מאמר שיטה

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

DOI:

10.3791/57785

⸱

26 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת העבודה פרפין חלוקתה ולא counterstaining. . זה הליך קלה ומהירה כדי לפקח על ביטוי גנים במהלך פיתוח שניתן להחילם גם על מקטעים של רקמות, איברים או תאים בתרבית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגן Escherichia coli LacZ , קידוד β-galactosidase, משמש בעיקר כתב של ביטוי גנים וכן מכשיר מעקב במחקרים שושלת היוחסין התא. התגובה פתולוגיה הקלאסית מבוססת על הידרוליזה של המצע X-גל בשילוב עם יונים ferrous ו ferric, המייצרת לא מסיסים התמיסה כחול קל לדמיין. לכן, β-galactosidase פעילות משמשת כסמן את דפוס ביטוי של הגן עניין בפיתוח מתקדם. כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת עוקבות עבור פרפין חלוקתה ולא counterstaining. בנוסף, הליך שהבהרת כל העוברים מסופק משופרת של X-גל צביעת אזורים עמוקים יותר של העובר. תוצאות עקביות מתקבלים על ידי ביצוע הליך זה, למרות אופטימיזציה של תנאי ריאקציה יש צורך למזער את פעילות ברקע. מגבלות וזמינותו גם להתייחס, במיוחד לגבי הגודל של העובר מכתים כל הר. פרוטוקול שלנו מספק רגיש, שיטה אמינה לגילוי β-galactosidase במהלך פיתוח העכבר שניתן להחיל עוד סעיפים cryostat, כמו גם כל האיברים. לפיכך, דפוסי ביטוי גנים דינמי במהלך הפיתוח ניתן לנתח בקלות על-ידי שימוש בפרוטוקול זה כל העוברים, אך גם ביטוי מפורט ברמה התאית יכול להידרש לאחר חלוקתה פרפין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לתאר דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, השימוש של הכתב גנים כסמני כבר ביותר מדרוזופילה . יונקים. בניסויים המערבים הטרנסגניים ובעלי נוקאאוט, הגן β-galactosidase חיידקי (LacZ) של Escherichia coli (e. coli) הוא אחד בשימוש נרחב ביותר1,2,3, 4. β-galactosidase (β-גל) ה מזרז הידרוליזה של β-galactosides (כגון לקטוז) לתוך שלו monosaccharides (גלוקוז, גלקטוז)5. המצע הנפוץ ביותר שלה הוא X-גל (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), גליקוזיד זה hydrolyzed מאת β-galactosidase והוליד 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole וגלקטוז. הראשון הוא מחומצן לתוך דיימר, בעת שימוש בשילוב עם אשלגן פרי-פרו-ציאניד, מייצרת של מאפיין לא מסיס, צבע כחול לזרז (איור 1)6.

הגן LacZ התחיל לשמש גן כתב לפני למעלה משלושים שנה7,8. בדרך כלל, מוכנס LacZ במורד הזרם של יזם אנדוגני במקום מסגרת קריאה פתוחה, אז זה יכול לשמש בתרבות בקטריאלי ותא להמחיש תאים המכילים של הוספה מסוים, כמו גם בבעלי חיים הטרנסגניים מכשיר מעקב של אנדוגני ג'ין תבניות ביטוי במהלך פיתוח9. בהקשר זה, החזיית β-galactosidase פעילות יש נעשה שימוש נרחב דרוזופילה להבין את התהליכים התפתחותית וסלולריות של תאים בודדים כל רקמות. דרוזופילה גנטיקה טובה הדור של קווים יציב שבו בונה P-אלמנט שונה המכיל את גן מדווח ש-lacz הוא מוכנס באופן אקראי מיקומים הגנום. לכן, כאשר מניחים תחת השפעת משפר אלמנטים זה ייתכן להסיע הביטוי שלה בצורה רקמות ספציפיות, אשר איפשר ניתוח שיטתי של דפוסי ביטוי של גנים רבים במהלך שני העשורים האחרונים10. בנוסף, השימוש של העכברים הטרנסגניים כדי לפקח על ביטוי גנים LacZ גם מאפשר זיהוי של גן אירועים רקומבינציה לפי Cre-loxP מתווכת רקומבינציה, לוקליזציה של נגזרות מוטציה בתאי גזע עובריים בניתוח chimeric 11, אשר מקלה על השליטה של LacZ ביטוי ברקמות ספציפיות כמו גם חנותם. כמו כן, בתוך כל העוברים, זיהוי של הפעילות β-galactosidase עשויה לייצר דיפרנציאלית מוכתמים דפוסי בעוצמות שונות, זה יכול להיות שנצפו בנוחות על פני שלבים התפתחותיים שונים כדי לנתח טמפורלית שינויים בביטוי הגנים 8,12.

במאמר זה, נציג פרוטוקול להמחיש ביטוי גנים דרך X-גל מכתים ברקמה הר שלם בשלבים התפתחותיים מוקדם של העכבר עוברי. אנו מציגים בשיטה זו פתולוגיה כמו טכניקה מאוד רגיש וזולה טובות איתור מדויק של התאים עם תוויות דגימות הר שלם או ברמה התאית לאחר פרפין מוטבע רקמות או עוברי. השיטה מאפשרת פריט חזותי ישיר מכתים ברקמה עכבר עם הרקע המינימלי כאשר לעומת שיטות אחרות13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares), את Autónoma קומונידד דה מדריד כדי להבטיח סבלם מינימלי של בעלי החיים.

1. אוסף של העוברים מן העכברים בהריון (מ E8.5 ל E12.5)

  1. להקריב עכברים בהריון מאת נקע בצוואר הרחם או שאיפת2 CO. ביום הראשון שנצפה הכנס הנרתיק נחשב מתחלקים היום 0.5 (E0.5).
  2. להניח את החיה במצב פרקדן על משטח סופג, לנקות את העור בבטן של העכבר עם 70% אתנול.
    הערה: עקרות לא נדרש בשלבים הבאים.
  3. לצבוט והרם בעור בטן בעזרת העכבר-שן מלקחיים.
  4. לעשות חתך דרך העור לבין קיר הבטן, 2-4 ס מ אנכית לאורך הקו האמצעי של הבטן בעזרת מספריים כירורגיים.
  5. לחשוף את הבטן ולהסיר את הקרניים הרחם מהצד של האמא עם מלקחיים חיתוך כלי הדם לאורך העקמומיות הפנימית של הרחם עם מספריים כירורגיים.
  6. הסר את המחרוזת של העוברים, להעביר אותו צלחת פטרי על קרח המכילה 10 מ"ל כקרח 0.01 M פוספט מאגר מלוחים pH 7.4 (PBS).
  7. בזהירות לנתח את העוברים החוצה מן הרחם תחת stereomicroscope בצלחת פטרי עם PBS קר כקרח טריים 10 מ"ל. לתפוס את הקיר שריר עם מלקחיים השענים לחשוף השפרה ולאחר מכן לקרוע את קרום מי השפיר כדי להסיר את העובר סגורים ולא שק החלמון באמצעות קצות המלקחיים.
  8. לאסוף את העוברים littermate עכברים בהריון בשלבים המוקדמים (מ E8.5 ל E12.5) (איור 2).
  9. להעביר את העוברים מאכל טריים עם PBS קר 1 x 10 מ"ל באמצעות מלקחיים מעוקל או, העוברים קטן מאוד (E8.5-E9.5), להשתמש פיפטות פלסטיק העברה כדי לאסוף דגימות ללא נזק העובר.
  10. לפני שמתחילים את הקיבעון, לקחת דוגמה עובריים צינור microcentrifuge עבור genotyping על ידי חיתוך חתיכה קטנה של העובר או לקיחת קרום מי השפיר העוברים הקטן ביותר (מ E8.5 ל E9.5) עם מלקחיים השענים.
    הערה: LacZ genotyping נקבעת על-ידי תחל (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז: קדימה, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; הפוך, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. קיבוע של העכבר עוברי

  1. העברת כל העובר לתוך צינור microcentrifuge 2 מ עם בסיס עגול המכיל PBS 1 x 1 מ"ל.
    הערה: בצע את כל השלבים בפרוטוקול תוך הצינורות האלה עם עצבנות בעזרת מטרף מתגלגל.
  2. לשטוף את העוברים ב- PBS 1 x על 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסל את הדם הנותרים. שימוש פיפטות פלסטיק העברה להחליף נוזלים בתוך הצינורות.
  3. לתקן את העובר 1 מ"ל של 0.125% גלוטראלדהיד על קרח.
    הערה: הזמן של קיבעון תלוי בגודל של העובר: 20 דקות עבור E8.5-E9.5 עוברי, 30 דקות עבור עוברי E10.5 ו- h 1 עבור עוברי E12.5.
  4. הסרת מקבע את ולשטוף את העוברים ב- PBS 1 x פעמיים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני עיבוד הדגימה עבור X-גל מכתים.

3. כל הר β-galactosidase להסטולוגיה של העוברים העכבר

  1. הכן X-גל שטיפה מאגר והפתרון X-גל מכתים לפני תחילת ההליך (ראה טבלה 1 ו לטבלה של חומרים). השתמש עוברי littermate (WT) פראי-סוג כפקדי שלילי עבור התגובה אנזימטיות.
  2. דגירה העוברים במאגר שטיפה X-גל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2).
  3. דגירה העוברים בפתרון מכתים X-גל מ- 2 h ללון ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. לנטר את תגובת צבע מעת לעת באמצעות מיקרוסקופ ויבתר עד בעוצמה מספקת של צביעת התכלת נצפית ללא הרקע של העובר. שמור את ה-pH של התמיסה בין 8 ל- 9 כדי להפחית את הרקע במהלך כל מוכתמים. אם הפתרון מכתימים מתחילה לכבות אור, להחליף אותו מצע טרי פתרון כדי להרחיב את התגובה אנזימטיות.
  4. לעצור את התגובה כאשר האות הרצויה מושגת על ידי שטיפת העוברים בצינור microcentrifuge תסיים 1 x 1 מ"ל פעמיים במשך 10 דקות כל בטמפרטורת החדר.
  5. להעביר עוברי מוכתמים paraformaldehyde 4% 1 מ"ל (PFA) לתקן אותם, מחדש עבור h 1 ללון ב 4 º C.
    הערה: עוברי שניתן לאחסן ב 4% מחברים/PBS לזמנים ארוכים ב 4 ° C או יכול להיות מעובד באופן מיידי על חלוקתה. שלב קיבוע סופי זה מכריע של שימור לטווח ארוך של התבנית מוכתמים.
  6. לשטוף את העוברים ב- PBS 1 x 1 מ"ל פעמיים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. אפשרות 1: ברור העוברים על ידי טבילה בסדרה של פתרונות עם הגדלת ריכוזים של גליצרול (גליצרול 20%, 40%, 60% ו- 80% ב- 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר כל פתרון.
    הערה: לשטוף את העוברים גליצרול 80% משכי זמן ארוכים יותר, אפילו ימים, עד הם נמחקים ולאחר מכן לאחסן אותם גליצרול 80% ב 4 ° C בשלב זה (איור 2). הוספת כמות קטנה מאוד של קריסטל אורה אזיד הנתרן של תימול העוברים המאוחסנים ב 4 ° C גליצרול או 1 x PBS מומלץ כדי למנוע צמיחה של עובש. לאחר ניקוי, הר שלמה עוברי יכול לשמש עבור צילום (שלב 4).
  8. אפשרות 2: העוברים תהליך של פרפין הטבעה ואת חלוקתה באמצעות של מיקרוטום (איור 2). במסמך התבנית הביטוי בתוך מוכתם כל העוברים לפני חלוקתה (שלבים 4 ו- 5).

4. צילום של כל העוברים הר

  1. כדי לצלם כל הר צבעונית העוברים לפני חלוקתה, להעביר אותם ל צלחת פטרי מוכן עם בסיס של פני השטח למוצק agarose 1-2% ב- PBS 1 x
  2. מכסים את העובר לחלוטין עם PBS 1 x 10 מ"ל בכלים מצופים agarose כדי למנוע התייבשות השתקפות במהלך הצילום דרך הנוזל.
  3. להתמצא העובר שקוע PBS x 1 באמצעות מלקחיים. עבור מבוגרים העוברים (E10.5-E12.5), לעשות בו חור קטן agarose עם מלקחיים כדי למקם ומקם את הדגימה בתוכו בזוויות שונות וכדי למנוע את לתרשים במשך הצילום.
  4. מקם את המנה על הבמה stereomicroscope, באמצעות האור המשודר (תת שלב). שינוי בין 'כהה-שדה' התאמות 'בהיר-שדה' כדי להגדיר את התאורה הרצויה במשך הצילום וכדי לייעל את המוגבהת המדגם.
    הערה: השתמש סיבים אופטיים תאורה עבור עוברי בשלב מאוחר יותר כדי למנוע השתקפות על פני השטח של העובר. כאשר מצלמים עוברי שנוקה, בצע את ההליך אבל להעביר אותם ל צלחת פטרי המכילות 100% גליצרול, מלא לטבול אותם.

5. פרפין הטבעה ואת חלוקתה של X-גל צבעונית עוברי

  1. פרפין הטבעה
    1. להסיר את X-גל צבעונית העוברים מ 4 ° C (שלב 3.5) ולשטוף אותם עם PBS 1 x 1 מ ל שלוש פעמים כדי למנוע עודף של מקבע.
    2. להעביר את העובר כל קלטת היסטולוגיה באמצעות מלקחיים.
    3. למקם את הקלטות המכיל את העוברים בתוך, ואז מייבשים על ידי הכנסתם סדרה מדורגת אתנול בטמפרטורת החדר: 70% אתנול, פעם אחת במשך 30 דקות; 96% אתנול, פעמיים במשך 30 דקות כל; 100% אתנול, פעמיים במשך 30 דקות כל אחד.
      הערה: עוברי יכול להיות מאוחסן אתנול 70% למשך זמן בלתי ידוע ב 4 ° C עד התחלת תהליך התייבשות.
    4. דגירה בקלטת כל ב אלכוהול איזופרופיל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. באמצעות מלקחיים, העברת הקלטות לכוס מכתים שוקת המכיל אלכוהול איזופרופיל ומחוממת מראש ולהשאיר בתנור ב 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    6. למקם את הקלטות כוס חדשה מכתים שוקת המכיל תערובת של 50% אלכוהול איזופרופיל / 50% נמס פרפין ולהשאיר במשך 4 שעות בתנור 60 ° C.
    7. דגירה הקלטות עם העוברים עם שני שינויים של פרפין מותכת, 30 דקות ב 60 ° C לכל.
    8. בסוף לשטוף את הפרפין הסופי, פתח את הקלטת, להעביר את העובר בכל רקמה נפרדת הטבעה עובש כדי להציג את הדגימה תחת stereomicroscope.
    9. למלא את הבאר פרפין שעווה מותכת ב 60 מעלות צלזיוס. להשתמש מלקחיים מחומם כדי לשמור את השעווה מותכת בקפידה להתמצא העובר העובש.
      הערה: הכיוון הנכון של המדגם הוא שלב קריטי עבור חלוקתה העובר במישור הרצוי.
    10. לפני פרפין בגרגירים כייר, מקום קלטת ללא המכסה על גג הבניין, למלא אותו פרפין שעווה מותכת. ומצננים את הנותרים שעווה עד פני השטח למוצק ללילה בטמפרטורת החדר.
    11. ברגע הפרפין הוא לחלוטין פני השטח למוצק, להסיר את גוש מוצק כייר ו לאחסן בלוקים פרפין או בטמפרטורת החדר או ב 4 ° C עד חלוקתה14.
  2. פרפין חלוקתה
    1. אוריינט הלהב על האזמל הקטן ולהגדיר 5-7 מיקרומטר של עובי. 5.2.2. מגניב לבלוק פראפין על הקרח, לקצץ אותו לייצר קובייה או פירמידה.
    2. לצרף את הבלוק בעל מיקרוטום באמצעות כמות קטנה של שעווה מותכת.
    3. אוריינט הרחוב לחיתוך אופטימלית. בסעיף הבלוקים פרפין 5-7 מיקרומטר פרוסות עבות בטמפרטורת החדר באמצעות מיקרוטום סטנדרטי.
    4. שימוש במכחול בסדר, הניחו הסעיפים באמבט מים בטמפרטורת החדר במשך מניפולציה ובחירה פרוסות.
    5. לאסוף את המקטעים מהאמבטיה מים עם מגלשת מיקרוסקופ, להעביר אותם לתוך אמבט מים ב 42 ° C עבור מתיחה.
    6. להסיר מקטעים תנורים ומניחים בעדינות על גבי שקופיות מיקרוסקופ אדהזיה.
    7. יבש את השקופיות היטב בתנור ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר הסעיפים לדבוק לחלוטין, אחרת, הם עשויים להגיע לאיבוד במהלך צביעה.
      הערה: לאחסן את השקופיות ב 4 ° C עד לתחילת מכתים הליכים.
  3. Deparaffinization, Counterstaining סעיפים פרפין X-גל-צבעונית
    1. לשים את השקופיות על מגש שקופיות מיקרוסקופ בתנור ב 60 מעלות צלזיוס למשך לפחות 45 דקות להפוך פרפין יותר נוזלים.
    2. להעביר את השקופיות על מתלה ולהשתמש זכוכית מכתים מנות כדי לבצע את השלבים הבאים: להטביע את המדף בצנצנות מכתימים המכיל כהלים של הפחתת ריכוזים הסרה מלאה פרפין, הידרציה של הרקמות: אלכוהול איזופרופיל למשך 5 דקות- 60 ° C; אלכוהול איזופרופיל למשך 3 דקות; 100% אתנול למשך 2 דקות; אתנול 96% עבור 1 דקות; אתנול 70% עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף ובסעיף מים מזוקקים פעמיים כדי לוודא כי קיימים ללא שאריות אלכוהול.
    4. Counterstain מקטעים עם כתם (למשל פתרון גרעיני-Fast אדום) במשך 5 דקות (בדרך כלל בין 3-8 דקות) בטמפרטורת החדר (איור 2).
      הערה: זה מכתים מסייע לחשוף את המבנה הכללי של רקמות בסעיפים.
    5. לאחר צביעת, לשטוף את השקופיות במים מזוקקים למשך 1 דקות, עיין בסעיף מכתים במיקרוסקופ.
      הערה: אם ההכתמה הרצוי הוא חלש מדי, counterstain סעיפים שוב למשך זמן ארוך יותר.
    6. מייבשים מקטעים בסדרות הבאות עם הגדלת ריכוזי אתנול: מנקי שני אתנול 95% למשך 2 דקות כל אחד, שניים שוטף אתנול 100% למשך 2 דקות, ו, כדי להימנע המסת הכחול צבע ארגונייט שוקע, אחת מהירה לרחוץ קסילן.
    7. הסר את השקופיות מהמדף אחד ומניחים אותם על נייר. אז הר, coverslip להחליק בעזרת אמצעי הרכבה סינתטי, קבע.
      הערה: קסילן הוא מוצר דליק האדים של מי אתה מעצבן ואינם מזיקים לבריאות האדם, לאורגניזמים מימיים. הוא צריך להשפיע בתוך ברדס, מחייב שימוש ציוד מגן מתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנה אנחנו מראים תוצאות החלת הפרוטוקול הסטנדרטי עבור התגובה פתולוגיה β-galactosidase באמצעות X-גל כמו המצע ב עכבר כל העוברים (איור 1 ואיור 2). באמצעות פרוטוקול זה, נבחן ממברנה סוג 4-מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (Mt4-mmp) ביטוי שלבים התפתחותיים עובריים שונים (E9.5, E11.5 ו E12.5) שימוש בעכברים המוטנטים Mt4-mmp המבטאים הכתב LacZ תחת השליטה של אנדוגני Mt4-mmp יזם (איור 3 איור 4, <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגן LacZ e. coli כבר בשימוש נרחב בשל רגישות גבוהה קלות לזיהוי ככתב במחקרים דפוסי ביטוי גנים. בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה קלאסית לגילוי β-גל ביטוי בהתאם לתגובה אנזימטי זה קל ומהיר לביצוע כמו גם זול. בשיטה זו ניתן ליישם גם בלי שינויים הר כל העוברים, איברים שלמים, מקטעי רקמת cryostat או תאים בתרבית.

יישום מדויק של שיטה זו גורמת interpretable ועמיד מכתים. עם זאת, פקדים בו זמנית, והשלבים מאשרות מומלץ מאוד. בהקשר זה, בפרוטוקול הנוכחי מתבצע במקביל עוברי littermate פראי סוג להשתמש כפקדים שלילי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם שום עניין פיננסי מתחרות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות השירות Histopathological לסיוע טכני שלהם ב- Cardiovasculares סנטרו נאסיונאל דה Investigaciones (CNIC). אנו מודים גם ד ר Seiki מוטוהארא עבור עכברים Mt4-mmpLacZ מתן בחביבות, ד ר אליסיה ג'י ארויו עבור תמיכה הפרויקט שלנו ועבור שלה קריאה ביקורתית של כתב היד. אנחנו רוצים להודות פיטר בוני להגהת מאמר זה. עבודה זו נתמך על ידי אוניברסיטת Europea דה מדריד באמצעות מענק (# 2017UEM01) הוענק C.S.C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
2-פרופנולSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgaroseSCHARLAU50004/ LE3Q2014
מדיום הרכבה מימיVECTOR LABSH-5501
אמצעי הרכבה סינתטייםMERCK100579
96% אתנולPROLABO
99.9% אתנול אבסולוטSCHARLAUET00021000
50% תמיסת גלוטרלדהידSIGMA-ALDRICHG6403-100 מ"ל
85% גליצרולMERCK104094
99.9% גליצרולSIGMA-ALDRICHG5516
מגנזיום כלוריד הקסהידרטSIGMA-ALDRICH63064
חומר פעילי שטח לא יוני (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
כתם נגד אדום מהיר גרעיניSIGMA-ALDRICHN3020
פסטילי פרפיןMERCK111609
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICH158127-500 גרם
תמיסת מלח חוצצת פוספט (טבליות)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
אשלגן פרוציאנטMERCK1049840500
אשלגן פרוציאנידMERCK1049731000
נתרן אזידSIGMA-ALDRICHS8032
נתרן דאוקסיכולטSIGMA-ALDRICH30970
נתרן דימימן פוספט מונוהידרטSIGMA-ALDRICH106346
נתרן פוספט די-בסיסי דיהידראטSIGMA-ALDRICH71638
תימולSIGMA-ALDRICHT0501
Tris hydrochloride (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
XyleneVWR CHEMICALSVWRC28973.363
<חזק>ציוד
תבניות פלסטיק חד פעמיות 15x15x5 מ"מSAKURA4566
מיקרוטום סיבוביLeicaRM2235
קלטותאוקספורד סחרOT-10-9046
משקפי כיסוי מיקרוסקופ 24x60 מ"מVWRECN631-1575
שקופיות מיקרוסקופתרמו מדעי, MENZEL-GL Ä SERAGAA000001#12E
שקופיות מיקרוסקופ הידבקותThermo Scientific, MENZEL-GL Ä SERJ1820AMNZ
ציפה אמבט מיםLeicaHI1210
חד פעמי בעל פרופיל נמוך להבי מיקרוטוםנוצהUDM-R35
תנור פרפיןJ.R. SELECTA
מתקן פרפין שעווהJ.R. SELECTA
סטריאומיקרוסקופLeicaDM500
צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן 2.0 מ"לסיגמא-אולדריץ'T2795
צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 מ"לסיגמא-אולדריץ'T9661
שייקר אורביטליIKA LabortechnikHS250 BASIC
ערבוב פלטה חמהביביHB502
שייקר מערבולתIKA LabortechnikMS1
סולם מעבדהGRAMFH-2000
בקנה מידה מדויקSartoriusISO9001
pHmeterCrisonBasic 20
סיבים אופטייםOptechPL2000
20824365 2000205 4000490

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182(1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767(2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797(2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937(2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Beta galactosidase DetectionX gal StainingMouse Embryo AnalysisParaffin SectioningHistochemical AssayGene Expression TracingWhole Mount StainingCell Lineage StudiesEmbryo ClarificationDevelopmental Biology

מאמרים קשורים