הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57784

⸱

25 באוגוסט 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.

תקציר

ראשי keratinocytes האנושי מבודד רקמות עור רענן, שלהם הרחבה במבחנה היה בשימוש נרחב עבור מחקר מעבדתי, יישומים קליניים. השיטה המקובלת בידוד keratinocytes האנושי כרוך הליך רציפים עיכול אנזימטי בן שני שלבים, אשר הוכח להיות יעיל ליצירת תאים העיקרי של רקמות בוגרות עקב קצב התאוששות התאים נמוך תא מופחת הכדאיות. לאחרונה דיווחנו שיטה מתקדמת כדי לבודד אנושי ראשוני עוריות ובתאים של רקמות העור אשר מנצל את מעכבי קינאז רו Y-27632 בטווח הבינוני. בהשוואה עם פרוטוקול מסורתיים, שיטה חדשה הוא יותר פשוט, קל יותר, פחות זמן רב, ו מגביר תאי אפיתל התשואה ומגבירה את המאפיינים תאי הגזע שלהם. יתר על כן, המתודולוגיה החדשה אינה דורשת את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, ומתאים, לכן, לבודד תאים מסוגים שונים של רקמות בוגרות. שיטה חדשה זו בידוד מתגבר את החסרונות העיקריים של שיטות קונבנציונליות, והוא מתאים יותר לייצר מספר גדול של תאים באפידרמיס עם האון גבוהה הן במעבדה והן עבור יישומים קליניים. כאן, אנו מתארים את השיטה החדשה בפירוט.

מבוא

המטרה הייתה לפתח פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לבודד keratinocytes אנושי ראשוני (HKCs) של רקמות בוגרות, במיוחד עבור יישומים קליניים. תאי גזע עוריות העור, מותאם לשכבת הבסיס של העור, בעלי פוטנציאל גבוה כדי להתרבות, להבדיל ולספק keratinocytes כדי לשמור על הפונקציות של העור1,2,3, 4. HKCs מבודד מן העור רקמות נמצאים בשימוש נרחב למטרות בעור רקמות הנדסה והתחדשות, במיוחד בתיקון של עור פגוע, ריפוי גנטי עבור יישומים קליניים5,6. הנושא המרכזי עבור יישומים מבוססי-HKC הוא ביעילות לבודד ולהרחיב מספרים גדולים של HKCs עם גבוהה פוטנציאל במבחנה7,8. למרות קבוצות מחקר שונות פיתחו שיטות כדי לייצר תרבויות של גזע דמוי HKCs, שיטות אלה הם לעיתים זמן רב ומורכב לבצע ויש מגבלות אחרות, כגון תא נמוך התשואות מוגבלים לפי סוג העור הדגימה שימוש9. למשל, השיטה המסורתית כדי לבודד HKCs רקמות העור כרוך עיכול אנזימטי של שני שלבים עם הפרדה של האפידרמיס הדרמיס6. בשיטה זו בדרך כלל עובד טוב בשביל לרקמות neonatal, אבל זה הופך להיות קשה מאוד, כאשר נעשה שימוש כדי לבודד תאים של רקמות בוגרות.

Y-27632, מעכב של רו-הקשורים חלבון (רוק), דווח לשפר באופן משמעותי את היעילות של תאי אפידרמיס בידוד והמושבה הצמיחה10,11,12. במחקר הקודם, גילינו כי Y-27632 מקלה על צמיחת תאים אפידרמיס המשובטים אך מפחית את התשואה של עורי תאים על-ידי שליטה באופן שונה את הביטוי של מולקולות אדהזיה13. הקמנו גם מדיום ממוזגים חיסון חדש, בשם G-בינוני, אשר תומך את הצמיחה ואת התשואה של ראשי תאים באפידרמיס. על ידי שילוב G-בינוני עם Y-27632, שיטה חדשנית זו יכול באופן ספונטני נפרד תאים באפידרמיס עורי לאחר אנזים עיכול, ובכך להסיר את השלב של האפידרמיס-הדרמיס ההפרדה13,14. על סמך דיווחים קודמים, נתאר עכשיו ההליך מפורט של שיטה חדשה כדי לבודד HKCs של רקמת עור מבוגר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ברקמות אנושיות בשימוש פרוטוקול זה יטופל בהתאם לקווים המנחים של ועדת האתיקה האנושית המחקר של המוסד (NO.2015120401, תאריך: מאי 12, 2015).

1. תכשירים

  1. רקמות לאסוף טריים בעור בטן למבוגרים שנמחקו מן לכירורגיה פלסטית בבית החולים, שפופרת 50-mL עם 10 מ"ל של Dulbecco קר כקרח המתואמת של הנשר בינוני (DMEM). ניתן לשמור את הדגימה ב 4 ° C עבור עד 72 שעות מבלי להשפיע באופן משמעותי את הכדאיות התא.
  2. להכין את ריאגנטים תרבות בינוני כפי שמתואר להלן.
    1. להוסיף 1 מ"ל של פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 מ ג/ליטר) 50 מ של פתרון באגירה פוספט (PBS) כדי להכין את הפתרון כביסה.
    2. להכין שני סטים של אנזים עיכול פתרונות: (1) להכין 50 מ של dispase (2.5 מ"ג/מ"ל ב- DMEM), 50 מ של סוג אני collagenase (2.5 מ"ג/מ"ל ב- DMEM) בנפרד עבור השיטה המקובלת; (2) להכין 50 מ של תערובת של dispase, מסוג collagenase (התמוססות 125 מ ג של אבקת dispase ו- 125 מ"ג של להקליד אני אבקת collagenase 50 מ של DMEM) על השיטה החדשה.
      הערה: כל הפתרונות אנזים צריך להיות מסונן עם מסננת 0.22-מיקרומטר, המשיכה חברת at4 מעלות צלזיוס.
    3. הכנת מערכת העיכול פתרונות עבור שתי שיטות: 0.05% טריפסין, 0.25% טריפסין נרכשו מסחרית. הכינו 10 mg/mL DNase אני הפתרון על ידי המסת 50 מ"ג של DNase אני לפדר ב 5 מ של PBS, תסנן את זה עם מסננת 0.22-מיקרומטר, ואחסן אותו ב-20 ° C.
    4. הכנת 500 מ"ל של מדיום כדי לנטרל. את עיכול אנזימטי: בינוני DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    5. הכנת 500 מ"ל של חיסון בינוני (צמיחה פקטור-המכילות בינוני, בשם G-בינוני): DMEM/F12 בינונית (3:1) המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין, fungizone µg/mL 40, 40 ng/mL פיברובלסט גורם גידול 2 (FGF2), 20 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), ו תוספת 2% B27.
    6. Pretreat תרבית תאים מ מ 100 מנות עם 2 מ של ציפוי מטריצה המכילה סוג אני קולגן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

2. השיטה המקובלת

  1. רעלני רקמת העור
    1. קח 1.5 ס מ2 של רקמת העור ולשטוף אותו x 1 עם 10 מ"ל של PBS; לאחר מכן, לשטוף אותו עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s דגירה זה 2 x עם 10 מ"ל לרחוץ את הפתרון (PBS המכיל 2% פניצילין, סטרפטומיצין), 5 דקות כל אחד.
      הערה: כל שוטף מבוצעות במנות תרבות תא 100-מ מ בתוך תא למינארי.
    2. חתוך את הרקמה במספריים סטרילי כדי להסיר את שכבת השומן התת עורית בצלחת תרבות תא 100-מ מ, ואז, שוקל רקמת העור (המשקל הוא 1 g בפרוטוקול זה).
      הערה: זמירה מספקת חיונית מאוד ההפרדה יעיל של האפידרמיס של הדרמיס. שכבת השומן צהבהב ניתן בקלות להבחין ויזואלית.
    3. להעביר הרקמה תבשיל סטרילי אחר של 100 מ מ עם הצד הדרמיס למטה וחותכים, ואז, רקמת העור לרצועות 3 ל 4-מ מכולו באמצעות להב סכין.
      הערה: הצד הדרמיס עם שכבת השומן בקלות מזוהה מבחינה ויזואלית.
    4. הוסף 10 מ"ל של 2.5 מ"ג/מ"ל dispase פתרון לרקמות העור בצלחת 100-מ מ תרבות ', לאחר מכן, דגירה המנה בין לילה ב 4 ° C (לא יותר מ- 20 h).
      הערה: ניתן לחשב את כמות dispase פתרון באמצעות 10 מ"ל של dispase פתרון למערכת העיכול של כל גרם של רקמת.
  2. ההפרדה של האפידרמיס של רקמת העור
    1. ביום השני, לקלף האפידרמיס של הדרמיס באמצעות פינצטה משובחים.
      הערה: אם קשה לקלף את האפידרמיס, עיכול dispase לא הספיק, שהוא בדרך כלל עקב מחסור חיתוך של הרקמה. במקרה זה, הרקמה צריך זמן דגירה ארוך יותר.
    2. מינצ האפידרמיס קלופים עם 500 µL תא תרבות בינוני לתוך slurry רקמות באמצעות להבים ומהדקים; לאחר מכן, resuspend זה עם 10 מ"ל של 0.25% טריפסין בשפופרת 50-mL, דגירה זה 20 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C, ברעידות.
  3. ואוסף culturing התאים הראשי
    1. לנטרל את פעילות טריפסין על-ידי הוספת אמצעי שווה של פתרון ניטרול (10 מ"ל ב פרוטוקול זה).
    2. מביצועם התאים באפידרמיס מאת pipetting הפתרון לכל אורך 20 x עם פיפטה סרולוגית 10-mL ולהעביר את הפתרון הסלולרי דרך מסננת תא 100-מיקרומטר כדי להסיר את כל פסולת רקמות שיורית.
    3. Centrifuge הפתרון תא ב x 200 גרם במשך 5 דקות לאחר סינון; resuspend בגדר תא במדיום ניטרול לרחצה, ואז, centrifuge אותו שוב ב x 200 גרם להשיג בגדר תא.
    4. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של סידן נמוכה, ללא סרום תקין בינוני (SFM). לקחת 10 µL של פתרון זה כדי לספור את המספר בתא סכום, צלחת עם 2 x 106 תאים עם 10 מ"ל של SFM לתוך תא 100-מ מ תרבות מאכלים מיוחדים עם ציפוי מטריקס (המכיל מסוג קולגן).
      הערה: ציפוי היא צעד הכרחי עבור השיטה המקובלת.
    5. לשנות את המדיום תרבות כל d 2.
      הערה: בדוק את הידבקות תאים במיקרוסקופ לפני ואחרי שינוי המדיום תרבות.
    6. המעבר את התאים כאשר הם מגיעים כ- 80% הנהרות.
      הערה: כל המנות תרבות הם מיוחדים עם המטריצה ציפוי.

3. השיטה החדשה

  1. רעלני רקמת העור
    1. לאסוף את הרקמה כמפורט לעיל (שלב 2.1) עבור השיטה המקובלת.
    2. לשטוף את רקמת העור 1 x עם 10 מ"ל ל- PBS, ואז, שוקל אותה בתוך מיכל פלסטיק סטרילית מאת מידה אלקטרוניים (המשקל הוא בסביבות 1 g בפרוטוקול זה).
      הערה: המשקל המזערי של רקמות לצורך פרוטוקול זה הוא 0.1 g, שכן הוא קשה להשיג מספר מספיק של תאים אם הדגימה רקמות בשימוש הוא קטן מדי. אין שום משקל מקסימלי של רקמה עבור פרוטוקול זה, אשר בסופו של דבר תלוי יכולת טיפול של המפעיל.
    3. להשתמש מלקחיים ולשטוף את רקמת העור עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s.
    4. דגירה הרקמה 2 x עם 10 מ"ל של כביסה לפתרון (להכין בשלב 2.1.1), 5 דקות בכל פעם.
      הערה: כל השלבים כביסה שצוין לעיל מתבצעות ב- 100-מ מ תא מנות תרבות בתוך תא למינארי (ברדס תרביות רקמה).
    5. להעביר את הרקמה תבשיל סטרילי תרבות 100-מ מ תא אחר.
    6. באמצעות להבים ומהדקים, מינצ הרקמה ביסודיות לתוך slurry רקמות.
    7. להוסיף 200 µL ל- PBS כל 5 דקות כדי לשמור על הרקמות רטוב.
      הערה: לוקח בערך 15 דקות לקבלת צעדים 3.1.5 - 3.1.7. כל הצעדים הנ ל מתבצעים בטמפרטורת החדר.
  2. העיכול של רקמת עור
    1. להעביר את פתרון הומוגני רקמה לתוך צינור 50-mL. להוסיף 10 מ של אנזים תערובת עבור כל 1 g של רקמת העור. מערבבים האנזימים ביסודיות עם הרקמות homogenized.
    2. דגירה התערובת ברעידות באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עבור 1 h.
    3. להוסיף נפח 1/5 של 0.25% טריפסין (2.5 מ ל פרוטוקול זה) לתערובת לעיכול עבור עוד 30 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
    4. להוסיף DNase אני הפתרון לתערובת האנזימים ביחס של 1: 100 (v/v) (250 µL ב פרוטוקול זה) דגירה זה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. ואוסף culturing התאים הראשי
    1. לעצור את תהליך העיכול על-ידי הוספת מ"ל של ניטרול בינוני על יחס 1:1. Pipette הפתרון למעלה ולמטה במשך 20 x, באמצעות פיפטה סרולוגית 10-mL מביצועם התאים.
    2. לסנן את התאים dissociated דרך מסננת תא 100-מיקרומטר לפנות את הפסולת רקמות. Centrifuge את תגובת שיקוע ב x 200 גרם במשך 5 דק להתבונן בגדר בתחתית הצינורית.
    3. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר תא עם 10 מ"ל של ניטרול בינוני, צנטריפוגה שוב ב x 200 גרם במשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים.
    4. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של חיסון בינוני (G-בינוני מהשלב 1.2.5) עם 10 מיקרומטר של Y-27632.
    5. קח 10 µL של הפתרון כדי לספור את המספר בתא סכום, צלחת עם 2 x 106 תאים עם 10 מ"ל של G-בינוני לתוך תבשיל תרבות תא 100-מ מ.
      הערה: השלב precoating אינו הכרחי עבור השיטה החדשה, ללא הסרה של שכבת הדרמיס נדרש גם.
    6. לאחר בתלת-ממד, החלף המדיום חיסון סידן נמוך SFM בינוני. לשנות את המדיום תרבות כל d 2.
      הערה: בדוק את הידבקות תאים לפני ואחרי שינוי המדיום.
    7. המעבר את התאים כאשר הם מגיעים כ- 80% הנהרות.
      הערה: אם יש צורך, pretreat את התאים עם 0.05% טריפסין למשך 2 דקות ולשטוף את התאים עם PBS להסרת זיהום עורי תאים לפני trypsinizing את התאים באפידרמיס.

4. תא Passaging

  1. להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS, ולהוסיף, ואז, 2 מ של טריפסין 0.05% (לפי כל מנה 100 מ מ).
  2. דגירה התאים בתוך אינקובטור (37 ° C עם 5% CO2) במשך 5 דקות.
  3. בדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לוודא כי כל התאים יש מנותקת המנה תרבות.
  4. הוסף 8 מ של DMEM עם 10% FBS כדי לנטרל את התגובה אנזימטי, ואז, לאסוף את התאים בשפופרת 15-mL.
  5. צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות כדי להשיג בגדר התא.
  6. להסיר את תגובת שיקוע לאט, לאחר מכן, resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של SFM בינוני, לספור את מספר התאים.
  7. צלחת עונה 1 פרק 10 תאים6 עם 10 מ"ל של SFM לתוך כל מנה תא 100-מ מ.
  8. לשנות את המדיום כל d 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דיאגרמות סכמטית של השיטה החדשה (איור 1 א'), השיטה המקובלת (איור 1B) מוצגים באיור1. השיטה המקובלת היא עיכול בשני שלבים, המחייב הליך יומיים. לעומת זאת, השיטה החדשה היא עיכול בשלב אחד, אשר לוקח כ- 3 שעות לביצוע. חשוב, השיטה החדשה בשלב אחד ניתן להשיג שתי האוכלוסיות (תאים באפידרמיס, עורי) בו זמנית, אשר תלויה הנוכחות של Y-27632 בטווח הבינוני חיסון. יתר על כן, הראשונית תרבות זמן של תאים אפידרמיס כדי להגיע ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בתרבית HKCs העיקרי היה להיות מנוצל באופן נרחב לטיפול פצעי במרפאות במשך יותר משלושה עשורים, מאז, זה היה תמיד חשוב ביעילות להשיג מספר מספיק של תאים עבור יישומים קליניים מבעוד. לפיכך, בפועל, השיטה המקובלת בידוד, הדורש את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, מקשה לעמוד בדרישות אלה, בשל התשואה נמוכה של התאים ואת היכולת נמוכה מעבר תאים בוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה החדש שפיתחנו להשיג ביעילות HKCs מרקמות למבוגרים המבוסס על13,הקודם דוחות14, אשר מתאים יותר הן במעבדה והן עבור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המחקר מפתח הלאומי ועל פיתוח תוכנית של סין (2017YFA0104604), התוכנית הכללית של נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (NSFC, 81772093), מדע, טכנולוגיה פיתוח תוכנית של סאזהאו (ZXL2015128), את מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20161241), ופרס של שאנדונג טאישאן מלומד (tshw201502065).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מונה סלולרי אוטומטי של הרוזנתInvitrogen Inc. C10227ספירת תאים אוטומטית 
חממת CO2תרמו מדעי51026333לדגירת תאים
Sorvall ST 16R צנטריפוגהתרמו מדעית75004380צנטריפוגה תאים
שייקר טמפרטורה קבועהשנחאי Boxun150036לאמבט מים
משקל אלקטרוניHarbin Zhonghui1171193לשקילת רקמות
צלחת תרבית תאיםEppendorf30702115לתרבית תאים
50 מ"ל צינור צנטריפוגהKIRGEN171003לצנטריפוגה תאים
מסננת תאיםקורנינג משולב431792סינון תאים
תמיסת פוספט חוצץSolarbio Life Science P1020-500תמיסת כביסה
DMEMThermo ScientificC11995500רכיב של מדיום נטרול
מוגדר K-SFMLife Technologies10785-012מדיום תרבית תאי אפידרמיס
פניצילין סטרפטומיציןThermo Scientific15140-122אנטיביוטיקה
סרום בקרעוברי תעשיות ביולוגיות04-001-1AC5רכיב מדיום נטרול
0.05% טריפסיןטכנולוגיות חיים25300-062לדיסוציאציה של HKC
0.25% טריפסין בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיהT1350-100עבור HKC דיסוציאציה
ציפוי מטריקס ערכתחיים טכנולוגיותR-011-Kלציפוי מטריצת
DispaseGibco17105-041לבידוד HKC
קולגנאז סוג ILife Technologies17100-017לבידוד HKC
Deoxyribonuclease ISigma9003-98-9לבידוד HKC
F12 תערובת נוטריאנטים, HamsLife Technologies31765035רכיב של תוסף G-medium
B27Life Technologies17504044גורם גדילה ב-G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595גורם גדילה ב-G-medium
Y-27632מעכב Sigma-AldrichY0503ROCK
FungizoneGibco15290026הכנה
לחלבון אנושי רקומביננטי G-medium EGFGibcoPHG0311גורם גדילה בערכת
ספירת תאים G-medium -8Thermo ScientificNC9864731מבחני התפשטות תאים וציטוטוקסיות
עכבר אנטי-אנושי ציטוקרטין5חברת פיתוח Hewlett-PackardMA-20142לצביעה אימונופלואורסצנטית לבדיקת סמן התמיינות של HKCs
ארנב אנטי-אנושי LoricrinCovancePRB-145pלצביעה אימונופלואורסצנטית לבדיקת סמן התמיינות של HKCs
טכנולוגיית איתות תאיוימנטין אנטי-אנושיים של עכבר3390לצביעה אימונופלואורסצנטית של פיברובלסטים עוריים
אינטגרין ואלפא; 6(GOH3)סנטה קרוז SC-19622ניתוח ציטומטריית זרימה של HKCs
עכברוש IgG2a FITCסנטה קרוז SC-2831נוגדן בקרה שלילי של &אלפא; 6-אינטגרין  בניתוח ציטומטריית זרימה 

מקורות

  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).
  3. Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
  4. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
  5. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).
  6. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  7. Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
  8. Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
  9. Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
  10. Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
  11. Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  12. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
  15. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
  16. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
  17. Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
  18. Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד רקמת עורעיכול אנזימטימעכב ROCK Y-27632תאי פרוגניטור אפידרמלייםהרחבת תרבית תאיםאנליזה של סמן K5דיפרנציאציה של לוריקרין (Loricrin)בדיקת זיהום וימנטין (Vimentin)שטיפה במצע ניטרול
שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.