובת התגובה RT-preamp (טבלה 3) על-ידי pipetting לתוך יחידה RNAse/DNAse ללא סטרילי צינור.
    הערה: שלב זה ניתן לבצע לפני או במהלך צביעת בשלב 3. האנזים RT עשוי להיות מושמט כאן כדי לקבוע את התרומה של תבנית ה-DNA לאות qPCR.
  2. השתמש פיפטה רב-ערוצי כדי לוותר על 10 µL של תערובת התגובה RT-preamp לתוך מספר 96-ובכן PCR סוג אוסף צלחות הרצוי. לאטום את הצלחות עם סרט דביק, ולמקם את הצלחות על קוביות אלומיניום 96-ובכן מראש צוננת.
  3. להקים את התא מיון ערכת המגביל הזרימה cytometer על ידי רכישת נתונים מתאי כ 20,000 המדגם מוכתם. ודא כי מטריקס פיצוי מוחל על הנתונים שנאספו. לצייר השערים ולהגדיר העץ המגביל שמזהה את population(s) תא עניין להיות מבודד לניתוח ביטוי גנים.
    הערה: העץ המגביל המשמש עבור האוסף של תאים vRNA+ סיב פוטנציאליים מוצג באיור3.
  4. הזן את הגדרות המכשיר המתאים כדי לציין את המספר ואת בתאים כדי למיין כל טוב. הדרכה מפורטת נוספים לצורך מיון גם סדרת המגביל של דילול תאים או תאים בודדים ניתנים שלבים 5 ו- 6, בהתאמה.
  5. FACS למיין את התאים מוכן 96-ובכן PCR אוסף לוחות. להסיר את החותם דבק לפני מיון והחלף כלב ים טריים לאחר המיון.
    הערה: לשמור הצלחות על קוביות אלומיניום מראש צוננת בכל עת, לרבות במהלך המיון.
  6. מיד אחרי מיון, מערבולת צנטריפוגה האוסף צלחת ב 2,000 x g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
  7. Thermocycle הצלחת במכונת ה-PCR עם מכסה preheated תוך שימוש בתנאים הבאים: 50 מעלות למשך 15 דקות (RT), 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 18 מחזורים של 95 ° C עבור 15 s ו- 60 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות (קדם הגברה).
  8. לדלל cDNA 1:5 על ידי העברת μL 5 של cDNA לתוך µL 20 של DNA מאגר השעיה של צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. CDNA מדולל ניתן לאחסן 4 ° C או-20 ° C ללא הגבלת זמן בשלב זה. CDNA מוכן כעת שישמש כתבנית עבור qPCR (שלבים 5.2, 7.4).
    הערה: דילול זה מבטיח כי תחל נוכח התגובה RT-preamp אינו תורם qPCR במורד הזרם.

5. וריאציה ת FACS מיין תאים לתוך סדרה דילול הגבלת כדי לקבוע את התדירות של vRNA+ תאים או לבצע את בקרת האיכות ניסיוני

הערה: לפני ביצוע סוג תא בודד, זה עשוי להיות שימוש כדי לקבוע את התדירות של תאים עניין, על-ידי מיון התאים לתוך דילולים סדרתי בשכפול. שלב זה מספק גם בקרת איכות יקר עבור מיון יעילות, פירוק התא, שחזור RNA ו- cDNA סינתזה, כפי שמתואר בשלב 5.3. קביעה מראש של תדירות תא vRNA+ מאפשר הערכה מדויקת יותר של מספר תאים בודדים אותה יש למיין כדי להשיג גודל המדגם מספיק עבור ניתוח ביטוי גנטי של התא מופעל כראוי vRNA+ .

  1. FACS למיין את התאים לתוך הצלחות 96-ובכן מוכן כמו צעדים 4.1-4.2, ולאסוף 1 – 1,000 תאים לכל באר משכפל מרובים.
    הערה: מספר בארות שכפל-כל דילול תא משויכת בדרך כלל הפוך הריכוז תא לכל טוב. כאשר תדירות התא הנגוע מתחת 1%, תא דילולים להתמקד על תאים 100 – 1000 לכל טוב. מפת צלחת של מיון דוגמה מסופק איור 1, למעלה משמאל. העולה על 1000 תאים לכל טוב יש להימנע בשל עליות וכתוצאה מכך נפח התגובה, הפרעה עם cDNA במורד הזרם סינתזה, כימות.
  2. לשלב את ריאגנטים qPCR בפתרון מיקס מאסטר בטבלה4. עבור אמצעי אחסון התגובה µL 25, µL 22.5 של מיקס מאסטר בשילוב עם µL 2.5 של תבנית cDNA מדולל מהשלב 3.9. לבצע את qPCR באמצעות תנאי הרכיבה רגיל (למשל, 94 ° C למשך 5 דקות, ואחריו 40 מחזורי 94 ° C עבור 15 s ו- 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה).
    הערה: תגובות qPCR Singleplex שימוש בכלי qPCR בזמן אמת המקובלת מומלצים כמו ניתוח ראשוני חסכוני אחד או כמה מבחני להפגין מיון היעילה תא, שחזור RNA ו- cDNA סינתזה. זה עשוי לשמש גם כדי לחשב את התדירות של תאים vRNA+ . תגובות qPCR מולטיפלקס באמצעות Biomark הן בדרך כלל מתאים יותר עבור ניתוחים בתא יחיד בקנה מידה גדול.
  3. בקרת איכות, מגרש Et ערכים (Et = −מקסימום Ct Ct) לעומת מספר של תאים ממוינים לפי טוב בקנה מידה10 יומן ולהחיל ניתוח רגרסיה ליניארית.
    הערה: משכפל עקבית, רגרסיה ליניארית השיפוע של 3.3 (± 0.3) ו R2 > 0.9 מעידים על ניסוי יעיל. דוגמאות של האופטימלית, שיוצרת מיון, ניסויים RT-preamp מוצגים באיור4.
  4. כדי לקבוע את התדירות של תאים vRNA+ , חלקה מספרי הטלפון הנייד ממוינות לפי טוב על ה-x (יומן10 סולם) וחלק השבר של בארות חיובי עבור vRNA-כל דילול תא בציר ה-y. לקבלת דוגמה, ראה איור 1 (התפלגות פואסון שמאלה, נמוך יותר). להחיל מודל רגרסיה ליניארית על הנתונים כדי לקבוע את מספר התאים הנמל תא חיובי אחד בממוצע, המקביל ל- 63.2% של בארות חיובי (0.632 בציר ה-y)21. להמיר מספר דילול זה התא (חיתוך ציר x) שכיחות באחוזים. לדוגמה, תא vRNA+ אחד לכל התאים 48 שווה לתדר של 2.1%.

6. וריאציה ב': מיון FACS תאים לניתוח תא בודד

  1. בצע שלבים 4.1 – 4.8, וציין תא אחד ממוינות לפי טוב שימוש בתכונה מיון אינדקס של cytometer זרימה כדי ליצור קבצים בודדים FCS עבור כל תא ממוין, מיפוי לפי מיקום טוב.
    הערה: אם מספר מיון אוסף צלחות חורג מהמספר של thermocyclers זמין, רכיבה על אופניים יכולה להיעצר אחרי השלב איון רוורס טרנסקריפטאז (95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות), ניתן לאחסן cDNA ב 4 ° C עד thermocyclers הינם זמינים. במקרה זה, להתחיל הגברה טרום-מחזור ראשון של 95 ° C 15 s.
  2. אופציונלי: ליצור cDNA "בריכות" המורכב cDNA של קבוצות על-ידי המשתמש של תאים בודדים עבור תאים נדיר עניין באמצעות cDNA מדולל שיורית מסך. העברת µL 2 של מדולל cDNA מראש מוגבר בתא יחיד באמצעות פיפטה רב-ערוצי לתוך צלחת 96-ובכן חדשה. חזור על ידי pipetting 2 µL של cDNA של תאים בודדים כל נוספים של בריכת המיועד לתוך אותו טוב. מסך בריכות cDNA gene (s) עניין (לדוגמה, vRNA) כדי לקבוע את אלה המכילים תאים חיוביים באמצעות qPCR קונבנציונלי. מאז באגירת דורש רק של aliquot קטן של cDNA של כל תא, µL ~ 8 שנותרו של cDNA הוא עדיין זמין עבור ניתוחים תא בודד.
    הערה: אסטרטגיות באגירת מומלץ לפני ביצוע ניתוח ביטוי גנים מתא בודד, במאמץ להפחית את מספר תאים בודדים שנחקרו על-ידי qPCR מולטיפלקס משאבים רבים. היא מתאימה למצבים שבו התאים של הריבית (למשל, סיב mRNA +) עשוי להיות מזוהה על ידי assay qPCR ראשוני יחיד-פלקס. אסטרטגיות פעולה פשוטה תפוקה גבוהה ליצירת בריכות cDNA כוללים שילוב של 2 µL של cDNA מדולל שורות (כלומר, כל 12 תאים בשורה א') של צלחת סוג אוסף או עמודות (קרי, כל 8 תאים בעמודה 1), לבאר בודדת בתוך צלחת חדשה. כדי לקבוע הטוב ביותר באגירת אסטרטגיה, שקול את שכיחות צפויה של תאים עניין מהשלב 5.4. לדוגמה, אם 10% של תאים צפויים להיות חיובי, בריכות מורכבת ששת המדגמים cDNA תא בודד לעתים קרובות תהיה שלילית, התאים ייצג שבמאגר יכול ובכך ייכללו מניתוחי תא בודד במורד הזרם.

7. מולטיפלקס qPCR על פלטפורמה Biomark

הערה: סעיף זה שעשוי בצע גירסה A או B שתוארו לעיל. במחקר המתואר במסמך זה, הוחל באופן בלעדי אל תא בודד ניתוח.

  1. הכן את הצלחת assay qPCR על ידי pipetting 4 µL של כל assay 2 x צלחת assay (להכין בשלב 2.2) לתוך צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן המכיל 4 µL של assay טעינת מגיב היטב בכל. לשמור על הצלחת assay ב 4 º C.
    הערה: הצלחת assay יציב ב 4 ° C עד לשבוע אחד וב-20 ° C למשך חודש אחד. לכן, זה עשוי להיות שימושי כדי להכין חומר מספיק עבור שבבי מרובים, לאחסן כראוי.
  2. לוותר על הנוזלים קו הבקרה של מזרקים לקרקע לתוך צריכת שני המסתמים של השבב. להסיר את הפלסטיק המגן בינות הצלחת. מניחים את השבב על לקונטרולר IFC עם הצד מחורץ במיקום A1. מתוך התפריט הראשי, בחר את התסריט "פריים". להריץ את הסקריפט.
  3. מכינים את תערובת התגובה בזמן אמת על ידי ערבוב 50 µL מדגם טעינת מגיב עם 500 µL של מיקס מאסטר PCR (טבלה של חומרים) עבור כל שבב microfluidic. פיפטה 4.4 µL לתוך כל טוב של צלחת PCR 96-ובכן חדשה, יועד מעתה ואילך "הצלחת מדגם".
  4. פיפטה 3.6 µL של cDNA מדוללת 1:5 מ שלב 4.8 המשקולת מדגם המכיל את תערובת התגובה בזמן אמת.
    הערה: אם PCR למטה-בחירה בוצעה על המסך עבור נדיר (למשל, vRNA+) תאים לניתוח במורד הזרם, כמתואר בשלב 6.2, לכלול רק את התאים ייצג בבריכות חיובי.
  5. בעקבות השלמת לראשוניות שבב, לטעון את אינלטס שבב על ידי שחולק µL 5 מהצלחת assay לתוך המתאימה גם על הצד ומחורצים (assay) של השבב, 5 µL מהצלחת מדגם לתוך המתאימה גם בצד השני (דוגמה) של השבב. הכנס את השבב לתוך הבקר IFC, להריץ את הסקריפט "לטעון מיקס".
  6. להעביר את השבב פלטפורמת Biomark כדי לבצע את qPCR מרובבת. להמשיך עם כלי ההתקנה, תיכנות qPCR בעקבות ההוראות צעד אחר צעד מסופקים על ידי תוכנת ניתוח PCR בזמן אמת, באמצעות פרוטוקול V.1 הרגיל הגן ביטוי (GE) 96.96 עם 40 מחזורי PCR. שמור את הקובץ ChipRun בתיקיה המיועדת.
    הערה: מספר האסימונים ניתן להפעיל ליום, במשך מספר ימים.
  7. לנתח את הנתונים qPCR.
    1. פתח את תוכנת ניתוח PCR בזמן אמת. פתח את הקובץ "ChipRun.bml" "קובץ | תפריט פתוח".
    2. אתר "צ'יפ Explorer" ו- 'סיכום לרוץ שבב' בפינה השמאלית העליונה של חלון התוכנה. לזהות שלושה מרכיבים של התקציר לרוץ שבב: ניתוח נופים, הקמה לדוגמה גלאי ההתקנה.
    3. לחץ על "גלאי להגדרת". תחת "פעילות", לחץ על "חדש" ובחר סוג מיכל "SBS צלחת", פורמט מכל "SBS96". ליד "מיפוי", לחץ על. כפתור ובחר "M96-Assay-SBS96.dsp".
      1. אופציונלי: להקצות לכל גלאי (assay) מספר או שם בסעיף "שם" של כל טוב על ידי לחיצה כפולה על 1סנט . טוב. מעבר לשני על ידי לחיצה על "F2".
    4. לחץ על "הגדרת מדגם". תחת "פעילות" ליד "מיפוי", לחץ. כפתור ובחר "M96-לדוגמה-SBS96.dsp".
    5. לחץ על "נוף ניתוח". תחת "פעילות" בכרטיסיה "qPCR", בחר "תיקון בסיסית עבור לינארית (נגזרת)", "סף Ct השיטה עבור המשתמש (גלאי)". בכרטיסיה "ספי Ct", בדוק "לאתחול עם התיבה האוטומטית". לחץ על לחצן 'נתח' ' לעיל.
    6. ברבע נכון העליון של "ניתוח נוף", לחץ על הכרטיסיה השני "טבלת התוצאות". בתפריט הנפתח, בחר "חום מפה נוף". המפה חום עם נתונים יופיעו.
      1. אופציונלי: כדי להבטיח קרינה פלואורסצנטית רוקס אחיד על פני השבב, בחר "תמונת נוף" במקום "חום מפה נוף" מתוך התפריט. בשלב השני מן החלון בדיוק מעל המפה חום, בחר "רוקס". בחודש הראשון מן החלון הנכון, בחר באחת מחזורים 1-40. לחץ על הרביעי מן החלון הנכון כדי לעבור אל התצוגה בשחור-לבן של זריחה רוקס. תמונה יופיעו מודיע שהכתמים, חלקיקים, או פגמים על השבב. אם אחידות רוקס בגסות מעורפל, הפעל מחדש את השבב.
    7. תחת המפה חום, לחץ על "סף" ו "יומן גרף". התאם את סף Ct באופן ידני עבור כל גלאי על-ידי לחיצה על מבחני (עמודות של המפה חום) וגרירת הסף כנדרש לחצות. את עקומות הגברה בשלב מעריכית. כאשר תסיים, לחץ על 'נתח'.
  8. יצא את הנתונים qPCR כקובץ csv. לייבא את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני או ניתוח סטטיסטי תוכנה (למשל, JMP) ולמפות את התוצאות על-ידי עמדות assay ולדגום את השבב. לארגן את התאים בקבוצות מבוסס על הביטוי של גנים ויראליים, על ידי יצירת עמודה חדשה באמצעות נוסחה מותנית. תחת 'נתח', בחר התאם Y לפי X", מגרש ביטוי גנים נגד קבוצה. החלת ניתוח סטטיסטי.
    הערה: נציג תא בודד ביטוי כמותי של ארבעת המינים SIV RNA מתואר במגרשים bivariate איור 5A. המארח כמותיים ביטוי גנים בתאים SIV RNA+ מוצג באיור 5B.
  9. תמצית חלבון כמותי ביטוי לערכים מנתונים FACS תא בודד.
    1. פתח את .fcs קבצים FACS למיין (שלב 6.1) המתאים צלחת 96-ובכן באמצעות FlowJo גירסה 9. עם שם הקובץ מסומן, בחר "פלטפורמה | שער מספר אירועים | צור אינדקס מיון שערים". תאים בודדים יופיעו המוצג על-ידי שורה.
    2. סמן את כל התאים 96 (לא שורות) ובחר "סביבת עבודה | ייצוא | בחר מדובבים כל fluors". תחת 'סוג נתונים', בחר 'FCS קובץ', לחץ על "לייצא" ובחר תיקייה.
    3. גרור קבצים חדשים .fcs לתאים בודדים לתוך סביבת עבודה חדשה של FlowJo. לסמן את כל התאים, לחץ על "הוסף סטטיסטיקות" (הלחצן "סיגמא" בפינה השמאלית העליונה) "| זאת אומרת | כל עבור חיל הים פרמטרים".
    4. פתח "שולחן עורך" על-ידי לחיצה על לחצן הרביעית משמאל בפינה השמאלית העליונה. להאיר את כל פלואורסצנט של התא הראשון, גרור אותם אל תוך חלון עורך טבלה. בחלון עורך טבלה, לחץ על לחצן אותו בראש ""צור, תצוגת שולחן. פעולה זו תיצור טבלה של תאים 96 ופרמטר מספריים עבור כל עבור חיל הים.
    5. העתק את הפלט לתוך תוכנת מסד נתונים (למשל, MS Excel, JMP), או העתקה/הדבקה או על ידי לחיצה על "שמור, הפעלה של יישום" (הרביעי הלחצן השמאלי מעל השולחן).
      הערה: הליך זה הוא ספציפי FlowJo גרסה 9. FlowJo גירסה 10 משתמש הליך שונה כדי לייבא נתונים הכלולים באינדקס. אינדקס זרימת הנתונים ניתן גם להעתיק/להדביק לתוך JMP ישירות מתוך קבצי. csv, שיצר את סדרן התא.
  10. מיזוג נתונים FACS מתא בודד, qPCR נתונים על-ידי מספר לוחית והצב היטב. לבצע ניתוח גרפיים וסטטיסטיים על הגן בתא יחיד משולב (qPCR) ונתונים ביטוי (FACS) חלבון.
    הערה: דוגמאות של תא בודד בשילוב qPCR, FACS נתונים מוצגים באיור 6 (לארח הדם פרופילי ביטוי עבור תאים מקוק רזוס SIV-נגועים, משולבים vRNA+ ), איור 7 (CD4 ביטוי גנים לעומת השטח CD4 חלבון ביטוי בתאים מקוק רזוס משולבים vRNA+ ), ופורסמו בעבר20. כדי לזהות באופן שונה הביע גנים תא population(s) של עניין, תא בודד ניתוח שיטות שתוארה קודם לכן הם מומלצים20,22,23,24, באיזה חשבון עבור היחס של תאים חיוביים עבור הגן, כמו גם את ערך הביטוי ג'ין רציפה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה עבור פרוטוקול כולו מתואר באיור1. הוא מורכב שתי וריאציות שהוגדרו על-ידי מספר התאים מיון: גם דילול המגביל או כמו יחיד תאים, כפי שתוארה בטקסט. דוגמאות פריימר-בדיקה ניתוחים מוקדמות על 2-fold דילולים RNA טורי מוצגות באיור2. האסטרטגיה חסימה כדי לזהות תאים סיב+ פוטנציאליים מוצג באיור3. QPCR בקרת איכות שהצליחו, שיוצרת ושנכשלו עבור הגן משק GAPDH על תאים ממוין FACS הגבלת דילול ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתוארים כאן, הנקרא tSCEPTRE, משתלב כימות חלבון משטח תא בודד על-ידי cytometry זרימה multiparameter עם ביטוי mRNA תא בודד כמותיים מאוד מרובבת RT-qPCR. האיחוד של שתי טכנולוגיות אלה מאפשר תמונות בעלת תוכן גבוהה של משולב תעתיק חלבון פרופיל של תאים בודדים בתבנית תפוקה גבוהה. נוכל להשתמש בשיטה כדי לזהות עד כה חמקמק תאים נגועים SIV אין ויוו, ומתארים המארח באופן שונה ביטוי גנים, חלבונים. הפרוטוקול ניתן להתאים לצורך המחקר מאוכלוסיית תאים בכל עניין ניתן להבחנה על-ידי הביטוי של פני השטח protein(s), mRNA או שילוב ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הסכם שיתופיות (W81XWH-07-2-0067) בין מ הנרי ג'קסון הקרן קידום של הצבאי לרפואה, inc., ארה ב המחלקה של ההגנה (משרד ההגנה). הדיעות של המחברים, לא יפורש לייצג את העמדות של צבא ארה ב או ההגנה. המחקר נערך תחת פרוטוקול שאושר לשימוש בבעלי חיים במתקן AAALACi מוכר בדרישות חוק רווחת בעלי חיים, אחרים הפדרלי חוקים ותקנות הנוגעים לבעלי חיים, ניסויים בבעלי חיים מעורבים ונדבקת עקרונות נכתב במדריך עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה, הפרסום NRC, 2011 מהדורה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות NIAID VRC Flow Cytometry הליבה ואת המתקנים MHRP Flow Cytometry הליבה עבור תחזוקה ותפעול של FACS מכשירים וציוד מיון; מריה מונטרו, Vishakha שארמה, שיר Kaimei לסיוע טכני מומחה; מייקל Piatak ג'וניור (נפטר) לקבלת סיוע עם סיב qPCR assay עיצוב; ברנדון בדק, מתיו Scarlotta עבור SIV לבודד רצפים. הדיעות של המחברים, לא יפורש לייצג את העמדות של צבא ארה ב או ההגנה. המחקר נערך תחת פרוטוקול שאושר לשימוש בבעלי חיים במתקן AAALAC מוכר בדרישות חוק רווחת בעלי חיים, אחרים הפדרלי חוקים ותקנות הנוגעים לבעלי חיים, ניסויים בבעלי חיים מעורבים ונדבקת עקרונות נכתב במדריך עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה, הפרסום NRC, 2011 מהדורה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments

מיצוי RNA וריאגנטים וחומרים מתכלים של PCR

Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate

BioExpress/VWR

T-3060-1

אטמי צלחת PCR דביקים

ThermoFisher

AB0558

Armadillo 384-well PCR Plate

ThermoFisher

AB2384

MicroAmp סרט דבק אופטי

Applied Biosystems/ThermoFisher

4311971

DEPC מים

איכות ביולוגית

351-068-101

זכוכית מים מזוקקים

Teknova

W3345

Superscript III ערכת qRT-PCR פלטינה חד-שלבית

Invitrogen/ThermoFisher

11732088

SUPERase-In מעכב Rnase

Invitrogen/ThermoFisher

AM2696

Platinum Taq

Invitrogen/ThermoFisher

10966034

dNTP Mix

Invitrogen/ThermoFisher

18427088

צבע ייחוס ROX (אם נפרד מהערכה)

Invitrogen/ThermoFisher

12223012

DNA Suspension Buffer

Teknova

T0223

RNAqueous kit

Invitrogen/ThermoFisher

AM1931

TaqMan מבחני ביטוי גנים שאינם מפורטים בטבלה 2

CD6

Applied Biosystems/ThermoFisher

Hs00198752_m1

TLR3

Applied Biosystems/ThermoFisher

Hs1551078_m1

Biomark ריאגנטים

ControlLine Fluid Kit

Fluidigm

89000021

TaqMan Universal PCR Mix

Applied Biosystems/ThermoFisher

4304437

Assay Loading Reagent

Fluidigm

85000736

מגיב טעינת דגימה

Fluidigm

85000735

מערך דינמי 96.96 (שבב)

Fluidigm

BMK-M-96.96

FACS ריאגנטים

SPHERO COMPtrol עז נגד עכבר (lambda)

Spherotech Inc.

CMIgP-30-5H

CompBeads Anti-Mouse Ig,k

BD Biosciences

51-90-9001229

5 מ"ל שפופרת פוליסטירן עם מכסה מסננת

FALCON

352235

Aqua Live/Dead stain

Invitrogen/ThermoFisher

L34976

מדלל 1:800

עכבר אנטי-אנושי CD3 BV650 שיבוט SP34-2

BD Biosciences

563916

מדלל 1:40

שיבוט

עכבר אנטי-אנושי CD4 BV786 L200

BD Biosciences

563914

לדלל 1:20

עכבר אנטי אנושי CD8 BUV496 שיבוט RPA-T8

BD Biosciences

564804

לדלל 1:10

עכבר אנטי-אנושי CD28 BV711 שיבוט CD28.2

Biolegend

302948

לדלל 1:20

>

עכבר אנטי אנושי CD95 BUV737 שיבוט DX2

BD Biosciences

564710

לדלל 1:10

עכבר אנטי אנושי CD14 BV510 שיבוט M5E2

Biolegend

301842

לדלל 1:83

>

עכבר אנטי אנושי CD16 BV510 שיבוט 3G8

Biolegend

302048

מדלל 1:167

עכבר אנטי אנושי CD20 BV510 שיבוט 2H7

Biolegend

302340

מדלל 1:37

Anti-CD38-R שיבוט PE OKT10

 < p>NHP reagent recource

N/A

מדלל 1:100

עכבר אנטי אנושי CD69 BUV395 שיבוט FN50

BD Biosciences

564364

לדלל 1:10

עכבר אנטי-אנושי HLA-DR APC-H7 שיבוט G46-6

BD Biosciences

561358

לדלל 1:20

עכבר אנטי אנושי ICOS Alexa Fluor 700 שיבוט C398.4A

Biolegend

313528

מדלל 1:80

Instruments

BioPrptect מארז בלימה

Baker

BD FACS Aria

BD Biosciences

ProtoFlex מערכת PCR כפולה 96 בארות

Applied Biosystems/ThermoFisher

4484076

Quant Studio 6 qPCR instrument

Applied Biosystems/ThermoFisher

4485694

בקר IFC HX

Fluidigm

IFC-HX

Biomark HD

Fluidigm

BMKHD-BMKHD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
  2. Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41(2013).
  3. Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
  4. Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
  5. Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
  6. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
  7. Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
  8. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940(2012).
  9. Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67(2016).
  10. Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
  11. Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
  12. Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
  13. Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
  14. Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
  15. Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
  16. Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174(2013).
  17. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  18. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
  19. DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
  20. Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445(2017).
  21. Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
  22. Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278(2015).
  23. McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696(2014).
  24. McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
  25. Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
  26. Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
  27. Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
  28. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
  29. Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
  30. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
  31. Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
  32. Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192(2014).
  33. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
  34. Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188(2016).
  35. Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
  36. Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
  37. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
  38. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
  39. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell AnalysisFlow CytometryQuantitative PCRViral Gene ExpressionSurface Protein QuantitationCell SortingMultiplexed RTqPCRIndexed SortingRhesus Macaque T CellsSimian Immunodeficiency Virus

Related Articles