Method Article

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של RNAs noncoding קטן המווסתים ביטוי גנים הסלולר post-transcriptionally. איגוד MiRNAs לאזור 3' לא מתורגם (UTR) של יעד ה-mRNA לעכב תרגום חלבונים או במקרים מסוימים לגרום השפלה mRNA. הכריכה של miRNA 3' UTR המטרה ש-mrna מתווך על ידי רצף 2 – 8 זרעים נוקלאוטיד בקצה 5' של miRNA. בעוד תפקיד miRNAs כמו מולקולות התאית התקינה וותיקה, זיהוי של mRNAs המטרה עם רלוונטיות פונקציונלי נשאר אתגר. יש כבר מועסקים Bioinformatic כלים לחזות רצפים בטווח 3' UTR של mRNAs בתור מטרות פוטנציאליות עבור איגוד miRNA. כלים אלה יש גם מנוצל כדי לקבוע שימור כזה רצפים בין מינים קרובים אבולוציונית בניסיון לחזות את תפקיד פונקציונלי. אולם, שיטות אלה לעיתים קרובות להפיק תוצאות חיוביות שגויות, מוגבלות לחיזוי הקנוני האינטראקציה בין miRNA ל- mRNA. לכן, הטיפול. הניסיוני המודדים איגוד ישירה של miRNA למטרה mRNA שלו נחוצים ליצור אינטראקציה פונקציונלית. בדו ח זה, אנו מתארים שיטה רגיש עבור אימות באינטראקציה ישירה בין הסלולר miRNA של מיר-125b את 3' UTR של PARP-1 mRNA. אנו נרחיב על פרוטוקול שבו מחקה biotinylated סינתטי-miRNA היו transfected בתרבית של תאים, למתחם miRNA-mRNA הסלולר lysate היה משוך כלפי מטה עם מצופים streptavidin beads מגנטי. בסופו של דבר, המטרה ש-mrna של חומצות גרעין למטה הוציא מורכבים הייתה לכמת באמצעות אסטרטגיה מבוסס qPCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו Rna (miRNAs) הם קטנים ללא קידוד RNAs המווסתים ביטוי חלבון1באופן שלילי. סימנים מקדימים של miRNA לשכון אשכולות דרך אזורים רבים של הגנום, בתדירות הגבוהה ביותר בתוך אזורים intergenic, אינטרונים של חלבונים גנים2,3. להן של miRNAs לערב שעתוק של פרי-miRNAs מ קידוד miRNA גנים4. פרי-miRNAs עוברים עיבוד סדרתי, תחילה בגרעין ואז בציטופלסמה כדי ליצור יחידה miRNAs בוגרת נטושים4,5. לאחר מכן, בוגרת miRNAs משולבים המתחם שתיקה RNA-induced (RISC): קומפלקס חלבונים-RNA multimeric הכולל חבר של משפחת Argonaute של חלבונים היעד זיהוי4,5, 6,7. בוגרת miRNAs ב- RISC מורכבות בעיקר לאגד 3' UTR של היעד mRNAs8,9,10 אבל יכול גם לאגד מדי פעם את הקוד ובאזור 5' UTR של mRNA10,11 . הכריכה של miRNA ל mRNA רצף תוצאות translational שתיקה12,13,14 וכמה תיקים mRNA הקשורה15. מאז miRNA יחיד יכול למקד mRNAs רבים, מולקולות אלה רגולטוריות מעורב כמעט בכל תהליך הסלולר, היו מעורבים שונים המחלה התנאים16,17,18.

ההבנה מפורט כיצד miRNAs להסדיר מסלולים סלולריים דורש זיהוי של mRNAs המטרה. פלטפורמות מרובות ביואינפורמטיקה זמינים לחזות miRNA:mRNA בשם אינטראקציות19,20. תחזיות אלה מסתמכים על ווטסון-קריק הבסיס זיווג מושלם בין 2-8 נוקלאוטיד זרע רצף miRNA רצף משלים בתוך ה mRNA היעד4,21. בנוסף, כלים אלה ליצור מבנה שניוני של דופלקס miRNA:mRNA, חישוב הפרמטרים התרמודינמית של אינטראקציה מולקולרית זו ולהראות שימור האתרים מחייב על פני מינים לשיפור פונקציונלי הרלוונטיות של המטרה חיזוי. למרבה הצער, כלים אלה יש גם המגבלה של חיזוי מטרות חיובי כוזב בקצב מאוד גבוה (~ 27 – 70%)15,22. והכי חשוב, פלטפורמות אלה סיליקו להיכשל לזהות את האינטראקציות קאנונית של miRNAs עם המטרות שלהם23. לכן, כזה הניתוחים חזוי משולבים לעתים קרובות עם שיטות נסיוניות כדי לאמת את המטרות באופן פונקציונלי.

גישות רבות פותחו לאימות השפעול האינטראקציה miRNA:mRNA. ניסויים גנטיים באמצעות miRNA מחקה, ספוגים, מעכבי שמשנות את רמות miRNAs בתא לספק רמזים על השפעתו הרגולציה על היעד גנים ביטוי24,25,26. בנוסף, כתב המבוסס על מבחני דרך שיתוף תרביות תאים של שיבוט המכיל 3' UTR האזור של mRNA, miRNA מחקה היעד או מעכבי לתוך תאים לספק הוכחה של פונקציית רגולציה של miRNAs26. בעוד ששיטות אלה חיוני ללמוד post-transcriptional בקרת גנים מאת miRNAs, תרביות תאים pleotropic ויעילות תופעות של שינויים ברמות miRNA הסלולר הן מגבלות הגדולות של אלה גישות גנטיות23, 26. לכן, שיטות ביוכימיות משלימים בדיקה האינטראקציה הישירה בין miRNA לבין המטרה שלו הם מועסקים כדי להבין טוב יותר את תפקוד miRNAs הסלולר.

אחת השיטות בשימוש נרחב כדי ללמוד את האינטראקציה הישירה בין miRNA לבין המטרה שלו היא immunoprecipitation של מורכבות RISC ואחריו את הגילוי של mRNA היעד בתוך מתחם27,28,29,30 . לאחרונה, שיטה משופרת של מלכודת RISC היה מנוצל גם לזהות מטרות miRNA; זה זוגות ייצוב של יעדים בתוך intermediates RISC-miRNA-mRNA בטהרה של mRNA מטרות. עם זאת, אלה methodsface האתגרים הכרוכים שאינם ספציפיים אינטראקציות בין חלבונים RNA ו- RNA-איגוד אשר מובדלים בדרך כלל על ידי תאים סלולריים31,32. בנוסף, מבחני אלה תלויות הנוכחות של חלבון AGO2 עבור immunoprecipitation של קומפלקס RISC33. בהתחשב בכך AGO2 אינה argonaute רק לתווך אינטראקציות miRNA:mRNA יעיל, אי-הכללה של אחרים argonautes עלול להוביל מוטה תוצאות34. לכן, אסטרטגיות אלטרנטיביות נדרשים ללמוד איגוד ישירה של miRNA ל mRNA.

בדו ח זה, אנו נרחיב על גישה חד-שלבית דורשים בדיקה האינטראקציה הישירה בין miRNA המטרה שלו mRNA. ראשית, 3' מחקה miRNA חומצת גרעין (מגבר קדם) של biotinylated נעול הם transfected בתרבית של תאים. לאחר מכן, miRNA:mRNA מתחם הסלולר lysate נתפס באמצעות beads מגנטי streptavidin מצופה. המטרה mRNA המאוגד שלו miRNA משלימים זה לכמת באמצעות qPCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרביות תאים של miRNA 3'-biotinylated

הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך תא סטרילי למינארי.

  1. זרע 4 x 105–5 x 105 HEK-293T תאים לכל טוב ב- 2 מ של השלם של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) [DMEM בתוספת 10% סרום עוברית שור (FBS) ו- 1 x עט-דלקת אנטיביוטיקה]. התרבות התאים בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בן לילה.
  2. למחרת, בדוק את הבריאות ואת דבקותה של התאים מצופה תחת מיקרוסקופ אור.
    הערה: ודא כי התאים יש דבקה, השיגו מורפולוגיה המתאים לפני שתמשיך לשלב הבא. התאים HEK-293T הם בדרך כלל מוכן תרביות תאים 18 – 24 h פוסט ציפוי.
  3. צינור microfuge mL 1.7 סטרילי, לדלל 75 picomoles של biotinylated miRNA ב µL 200 אמצעי חיוני מינימלי. להעביר את המיקס הזה עוד 1.7 מ ל microfuge שפופרת המכילה ליפוזום המבוססת על תקנים ריאגנט (8 µL טוב) מעורבבת עם µL 200 אמצעי חיוני מינימלי. לערבב היטב, אבל בעדינות, על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 20 – 25 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר היווצרות מתחמי תרביות תאים.
  4. להסיר את המדיה הישנה מהצלחת 6 תרבות היטב על-ידי pipetting עדין, לחדש בכל טוב עם 1.6 מ ל שזה עתה הוכנו DMEM מלאה (ללא 1 x עט-דלקת אנטיביוטיקה).
  5. הוסף את מתחמי תרביות תאים (1.3) drop-wise תאים בצלחת 6-ובכן באמצעות פיפטה המכויל היטב. מערבולת את הצלחת בעדינות תוך הוספת את מתחמי כדי להבטיח התפלגות אחידה שלהם על פני הלוח.
    הערה: שלב זה הוא קריטי מאוד להשגת יעילות גבוהה תקנים ואני חייב להתבצע עם טיפול וסבלנות.
  6. התרבות התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפחות 36 שעות.

2. הכנת Streptavidin מצופה Beads מגנטי – אני

  1. Resuspend beads מגנטי את streptavidin באופן יסודי על-ידי vortexing. להעביר 30 µL של חרוז השעיה (לכל דגימה) צינור ללא נוקלאז microfuge 2 מ"ל.
  2. מקם את הצינור המכיל את המתלים חרוז על הדוכן מפריד חרוז מגנטי ("מגנט" להלן) למשך 2 דקות. אחרי שתוודא כי החרוזים נמשכים לצד של הצינור בקשר עם המגנט, הסר בזהירות את תגובת שיקוע באמצעות של micropipette.
  3. להוסיף 100 µL חרוז שטיפת מאגר (10 מ מ טריס-Cl pH 7.5, 0.5 מ מ EDTA, 1 M NaCl) החרוזים. הסר את הצינור המגנט. מערבולת 15 s בטמפרטורת החדר לשטוף את החרוזים.
  4. למקם את שפופרת המכילה חרוזים על המגנט למשך 2 דקות, בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע.
  5. חזור על שלבים 2.3 ו- 2.4 עבור סכום כולל של שלושה שוטף. לאחר השלב הסופי לשטוף, הסר את הצינור המגנט.
  6. להוסיף 100 µL של RNase פינוי פתרון (0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl) את החרוזים, מערבבים היטב בעזרת vortexing 15 s, ואת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק למקם את שפופרת המכילה חרוזים על המגנט למשך 2 דקות, ו בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
  7. חזור על שלב 2.6 עבור סכום כולל של שלוש פעמים.
  8. להוסיף החרוזים, מערבולת 15 s, חרוז resuspension פתרון (0.5 M NaCl), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק למקם את החרוזים resuspended על המגנט למשך 2 דקות, הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
  9. להוסיף 200 µL חרוז חסימת פתרון (1 µg/µL BSA, µg 2/שמרים tRNA µL) החרוזים. מיקס על ידי עדינה vortexing 15 s בטמפרטורת החדר. דגירה ב 4 ° C עבור 16 h (לילה יתר) ב rotator שפופרת מרובה.

3. הכנת תא Lysates

  1. הקציר התאים transfected HEK-293T על ידי גירוד עדין באמצעות המגרד של תא סטרילי בתוך המנוע למינריות ולאחר מכן להעביר כל מדגם לתוך צינור microfuge mL 2 סטרילי.
  2. גלולה התאים שרוטים על ידי צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 5 דק Resuspend בגדר 1 x סטרילי PBS (פוספט מאגר מלוחים), pH 7.2. צנטריפוגה שוב ב x 1,500 גרם במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה ללא מדיה שיורית. מיד מזנקת הצינור המכיל צניפה לתוך הקרח.
  3. הכנת מאגר פירוק התא שלם טרי (150 מ מ NaCl, 25 מ מ טריס-קלרנית, pH-7.5, 5 מ מ. DTT, 0.5% IGEPAL, Superase U/mL 60, 1 x מעכב פרוטאז).
    הערה: מלאי של מאגר פירוק התא חסר IGEPAL Superase, פרוטאז קוקטייל מעכב ייתכן שהוכנה מראש ויש לאחסן בטמפרטורת החדר. הכן קבוצה חדשה של מאגר פירוק התא מלא על ידי הוספת את תוספי לעיל בריכוזים הסופי מומלץ למאגר פירוק התא מלאי ואחסון זה על קרח.
  4. להוסיף µL 260 מאגר פירוק התא מלא קרח כל מדגם בצינור microfuge (קרי, כל שפופרת microfuge מכיל תאים שנקטפו באר אחת של צלחת 6-טוב), resuspend בגדר תא להשעיה הומוגנית על-ידי pipetting.
  5. Lyse התאים באמצעות שיטת ההקפאה-הפשרה: דגירה הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. לאחר מכן, מאפשרים לתאים להפשיר על קרח.
  6. Centrifuge התא שנוצר lysate ב x 16,000 g למשך 5 דקות ומפרידה benchtop בקירור להגדיר ב 4 º C.
  7. העברה התא lysate צינור microfuge mL 1.7 סטרילי על קרח. להתעלם בגדר.
    הערה: הנפח הסופי של פינו lysate יהיה ~ 240-250 µL.
  8. להוסיף 5 M NaCl שנוקה lysate ריכוז סופי של 1 מ' ולתחזק את הדוגמאות על קרח.

4. הכנת Beads מגנטי Streptavidin — II

  1. הכנת מאגר טרי שטיפת נפתחים מלאה (10 מ מ אשלגן כלורי, 1.5 mM MgCl2, 10 מ מ טריס-Cl pH 7.5, 5 מ מ DTT, 1 מ' NaCl, 0.5% IGEPAL, 60U/mL Superase ו- 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל)
    הערה: מלאי של מאגר נפתחים שטיפת חסר IGEPAL Superase, פרוטאז קוקטייל מעכב ייתכן שהוכנה מראש ויש לאחסן בטמפרטורת החדר. הכן קבוצה חדשה של מאגר פירוק התא מלא על ידי הוספת את תוספי לעיל בריכוזים הסופי מומלץ למאגר פירוק התא מלאי ואחסון זה על קרח.
  2. מקם את שפופרת המכילה החרוזים מוכן (מתוך שלב 2.9) על המגנט עבור 2 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
  3. להוסיף 150 µL קר כקרח לשטיפת נפתחים מלא המאגר החרוזים. מערבולת 15 s דגירה בטמפרטורת החדר עבור המקום ס' 30 – 60 הצינורות על המגנט עבור 2 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
  4. חזור על שלב 4.3 עבור סכום כולל של 3 פעמים.
  5. Resuspend את החרוזים ב- 300 µL לשטיפת נפתחים מלא המאגר.

5. נפתחים של מתחמי mRNA-miRNA היעד

  1. העברת µL 300 של התא lysate (מתוך שלב 3.8) אל הצינור microfuge המכיל 300 µL של חרוזים (מתוך שלב 4.5).
  2. דגירה את התערובת על מיקסר nutating לשעה בטמפרטורת החדר.
  3. מניחים את הצינורית על המגנט עבור 5 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
  4. להוסיף µL 300 קר כקרח לשטיפת נפתחים מלא המאגר החרוזים. מערבולת 15 s בטמפרטורת החדר ובמקום הצינורית על המגנט עבור 5 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
  5. חזור על שלב 5.4 עוד פעמיים.
  6. Resuspend את החרוזים ב 100 µL של מים נטולי נוקלאז, דגירה על קרח.

6. סה כ החילוץ-RNA cDNA סינתזה, qPCR

  1. לחלץ RNA הכולל החרוזים resuspended (מתוך שלב 5.6) באמצעות שיטה המתאימה (ראה טבלה של חומרים). Resuspend את הרנ א הכולל שחולצו ב 25 µL של נוקלאז ללא מים. לקבוע את ריכוז ה-RNA ואת איכות שימוש ספקטרופוטומטרים (ספיגת-260/280). להכין מלאי עבודה של RNA-50 ng/µL.
  2. לבצע סינתזה cDNA, ב- triplicates, באמצעות 50 ng של RNA הכולל (מתוך שלב 6.1) באמצעות סינתזה של cDNA המתאים קיט (ראה טבלה של חומרים) באמצעות oligo dT תחל בנפח סופי של 20 µL (טבלה 1). לאחר מכן, טען המבחנות לתוך הכלי qPCR לבצע רכיבה תרמי בהתאם לתנאים המפורטים בטבלה מס ' 2.
  3. לבצע qPCR CDNA (מתוך שלב 6.2) באמצעות SYBR Green כימיה (ראה טבלה של חומרים):
    1. ביצוע כל התגובות qPCR triplicates בצלחת התחתונה ברורה ובכן 96 בתנאים סטריליים.
    2. Aliquot µL 9 של תערובת התגובה מהמאסטר qPCR מערבבים (ראו טבלה 3) לבאר כל צלחת. לאחר מכן, להוסיף 1 µL של cDNA כדי בכל טוב כדי להשיג נפח סופי של µL 10. לאטום את הצלחת ה-PCR באמצעות PCR עמידים בחום-צלחת סילר לאיטום ולטעון לתוך הכלי qPCR
    3. לבצע רכיבה תרמי בהתאם לתנאים המפורטים בטבלה4.
    4. לנרמל את רמות הביטוי (Ct ערכים) של כל מדגם את רמות הביטוי של הפקד מקושקשות. השתמש בערכים אלה כדי לחשב הקיפול שינויים בביטוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNAs לווסת תהליכים תאיים על-ידי איגוד אל היעד mRNAs. לכן, זיהוי מטרות mRNA הן מפתח כדי להבין את הפונקציה miRNA. כאן אנו נרחיב על שיטה לזיהוי mRNA היעד של miRNA הסלולר. פרוטוקול זה הוא ממאמרו של Wani. et al. 35 עם השינוי של ניצול biotinylated מחקה miRNA מבוססת מגבר קדם כדי הנפתח יעד ה-mRNA. השימוש oligonucleotide מבוססת מגבר קדם מחקה מגבירה את ייחודה של היעד מחייב עקב יציבות גבוהה יותר של הטבעת ריבוז שהשתנו ללא ההשפעות הרעילות36

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי של מטרות mRNA של הסלולר miRNAs חשוב להבנת תפקידם רגולטוריות. מספר כלים חישוביים מועסקים לחזות המטרות בהתבסס על זרע רצף משלימים את החסר ועל שימור היעד-רצפים-19,-20. כלים אלה אמנם יקר, הם יכולים ליצור רמות גבוהות של תוצאות false חיוביות והן שליליות כוזבות. לכן, תחזיות אלה נמצאים יחד עם שיטות נסיוניות כגון immunoprecipitation של RISC מורכבים ולא נפתחים של miRNA:mRNA מורכבים כדי לאשר ישירה עקידת miRNAs שלהם מטרות בהתאמה27,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים לא-כספיים ופיננסיים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי הלאומית המכונים לבריאות (NIH) DA037779 מענקים (כדי ג'יי פי), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960, MD007586 (על הדיסק). העבודה גם נתמך על ידי G12MD007586 גרנט RCMI, UL1RR024975 גרנט CTSA ונדרבילט, מרכז המחקר Translational Meharry (MeTRC) CTSA הענק (RR026140 U54 NCRR/NIH, את MD007593 גרנט U54 מ NIMHD/NIH, מרכז טנסי לאיידס מחקר (P30 AI110527).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
קו תאים- HEK293T תאיםATCCCRL-3216
סרום בקר עוברי מומת בחום (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
טריפסין-EDTA (0.25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM מדיה סרום מופחתתGIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 מגיב טרנספקציהInvitrogen / Thermofisher11668-019
Biotinylated has-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
בקרה מקושקשת ביוטיניליתExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
סטרפטווידין חרוזים מגנטייםפירס88816
שמרים tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA2153
תמיסת אשלגן כלורי (KCl)Sigma-Aldrich60142
מגנזיום כלוריד (MgCl2)Sigma-AldrichM1028
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'795429
חומצה אתילנדיאמין טטראצטית, תמיסת מלח דיסודיום (EDTA), 0.5 M, pH 8.0סיגמא-אולדריץ'E7889
דיתיותרייטול (DTT)סיגמא-אולדריץ'43815
סופראזאמביון/תרמופישרAM2694
קוקטייל מעכב פרוטאזSigma-AldrichP8340
מים ללא RNAse/DNAseGIBCO/Thermofisher10977-015
ערכת מיצוי RNeasyQiagen74104
ערכת סינתזה cDNA iScript-SelectBiorad170-8897
qPCR פריימרים Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR ירוק סופרמיקסBiorad172-5120
DynaMag-Spin מגנטInvitrogen/Thermofisher12320D

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340(2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biotin based Pulldown AssaymiRNA Target ValidationStreptavidin coated Magnetic BeadsBiotinylated miRNA MimicsLocked Nucleic Acid MimicsqPCR based QuantificationCellular Lysate PreparationmiR 125b PARP 1 InteractionNucleic Acid Pull downRNA Isolation Protocol

Related Articles