עבודה זו מציגה שיטה לבצע optogenetic יחיד-יחידת הקלטה אמינה מכל עכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער
במאמר זה
סיכום
תקציר
זה הדאגה העיקרית במדעי המוח שונה סוגי נוירונים עובדים את המעגלים העצביים. התפתחויות אחרונות optogenetics אפשרו את הזיהוי של הסוג עצביים בניסויים ויוו אלקטרופיזיולוגיות באזורים במוח רחבה. בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. עם זאת, קשה לעתים קרובות לספק את האור גירוי לאזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט את ספייק אל האור של תגובות העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים מוחי עמוק. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.
מבוא
מערכת העצבים המרכזית מורכבת מסוגים שונים של נוירונים, אשר יש פונקציות שונות. איך עובדים אלה סוגים שונים של נוירונים בתוך המעגל העצבי הוא אחד החששות העיקריים במדעי המוח. עם זאת, באזורים במוח רבים, עבר בלתי. אפשרי להבחין את סוגי עצביים ויוו בהקלטות של פעילויות חשמל כי אין הבדל ברור בתוך האות החשמלי ספייק עצמו, עם מספר חריגים. התפתחויות אחרונות optogenetics הפכו את פריצת הדרך1,2. באמצעות בעלי חיים מהונדס שבו רגישים לאור אופסין (למשל, channelrhodopsin-2) מתבטא בסוגי עצביים מסוימים, ניתן היה להבחין את סוגי עצביים יעיל בויוו הקלטות3, 4<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים נעשים על פי העקרונות המנחים של החברה פיזיולוגיים של יפן, באישור של בעלי חיים אכפת הוועדה של קנאזאווה רפואי האוניברסיטה.
1. בנייה של בעל Optrode זכוכית
הערה: כדי לבנות בעל optrode זכוכית, בעל אלקטרודה מסחרי משמש (איור 1 א').
- משוך בעדינות החוצה את צינור פלדה לבקרת לחץ מתוך לוע של המחזיק.
- על ידי קידוח, להרחיב את החור של הצד המושב סיכה בקנה של בעל. להפוך את החור 3 מ מ בקוטר של 12 מ מ עומק.
- לשים צינור פלדה אל חלד (3 מ מ בקוטר של 0.5 מ מ עובי, 8 מ"מ אורך; איור 1A 2) בתוך החור.
- הכנס קרמיקה לפצל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2, בדקנו את ההשפעות של גודל הטיפ ואורך פיפטות זכוכית על כוח האור בקצה מדי סוכר (איור 2 א-ב'). אור החשמל נמדדה על ידי מד הכוח האופטי להציב 1 מ"מ מן הקצה. אורך מלא הוגדר 50 ± 2 מ מ כאשר גודל קצה מגוונים, ואילו גודל קצה הוגדר 2.5 מיקרומטר כאשר אורך מלא מגוונות. הדוקרן של פיפטה מזכוכית הוגדר 8 מ מ. הכוח אור בקצה נע בין 3-5 מגוואט (זאת אומרת ± SD; איור 2A: 3.77 ± 0.29 mW, n .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Optogenetics הפך להיות כלי רב עוצמה במדעי המוח. היא ניצלה זיהוי נוירון מסוים סוגי ויוו , כמו גם מניפולציה הפעילות של מסלולים עצביים מסוימים. ההבהרה של הפעילות העצבית של סוגים עצביים שונים מקדם את ההבנה של המנגנון של מעגלים עצביים. כאן, אנחנו הפגינו שיטה להעברת האור לאתר הקלטה דרך אלקטרודת זכוכית ב IC של עכברים VGAT-ChR2 ער.
ישנם מספר שלבים קריטיים השיטה המתוארת. ראשית, זו דרישה לשימוש בבעלי חיים עם ביטוי מספיק וספציפיות של opsins של הנוירונים היעד. כדי לזהות את התגובות אור עם הקלטות ח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים נתמכו על ידי החברה יפן 17H 02223 של קידום המדע KAKENHI גרנט JP16K11200, המענק לחקר מ קנאזאווה רפואי באוניברסיטת S2016-8 ו- C2017-3. אנו מודים Yuhichi מלון התמיכה שלו לקחת את התמונות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחזיק אלקטרודה | מכשיר מולקולרי | 1-HL-U | מחזיק פיפטה למגבר מיקרואלקטרודה |
| שרוול הזדווגות מפוצל קרמי | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 מ"מ טבעת |
| מעגלים מרווח | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 מ"מ, אורך 20.0 מ"מ |
| מסגרת סטריאוטקסית לעכברים | Narishige | SR-6M-HT | מכשירים סטריאוטקסיים לעכברים |
| מניפולטור | Narishige | NA | מניפולטור ידני |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | צמנט שרף דבק דנטלי |
| Form2 | Formlabs | NA | מדפסת תלת מימד |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | דבק סיליקון בעל רעילות נמוכה |
| נימי זכוכית בורוסיליקט | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 מ"מ, ID 0.9 מ"מ, אורך 90.0 מ"מ |
| כבל תיקון סיבים אופטיים | עדשות דוריות | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | כבל תיקון מונופיבראופטי, OD, 2.5 מ"מ, ליבה = 960 מ"מ, חיפוי = 1000 מ"מ, NA = 0.63 |
| עדשות LED דוריות | מחוברות | LEDC-1B_FC | אורך גל מרכזי = 465 ננומטר, הספק פלט = 45 mW (ליבה 960 מ"מ 0.63 NA) |
| דרייבר LED | עדשות דוריות | LEDRV_1CH_1000 | דרייבר LED 1 ערוצים, תפוקה מקסימלית = 1000 mA |
| מושך אלקטרודות | Narishige | PB-7 | דו-שלבי זכוכית micropipette חולץ |
| בורוסיליקט זכוכית נימי | Narishige | GD-1.5 | נימי זכוכית בולוסיליקט, OD, 1.5 מ"מ, ID, 0.9 מ"מ, 90.0 מ"מ אורך |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | משחה אנטיביוטית |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | עכברי VGAT-ChR2 |
| Multiclamp 700B | התקנים מולקולריים | 2500-0157 | מגבר מיקרואלקטרודה |
מקורות
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
