מאמר שיטה

Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער

DOI:

10.3791/57781

⸱

28 ביוני 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מציגה שיטה לבצע optogenetic יחיד-יחידת הקלטה אמינה מכל עכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה הדאגה העיקרית במדעי המוח שונה סוגי נוירונים עובדים את המעגלים העצביים. התפתחויות אחרונות optogenetics אפשרו את הזיהוי של הסוג עצביים בניסויים ויוו אלקטרופיזיולוגיות באזורים במוח רחבה. בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. עם זאת, קשה לעתים קרובות לספק את האור גירוי לאזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט את ספייק אל האור של תגובות העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים מוחי עמוק. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים המרכזית מורכבת מסוגים שונים של נוירונים, אשר יש פונקציות שונות. איך עובדים אלה סוגים שונים של נוירונים בתוך המעגל העצבי הוא אחד החששות העיקריים במדעי המוח. עם זאת, באזורים במוח רבים, עבר בלתי. אפשרי להבחין את סוגי עצביים ויוו בהקלטות של פעילויות חשמל כי אין הבדל ברור בתוך האות החשמלי ספייק עצמו, עם מספר חריגים. התפתחויות אחרונות optogenetics הפכו את פריצת הדרך1,2. באמצעות בעלי חיים מהונדס שבו רגישים לאור אופסין (למשל, channelrhodopsin-2) מתבטא בסוגי עצביים מסוימים, ניתן היה להבחין את סוגי עצביים יעיל בויוו הקלטות3, 45,,6. החיות הללו, הנוירונים עם רגישים לאור אופסין שמחים על ידי מתן גירויים קלים במהלך הקלטות חשמל, אך נוירונים אחרים אינם. הנוירונים אופסין-חיוביים, ולכן בקלות נבדלים סוגים אחרים נוירון על ידי תשובותיהן לאור.

בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. כמו שיטה לא פולשנית, האור מכוונת בדרך כלל מפני השטח של המוח. עם זאת, כי כוחו של האור מפחית כמו זה עובר דרך רקמת המוח, קשה לעורר את האזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. ניסויים אלקטרופיזיולוגיות לעיתים קרובות בוצעו על חיות מורדם בגלל תנועת הגוף גורם רעש בהקלטות. כפי מתועד היטב, עם זאת, הרדמה ידוע כדי לשנות את תגובות עצביות7,8,9,10. לפיכך, יש צורך להשתמש בבעלי חיים ער ללימוד תגובות עצביות ללא השפעת הרדמה מלאכותי. בניגוד הניסויים בחיות מרדימים, ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות מבוצעות לאחר ההחלמה מניתוח בניסויים בחיות ער. במהלך מרווח בין הניתוח ובין ההקלטות, תפליט רקמת לעיתים קרובות מצטבר על פני המוח והופכת את שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך.

כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט הקלטות יחיד-יחידה העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים עמוקים במוח. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים נעשים על פי העקרונות המנחים של החברה פיזיולוגיים של יפן, באישור של בעלי חיים אכפת הוועדה של קנאזאווה רפואי האוניברסיטה.

1. בנייה של בעל Optrode זכוכית

הערה: כדי לבנות בעל optrode זכוכית, בעל אלקטרודה מסחרי משמש (איור 1 א').

  1. משוך בעדינות החוצה את צינור פלדה לבקרת לחץ מתוך לוע של המחזיק.
  2. על ידי קידוח, להרחיב את החור של הצד המושב סיכה בקנה של בעל. להפוך את החור 3 מ מ בקוטר של 12 מ מ עומק.
  3. לשים צינור פלדה אל חלד (3 מ מ בקוטר של 0.5 מ מ עובי, 8 מ"מ אורך; איור 1A 2) בתוך החור.
  4. הכנס קרמיקה לפצל שרוול ההזדווגות עבור ⌀2.5 ferrules מ מ (איור 1 א'1) לתוך החור.
  5. לתקן את החבית של בעל אלקטרודה rabbet בצורת L עם דבק אפוקסי.
  6. להפוך את החורים (3 מ מ קוטר) rabbet ולחבר אותו תחמן עם ברגים.

2. ראש פוסט התקנה

  1. להכין פוסט ראש לפי הזמנה של כרווח המעגל. להפוך את מרווח טורי המעגל לצורה cuboidal בחותך הטחינה, לחתוך אותו ל 2 פוסטים בראש עם מסור (איור 1B). לשטח בתחתית העמוד הראשי בחותך הטחינה.
  2. הכנת החיה מהונדס שבו מתבטאת אופסין רגישים לאור סוג של תא עצב מסוים לצורך המחקר. בעבודה זו, נעשה שימוש בעכבר הטרנסגניים (VGAT-ChR2 עכברים) שבו הנוירונים מעכבות אקספרס channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .
  3. עזים ומתנגד החיה עם תערובת של 0.3 מ"ג/ק"ג של medetomidine, 4.0 מ"ג/ק"ג של midazolam ו- 5.0 מ"ג/ק"ג של butorphanol על ידי מינהל בקרום הבטן. כדי לוודא כי החיה. הוא מורדם לחלוטין, בדיקת התגובות שלה אל הזנב צובט.
  4. הנח את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic על כרית החימום. נקי את המסגרת stereotaxic וחימום פאד עם אלכוהול 70% מראש. למקם את השיניים בתוך החור של שורת ביס, והדק בקלילות את המלחציים האף. לתקן את שני צידי הראש באמצעות האוזן ברים. כאשר הראש כראוי קבוע בסורגים האוזן, להדק את המלחציים האף. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים.
  5. לגלח את העור ראש עם מספריים קטנות, לנקות את הקרקפת באמצעות מקלון צמר גפן של chlorhexidine gluconate. לפני הניתוח, לעקר את כל שמכשירי הניתוח וראש פוסט עם החיטוי (121 מעלות, 15 דקות).
  6. לחתוך את הקרקפת לאורך הקו האמצעי עם מספריים ודחף אותו הצידה. לבצע את החתך מהחלק האחורי של הראש לעיניים (כ 20 מ מ). הסרת קרום העצם באמצעות מקלון צמר גפן טבול באלכוהול 70% ויבש את הגולגולת.
  7. לצרף את ההודעה לראש manipulator. מקם את ההודעה ראש שטוח על הגולגולת סביב bregma באמצעות manipulator.
  8. מערבבים את מונומר (4 טיפות), זרז (טיפה 1) ופולימר (1 כף קטנה) של מלט שיניים בצלחת קטנה זה הוא מקורר במקרר מראש. לשים את הבטון שיניים (להלן 1 g) על המצח ועל עצם הקודקוד של הגולגולת כדי לתקן את ההודעה לראש בגולגולת.
  9. לאחר הבטון שיניים נעשה קשה להסיר את העכבר המסגרת stereotaxic. לשים משחה לאנטיביוטיקה על העור החשוף. להזריק את medetomidine אנטגוניסט (0.3 מ"ג/ק"ג), האנטיביוטיקה (oxytetracycline; 20 מ"ג/ק"ג). מקום לנטר את העכבר על משטח חום בתוך כלוב עד התעורר ו להחזיר אותו לכלוב דיור.
  10. בית החיה בכלוב למגורים נפרדים עם איזה מכשיר העשרה. לשנות את הנייר בעלי חיים מצעים כל יום כדי לשמור על ניקיון הכלוב ולמנוע זיהום. בזהירות לפקח אם החיה מראה סימנים של אי נוחות. להחיל לידוקאין הפצע אם חשוד בשום כאב. מנהל meloxicam או carprofen פעם אחת בכל 24 שעות במשך 48 שעות אחרי שני בראש פוסט ניתוחי התקנה של גולגולת. הלידוקאין המקומי יכול להינתן בנוסף אם NSAID אינה מספיקה.

3. להתאקלמות

  1. שני ימים (לפחות) לאחר ההתאוששות מן ההרדמה, להתאקלם החיות למצב שבו הראש-קבוע בבית הבליעה הקלטה. לבצע את ההפעלות להתאקלמות למשך 5 ימים לפחות.
  2. במהלך המפגשים והפיזיולוגי, להכניס החיה בבית הבליעה הקלטה עם הדואר ראש קבוע כדי מלחציים לפי הזמנה. במהלך ההפעלה, כדי להגביל את התנועה, כיסוי הגוף בעזרת צינור חצי שרף בהזמנה אישית (איור 1C), עשה שימוש במדפסת תלת-ממד.
    הערה: ביום 1, הפעלת להתאקלמות צריך להיות ארוך 5 דקות. זה ואז גדל מדי יום כדי 10, 20, 40 ו- 60 דקות ימים 2, 3, 4 ו-5, בהתאמה.
  3. בסוף כל מפגש, תן החיה לפרס של אוכל. אם החיה נאבק באופן רציף במהלך להתאקלמות, להפסיק את ההפעלה.

4. גולגולת

הערה: לאחר והפיזיולוגי, גולגולת נעשית השתלטה על האזור במוח להקלטה. הניתוח מבוצע במסגרת stereotaxic תחת הרדמה, כמו עם הראש פוסט ההתקנה. ההליך פעולה-מאוחרת זה אותו הדבר כמו הראש פוסט התקנה

  1. לפני הניתוח, ינקה את הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן עם chlorhexidine gluconate ו- 70% אלכוהול.
  2. בזהירות לגרד את הגולגולת מעל האתר הקלטה עם מקדח שיניים. כאשר העצם הופכת מספיק דק, חותכים את זה עם קצה האזמל ולהסיר אותו.
  3. לשים מלט שיניים באזור חשוף על מנת לחזק את הגולגולת.
  4. לכסות את האזור במוח חשוף עם דבק סיליקון לאחר הבטון שיניים נעשה קשה. הנוהל לאחר הניתוח הוא כפי שמתואר בשלב 2.8.

5. אלקטרופיזיולוגיות הקלטה

  1. לאפשר את החיה להתאושש במשך לפחות יום אחד לאחר הניתוח לפני ביצוע ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות. למקם את החיה בבית הבליעה הקלטה באותה דרך שזה נעשה במהלך המפגשים להתאקלמות מתי התחלת הקלטת.
  2. להפוך פיפטות זכוכית של נימים זכוכית בורוסיליקט (OD = 1.5 מ מ, ID = 0.9 מ מ, 90.0 מ"מ) של פולר אלקטרודה. קוטר עצה שלהם היא 3-2 מיקרומטר, ההתנגדות שלהם הוא 4-6 MΩ כאשר הם מלאים 10 מ ל- PBS. האורך של האלקטרודה הוא 40 – 50 מ מ. בכמה הקלטות, 2% neurobiotin נוסף של 10 מ ל- PBS.
  3. לצרף את פיפטה מזכוכית מלא בעל optrode בהזמנה אישית.
  4. מכניסים את החוט כסף Ag-Cl מצופה (0.2 מ"מ קוטר) פיפטה מזכוכית. לחבר את החוט כסף מספר הזיהוי האישי שלך באמצעות חוט חשמל דק מצופה. לחבר את ה-pin headstage של המגבר הקלטה.
  5. חבר את כבל סיבים אופטיים תיקון (הליבה = 960 מיקרומטר, חיפוי = 1,000 מיקרומטר, NA = 0.63) עם ferrule זרקוניה (OD = 2.5 מ מ) כדי הפיצול ההזדווגות שרוול על בעל optrode. דחוף את תיקון כבל לתוך השרוול עד קצה ferrule הקשר האחורי של פיפטה מזכוכית. תיקון כבל מספק את האור (אורך גל = 465 nm) מ LED. נורית ה-LED נשלטת על ידי נהג LED ערוץ אחד.
  6. הסר את דבק סיליקון מעל הניתוח. במקום ומחוממת תמיסת מלח (38 ° C) על פני המוח מעת לעת כדי למנוע את פני השטח של המוח ייבוש במהלך להקלטות. במידת הצורך, הסר את השכבה הקשה של המוח עם פינצטה חדה.
  7. הכנס את אלקטרודת זכוכית רקמת המוח עם תחמן. נטר את ההתנגדות אלקטרודה הוספתו. החלף את האלקטרודה כאשר ההתנגדות היא נמוכים מהמצופה כי קצה האלקטרודה עלולים להינזק. בעומק של עניין, חיפוש ולבודד את הקוצים יחידה על-ידי התאמת העומק בשלבים 2-5 מיקרומטר.
  8. לאחר היחידה מבודדת, לספק נורית ה-LED ולבחון את התגובה לגירויים קלים.
  9. להקליט את פעילות עצבית לאחר הזיהוי של סוגי תאים. לבצע ההקלטות עבור 2-3 h. אם ההקלטה מתבצעת על ימים רצופים (מקסימום של 2 ימים), לכסות את הניתוח עם דבק סיליקון. בעת ההקלטה הסתיימה, החיה הוא הקריב, לאחזר את ההודעה לראש ושם אותו בתוך אצטון לשטוף ולהשתמש מחדש זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2, בדקנו את ההשפעות של גודל הטיפ ואורך פיפטות זכוכית על כוח האור בקצה מדי סוכר (איור 2 א-ב'). אור החשמל נמדדה על ידי מד הכוח האופטי להציב 1 מ"מ מן הקצה. אורך מלא הוגדר 50 ± 2 מ מ כאשר גודל קצה מגוונים, ואילו גודל קצה הוגדר 2.5 מיקרומטר כאשר אורך מלא מגוונות. הדוקרן של פיפטה מזכוכית הוגדר 8 מ מ. הכוח אור בקצה נע בין 3-5 מגוואט (זאת אומרת ± SD; איור 2A: 3.77 ± 0.29 mW, n ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetics הפך להיות כלי רב עוצמה במדעי המוח. היא ניצלה זיהוי נוירון מסוים סוגי ויוו , כמו גם מניפולציה הפעילות של מסלולים עצביים מסוימים. ההבהרה של הפעילות העצבית של סוגים עצביים שונים מקדם את ההבנה של המנגנון של מעגלים עצביים. כאן, אנחנו הפגינו שיטה להעברת האור לאתר הקלטה דרך אלקטרודת זכוכית ב IC של עכברים VGAT-ChR2 ער.

ישנם מספר שלבים קריטיים השיטה המתוארת. ראשית, זו דרישה לשימוש בבעלי חיים עם ביטוי מספיק וספציפיות של opsins של הנוירונים היעד. כדי לזהות את התגובות אור עם הקלטות ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים נתמכו על ידי החברה יפן 17H 02223 של קידום המדע KAKENHI גרנט JP16K11200, המענק לחקר מ קנאזאווה רפואי באוניברסיטת S2016-8 ו- C2017-3. אנו מודים Yuhichi מלון התמיכה שלו לקחת את התמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחזיק אלקטרודהמכשיר מולקולרי1-HL-Uמחזיק פיפטה למגבר מיקרואלקטרודה
שרוול הזדווגות מפוצל קרמיThorlabsADAF1f2.5 מ"מ טבעת
מעגלים מרווחTeishin DenkiSPA-320f8.0 מ"מ, אורך 20.0 מ"מ
מסגרת סטריאוטקסית לעכבריםNarishigeSR-6M-HTמכשירים סטריאוטקסיים לעכברים
מניפולטורNarishigeNAמניפולטור ידני
SuperbondSun MedicalM: 204610557צמנט שרף דבק דנטלי
Form2FormlabsNAמדפסת תלת מימד
Kwik-SilWPIKWIK-SILדבק סיליקון בעל רעילות נמוכה
נימי זכוכית בורוסיליקטNarishigeGD-1.5OD 1.5 מ"מ, ID 0.9 מ"מ, אורך 90.0 מ"מ
כבל תיקון סיבים אופטייםעדשות דוריותMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5כבל תיקון מונופיבראופטי, OD, 2.5 מ"מ, ליבה = 960 מ"מ, חיפוי = 1000 מ"מ, NA = 0.63
עדשות LED דוריותמחוברותLEDC-1B_FCאורך גל מרכזי = 465 ננומטר, הספק פלט = 45 mW (ליבה 960 מ"מ 0.63 NA)
דרייבר LEDעדשות דוריותLEDRV_1CH_1000דרייבר LED 1 ערוצים, תפוקה מקסימלית = 1000 mA
מושך אלקטרודותNarishigePB-7דו-שלבי זכוכית micropipette חולץ
בורוסיליקט זכוכית נימיNarishigeGD-1.5נימי זכוכית בולוסיליקט, OD, 1.5 מ"מ, ID, 0.9 מ"מ, 90.0 מ"מ אורך
GENTACINMSD CO., Ltd185711173משחה אנטיביוטית
Terramycin®-LAZoetisG 333Oxytetracycline
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/JJackson Labs#14548עכברי VGAT-ChR2
Multiclamp 700Bהתקנים מולקולריים2500-0157מגבר מיקרואלקטרודה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  2. Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).
  3. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
  4. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757(2016).
  5. Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
  6. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099(2009).
  7. Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
  8. Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
  9. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
  10. Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
  11. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  12. Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
  13. Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
  14. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  15. Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
  16. LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
  17. Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
  18. Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patch CordVGAT Channelrhodopsin IISpike Response

מאמרים קשורים