מצעים עם נוקשות ב קילו פסקל-הטווח שימושיות ללמוד תגובת התאים נוקשות סביבת מיקרו רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. שימוש רק מיקרוסקופ זריחה widefield, האלסטיות של ג'ל סיליקון רך יכול להיקבע באמצעות ההזחה עם כדור מתאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך Mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בדרך כלל, רקמות רכות בגוף האדם יש נוקשות בטווח קילו פסקל (kPa). בהתאם לכך, סיליקון, הידרוג סובסטרטים גמיש הוכחו להיות סובסטרטים שימושי עבור culturing בתאים microenvironment הפיזי המחקה חלקית תנאים ויוו . כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט עבור אפיון מודולים של הצעירים של איזוטרופיות סובסטרטים אלסטי ליניארי משמש בדרך כלל עבור מחקרים mechanobiology. הפרוטוקול מורכב הכנת מצע סיליקון רך על צלחת פטרי או סיליקון נוקשה, ציפוי המשטח העליון של המצע סיליקון עם חרוזים פלורסנט, באמצעות כדור בקנה מידה מילימטר להכנסת המשטח העליון (על-ידי כוח הכבידה), הדמיה של פלורסנט חרוזים על משטח סיליקון עם כניסות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, וניתוח תוצאות תמונות כדי לחשב האלסטיות של המצע סיליקון. צימוד השטח העליון של המצע עם חלבון מטריצה חוץ-תאית מודולים (בנוסף החרוזים פלורסנט) מאפשר את המצע סיליקון לשמש בקלות יופיצ תא, מחקרים מאוחרים יותר באמצעות ניסויים מיקרוסקופ כוח המתיחה. השימוש סיליקון נוקשה, במקום צלחת פטרי, כבסיס של שהסיליקון רך, מאפשר את השימוש mechanobiology מחקרים שכללו מתח חיצוני. יתרון מסוים של פרוטוקול זה הוא מיקרוסקופ זריחה widefield, אשר זמין בדרך כלל במעבדות רבות, הציוד העיקרי הנדרש בהליך זה. נדגים לפרוטוקול זה על ידי מדידת האלסטיות של סובסטרטים סיליקון רך של מודולים שונים אלסטי.
מבוא
תאים ברקמות רכות לשכון בסביבת מיקרו-נוקשות של מי זה קילו פסקל טווח1, בניגוד מנות תרביות רקמה נוקשות של מי הוא במספר סדרי גודל גבוה יותר. הניסויים הראשונים עם תאים מצופים חלבון מצעים רכים מטריצה חוץ-תאית הראה כי הקשיחות המצע השפעות כמה תאים הלאה וכן לדבוק מטריצות מתחת2,3. למעשה, הקשיחות המצע משפיעה באופן מהותי את הפונקציה תא4 באופן דומה על אותות ביוכימיים נרחבת. ג'לים לזיהוי (מצופה עם מטריצה חוץ-תאית חלבונים) הם (המגובש מים) hydrogels כי שימשו בהרחבה כתא תרבות מצעים עבור mechanobiology מחקרים5. Polydimethylsiloxane (PDMS), שהסיליקון הנפוץ ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור של מצע סיליקון רך
- שוקלים לצאת 1.75 גרם של רכיב ה-A ו- g 1.75 של רכיב ה-B (A:B = 1:1) אלסטומר סיליקון רך הערכה באמצעות (פוליסטירן) במשקל של מגשים.
- הוסף את הרכיב A אל רכיב B במגש במשקל ומערבבים אותם יחד במשך 5 דקות באמצעות מקל של המוליך המתאים.
- להוסיף את התערובת מעל 35 מ מ פטרי. לאפשר את התערובת נמרח על פני הפטרי לכמה דקות.
הערה: הבחירה של קוטר צלחת פטרי ואת מידת סיליקון רך יקבע את עובי סיליקון רך. . כאן, העובי יהיה בסביבות 3.5 mm; עוד על בחירת העובי elastomer במקטע דיון . - מקם את צלחת פטרי עם התערובת סיליקון, עם המכסה, תא ואקום למשך 15 דקות להסיר את כל בועות האוויר. במהלך תקופה זו, מראש בחום תנור ל 70 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל, אנו מוכנים סיליקון רך ב- 35 מ מ פטרי, ריפא אותו ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, בשילוב גרגרי פלורסנט (קולגן אני) על פני השטח העליון כמו סכמטי מתואר באיור 1. UV עמוק שימש בעבר עבור החלבון בסופו של דבר צימוד סובסטרטים13. שים לב (I) התנאים לריפוי המשמש כאן הם הספציפי הזה סיליקון רך, (II) המדידה כניסה מבוצעת ביום הבא כצפוי סיליקון רך כדי לרפא קצת בהמשך במהלך יום.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעוד השיטה כניסה פרנה קלה לביצוע, תשומת לב רבה ישולם הבחירה של indentor ואת העובי של המדגם סיליקון רך. המשוואה לחישוב מודול האלסטיות הוא חוקי תחת תנאים11, אלה הם בדרך כלל מרוצה כאשר העובי של המדגם סיליקון > 10% של הרדיוס indentor ו < ~ 13 x רדיוס indentor. מצאנו כי סיליקון עובי של 5-10 x רדיוס indentor היה בחירה טובה, שבה העובי מדגם אינה גבוהה מדי (כלומר, המרחק עבודה אובייקטיבית אינה הולמת מגבלה) ואת הקשיחות מחושב היה גם לא רגיש מדי הערך המדויק של עובי סיליקון. הבחירה של כדורי indentor צר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים מרגרט גרדל בנדיבות להתרת השימוש rheometer. אנו להכיר תמיכה של NIH (1R15GM116082) שיאפשרו עבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| CY 52-276 ערכת אלסטומר סיליקון A/B | Dow Corning | CY 52-276 | חנות בטמפרטורת החדר |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store ב-20° סי |
| תרמו סיינטיפיק פירס סולפו-NHS קרוסלינקר | פישר סיינטיפיק | PI-24510 | חנות ב-4° C |
| חלקיקים ורודים פלואורסצנטיים של קרבוקסיל, 0.4-0.6 ומיקרו; מ', 2 מ"ל | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | חנות ב-4° ג, אין להקפיא |
| 1.0 מ"מ חרוזי זירקוניום שטופים בחומצה | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| תא UV עמוק עם מפנה אוזון | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, מזנב חולדה | Corning | 354236 | ריכוז מלאי = 4 מ"ג/מ"ל; אחסן ב-4° C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | תוכנה נחלת הכלל |
מקורות
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesion....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
