הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

13.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57801

⸱

6 ביוני 2018

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

במאמר זה

סיכום

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

תקציר

הקרנה עבור אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות שמרים 2-היברידית וזמינותו כבר זמן רב כלי יעיל, אך השימוש בה במידה רבה הוגבלה לגילוי של interactors גבוהה-זיקה כי הם מאוד מועשרים בספריה של מועמדים אינטראקציה. בתבנית מסורתית, שמרים 2-היברידית וזמינותו יכולות להניב מושבות רבות מדי לנתח כאשר ניצח ב לכתחילה נמוך שבו זיקה נמוכה interactors שעשויים להימצא. יתר על כן, ללא חקירה מקיפה ושלמה של הספרייה אותו נגד פלסמידים שונים פיתיון, ניתוח השוואתי אינה יכולה להיות מושגת. למרות חלק מבעיות אלו ניתן לטפל באמצעות ספריות טרף ערוכים, עלות והתשתיות הדרושים להפעלת מסכי כזה יכול להיות אסורה. כחלופה, אנו הסתגלו שמרים 2-היברידית וזמינותו לחשוף בו זמנית עשרות ארעי, אינטראקציות חלבון סטטי בתוך מסך אחד ניצול אסטרטגיה כינה DEEPN (העשרה דינמי עבור הערכה של חלבונים רשתות), אשר משלבת רצפי DNA תפוקה גבוהה וחישוביות לעקוב אחר ההתפתחות של אוכלוסיה של פלסמידים אשר קידוד שותפים אינטראקציה. כאן, אנו מתארים ריאגנטים מותאם אישית ופרוטוקולים לאפשר מסך DEEPN להורג בקלות וביעילות.

מבוא

הבנה מלאה של התהליכים הביולוגיים תא מסתמך על מציאת הרשתות אינטראקציית חלבון העומדים בבסיס המנגנונים המולקולריים שלהם. גישה אחת כדי לזהות אינטראקציות חלבון הוא וזמינותו (Y2H) 2-היברידית שמרים, אשר עובד על ידי הרכבת פקטור שעתוק chimeric מתפקדת ברגע חלבון שני, תחומי עניין לאגד בזו1. מסך Y2H טיפוסי מבוצע על-ידי יצירת אוכלוסייה של שמרים כי בתים בשני ספריה של פלסמידים קידוד חלבונים שמעצבת דבוקה מפעיל גנים ברמת השעתוק (למשל., "טרף" חלבון כימרי) ולא על פלסמיד נתון "פיתיון" המורכבת של החלבון עניין התמזגו לתחום איגוד ה-DNA (למשל, התחום Gal4 DNA-איגוד המאגד רצף הפעלת נגד הזרם-Gal4). אחד היתרונות העיקריים של הגישה Y2H היא כי קל יחסית זול לבצע במעבדה טיפוסי מצויד עבור עבודה שוטפת ביולוגית מולקולרית2. עם זאת, כאשר מבוצעת באופן מסורתי, משתמש דוגמאות בודדות מושבות שעולות בעת הבחירה עבור השפעה חיובית הדדית Y2H. זה קשות מגביל את המספר של ספריית "טרף" שיבוטים זה יבדקו. בעיה זו היא הופכת למורכבת יותר כאשר השפע של טרף אינטראקציה מסוימת היא גבוהה מאוד ביחס לאחרים, צמצום הסיכוי של גילוי האינטראקציה של פלסמידים לטרף השפע נמוכה.

פתרון אחד לשימוש העיקרון Y2H ב כיסוי מקיף של פרוטאום הוא השימוש בגישה בתבנית מטריצה שבה מערך המכיל טרף בודדים הידועים פלסמידים יכולים דיגיטלית להיחקר. עם זאת, גישה כזו דורשת תשתית אינו נגיש בקלות או חסכונית לחוקרים בודדים אשר מעוניינים מגדיר את interactome של מספר קטן של חלבונים או תחומים3. בנוסף, ספריות טרף מאוד מורכב יכול לקודד שברים מרובים של חלבונים שמעצבת להרחיב גודל כזה מערכים מטריקס גדלים מעשית. חלופה אחת היא לבצע מבחני עם ספריות מורכבים בקבוצות להעריך את הנוכחות של אינטראקציה שיבוטים שימוש מסיבי מקביל בתפוקה גבוהה רצף4. זה ניתן ליישם assay הנוכחות של פלסמידים טרף העולות מושבות מרובות באמצעות טיפוסי Y2H מעוצב הגישה שמרים אילו תאים דיור בזוג אינטראקציה של חלבונים פיוז'ן רשאים לגדול על צלחת5,6. זה הרעיון הכללי יכול להיות הדגישה להגדיל השאילתה של שני פיתיון מרובים, טרף רכיבים באותו זמן7,8.

עדיין, חקירות רבות דורשות שקל יותר עדיין מתרכז יותר מאמץ רק כמה חלבון "פיתיונות', יכולים ליהנות יותר על-ידי שאילתת ממצה, חצי כמותית של ספריה טרף מורכבת אחת. יש שפותחה ואנו לאימות גישה לביצוע מחקרים אינטראקציה חלבון בהיקף נרחב באמצעות עיקרון Y2H אצווה תבנית4. זה משתמש קצב התרחבות פלסמיד מסוים טרף כמייצג העוצמה היחסית של האינטראקציה Y2H9. רצף עמוק של פלסמידים כל בתוך אוכלוסיה נתון הצמיחה רגילה או תנאי הגידול סלקטיבי מייצר מפה מלאה של שיבוטים המניבים אינטראקציות Y2H חזקות או חלשות. הרפרטואר של interactors יכול להיות שהושג, בהשוואה ישירות על פני פלסמידים מרובים פיתיון. זרימת העבודה וכתוצאה מכך כינה DEEPN (דינמי העשרה עבור הערכה של חלבונים רשתות) וכך ניתן לזהות interactomes דיפרנציאלית מספריות טרף אותו לזהות חלבונים, המאפשר השוואה בין חלבון אחד לעומת אחר.

. הנה, נדגים DEEPN להציג שיפור שיטות מעבדה זה להקל על השימוש בו, אשר מתוארים באיור1. שיפורים משמעותיים כוללים:

דור של אוכלוסיות השמרים טרף. אחת מהדרישות מפתח של DEEPN מייצר אוכלוסיות של שמרים עם פלסמידים שונים פיתיון שיש מאותה התפלגות של ספריות טרף פלסמיד. אוכלוסיות בסיסית המקבילה של הספרייה פלסמיד טרף חיוניים לייצור מדויק השוואות בין interactomes של פיתיונות שונים. זו מושגת בצורה הטובה ביותר כאשר פלסמיד ספריית שוכן כבר בקרב אוכלוסיה שמרים הפלואידי, לגור פלסמיד הפיתיון נתון של האוכלוסייה הזאת מושגת על ידי הזדווגות לייצר דיפלואידי. כאן, אנו מספקים מדריך ברור באיך להכין כזה אוכלוסיות באמצעות ספריות מסחריים בבניין שמרים הפלואידי. אמנם מצאנו שיטות לייצר מספר רב של diploids, היעילות הכוללת ההזדווגות של מסחרי ספריית המכילים שמרים זנים אלו היה נמוך. לכן, אנחנו נבנה זן חדש אשר יכול בית ספריות טרף המניבה diploids הרבה יותר לכל ההזדווגות התגובה.

ניו סט פתיונות פלסמידים. פלסמידים הנוכחי רבים המבטאים "פיתיון" פיוז'ן חלבונים מורכבת של החלבון של עניין לתחום ה-DNA מחייב הם מבוססי 2µ, ומאפשר להם להגביר את מספר העותק שלהם. מספר עותק זה יכול להיות משתנה מאוד באוכלוסייה, להוביל השתנות בתגובה תעתיק Y2H. זה בתורו יכול להטות את היכולת לאמוד את עוצמת האינטראקציה חלבון נתון בהתבסס על התגובה צמיחה של תאים תחת בחירת. זו יכולה להיות חלקית כתובת על-ידי שימוש של פלסמיד עותק נמוכה, אשר חלקם תוארו קודם לכן כגון זמינים מסחרית pDEST3210. ואנחנו נבנה על חדש פיתיון פלסמיד (pTEF-GBD) מייצרת Gal4 DNA-מחייב תחום היתוך חלבונים בתוך פלסמיד מבוססי צנטרומר עותק נמוך TRP1 נושא את הגן ההתנגדות Kanr המאפשר גם שיבוט של פיתיון קטעים שני במעלה הזרם, במורד הזרם של התחום מחייב Gal4 DNA.

ספריית קטע חדש בצפיפות גבוהה Y2H. אנו נבנה על פלסמיד חדש לספריות טרף Y2H הבית, השתמשו בו כדי לבנות ספרייה Y2H מורכב מסיבים של אקראי הוטו שברי DNA גנומי האפייה. ניתוח רצף הראו כי בספריה זו היה מעל 1 מיליון רכיבים שונים, הרבה יותר מורכב מאשר שמרים שתואר לעיל גנומית Y2H פלסמיד ספריות11. עם הספרייה החדשה, הצלחנו להראות זרימת העבודה DEEPN יציבה מספיק כדי להכיל את ספריות מורכב עם הרבה פלסמידים שונים באופן אמין, לשחזור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת לוחות ומדיה

הערה: כל לוחות צריך להתבצע מינימלית 2 ימים לפני תחילת בפרוטוקול. התקשורת יכול להתבצע בכל עת. עם זאת, אדנין דקסטרוז (bYPDA) peptone תמצית שמרים במאגר צריך להתבצע ביום שבו ייעשה שימוש. כמה כלי תקשורת נעשית באמצעות שילוב תוסף המכיל רמה של אדנין שגדול מ מה זה משמש בדרך כלל. רוב התוספים תקשורתי מזערי ציין אדנין 10 mg/L. תוספי מזון הנקרא '+ 40Ade' ציין סכום כולל של אדנין 40 מ ג/ליטר.

  1. להכין תמיסת גלוקוז (50% w/v). עבור 1 L, להמיס 500 גרם של D-(+)-גלוקוז ב- 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. לכוון את עוצמת הקול עד 1000 מ"ל של באמצעות משורה מסנן דרך מסנן סטרילי 0.2 µm לתוך בקבוק אחסון מדיה mL 1,000 סטרילי.
  2. להכין תמצית שמרים צלחות דקסטרוז (YPD) peptone. עבור 1 L, לפזר 20 גרם של Peptone ו- 10 גרם של שמרים לחלץ ב- 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 960 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק, להוסיף 15 גרם של אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 40 מ"ל של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  3. להכין תקשורתי מזערי סינתטי מלא (CSM)-Trp צלחות. עבור 1 L, יתמוסס 6.7 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 960 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף גר' 0.7 - Trp-פגשתי הנשירה מיקס 20 מ ג של מתיונין, 15 גר' אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 40 מ"ל של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  4. להכין CSM-Leu-פגש את הצלחות. עבור 1 L, יתמוסס 10.05 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה ולמלא עד 940 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף 1.005 גר' - Leu-פגשתי הנשירה מיקס ו- 15 גרם של אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 60 מ של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  5. להכין CSM-Leu-Trp צלחות. עבור 1 L, יתמוסס 10.05 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 940 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף 1.005 גר' - Trp-Leu + לערבב נושרת מבית 40Ade, 240 מ"ג של אדנין, 15 גר' אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 60 מ של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  6. הכינו צלחות CSM Leu-Trp-שלו. עבור 1 L, יתמוסס 10.05 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 940 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף 0.975 גר' - Trp-Leu-שלו + לערבב הנשירה 40Ade 240 מ"ג של אדנין, 15 גר' אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 60 מ של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  7. הכינו צלחות CSM-Leu-Trp-שלו-3AT. עבור 1 L, יתמוסס 10.05 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 940 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף 0.975 גר' - Trp-Leu-שלו + לערבב הנשירה 40Ade 240 מ"ג של אדנין, 15 גר' אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 60 מ של 50% גלוקוז. מערבבים את µL 100 של 1 מ' מלאי סטרילי של 3-אמינו-1,2,4 triazole (3AT) על ידי לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  8. להכין LB-Kanr לוחיות. עבור 1 L, התמוססות 10 גר' טריפטון, 5 גר' שמרים לחלץ, 10 גרם של NaCl ב- 800 מ של מים בתוך 1000 מ"ל מזוקקים. שופכים לתוך משורה, למלא עד 1,000 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך מ 2,000 ל Erlenmeyer את הבקבוק, להוסיף 15 גרם של אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. מוסיפים 50 מ"ג Kanamycin ומערבבים על ידי לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  9. להכין YPD, CSM-Leu-נפגשו, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp CSM Leu-Trp-לו ומדיה. השתמש בהליך לעיל עבור לוחות אלא במקום לשפוך לתוך הבקבוק Erlenmeyer, שופכים לתוך בקבוק אחסון מדיה ולהשמיט את אגר.
  10. הכנת bYPDA (YPDA במאגר). קח סטרילי YPD מדיה ולהוסיף 200 mg/L אדנין במים מזוקקים סטריליים. להתאים את ה-pH ל 3.7 עם HCl. מסנן דרך מסנן סטרילי 0.2 µm לתוך בקבוק סטרילי.
  11. הכנת מאגר טרנספורמציה: בסורביטול 2 מ', 1 מ' ליתיום אצטט וגופרית והרכבו, 10 מ מ טריס pH 7.6, 0.5 מ מ EDTA, 0.2 מ מ סידן כלורי במים מזוקקים. לסנן דרך מסנן סטרילי 0.2 µm לתוך בקבוק סטרילי.
  12. להכין פתרון פג: 70% w/v פוליאתילן גליקול 3350 במים מזוקקים. לחטא על ידי תא לחץ.
  13. הכן עיוות סיבוב: 8 מ' אוריאה, 4% w/v מרחביות, 50 מ מ pH טריס 6.8, 10% v/v גליצרול, 0.02% w/v bromophenol כחול סטרילי מים מזוקקים.
  14. להכין סטי (TE חזקה): 50 מ מ. טריס, 20 מ מ EDTA, pH 8.0 במים מזוקקים. לסנן דרך מסנן סטרילי 0.2 µm לתוך בקבוק סטרילי.
  15. להכין פתרון מניות Zymolase: 10 מ"ג/מ"ל Zymolase 100T ב 50 מ מ אשלגן פוספט dibasic pH 7.5, 50% v/v גליצרול מאגר סטרילי לגלידה (מאוחסן ב-20 ° C).

2. שיבוט ואימות של פלסמידים פיתיון

הערה: בניית Gal4-הדי-איגוד תחום פלסמידים. כיום, ישנן מגוון רחב של מערכות Y2H זמינים מסחרית וזמין מבחינה אקדמית. DEEPN יכול להכיל רבים מהם ובלבד פלסמיד פיתיון לבטא את החלבון עניין התמזגו לתחום ה-DNA-איגוד נמצא TRP1-המכילים פלסמיד. שאר הדרישות במורד הזרם הם זה הרצף מיד במעלה הזרם של הספרייה טרף הוספה ידוע והוא זה השפעה חיובית הדדית Y2H יכול להיות שבוים על ידי הייצור של His3 המאפשר בחירה בתקשורת חסר היסטידין. כאן נתאר את השימוש פלסמיד פיתיון החדש Y2H (pTEF-GBD, איור 2), עם זאת, אחרים פלסמידים פיתיון Y2H כולל pGBKT7 יכול לשמש גם כן. עבור בנייה והערכה של פלסמידים פיתיון, נתאר את השימוש pTEF-GBD. בתור הערה כללית, אנו ממליצים על גן סינתזה כדי לייצר מסגרת פתוחה-קריאה על פי הטיה codon שמרים כדי להבטיח נוחות עם שיבוט וביטוי טוב. ודא כי שיטת השיבוט מאפשר הפיתיון במסגרת עם התחום Gal4 DNA מחייב, כי כאשר שיבוט לאתר 3', stop codon עוקב אחר האזור פיתיון-קידוד.

  1. הכינו את הווקטור פלסמיד. פלסמיד pTEF-GBD מאפשר שיבוט שבר קידוד החלבון עניין 5' או 3' של האזור קידוד התחום מחייב Gal4 DNA באמצעות שיטת הרכבה מהירה. עבור הכניסה באתר 5', לעכל 3 µg של pTEF-GBD עם נארי, EcoRI או להכנסה באתר 3', לעכל עם BamHI ו XhoI עבור 2-4 ה Electrophorese מדגם agarose DNA 1% ג'ל המכיל 0.2 - 0.5 µg/mL אתידיום ברומיד (EtBr) ב-100 נ' לסלק את bp גזור 5,630 TEF-GBD, לטהר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל DNA בהתאם להוראות היצרן, לכמת את ה-DNA על ידי ספיגת ב-260 nm-ספקטרופוטומטרים12.
    הערה: דור מוסיף קידוד פיתיון. DNA קטעים קידוד חלבונים או שברי חלבון עניין יכול להיות עשוי באמצעות סינתזה של ג'ין וזמין כקטעים מפוצלים uncloned. מומלץ כי codons ממוטבים עבור ביטוי האפייה , כלים מקוונים עבור מיטוב codon כלולים ברשימה של חומרים.
  2. 5' להכנסה, לאגף את מקטע ה-DNA קידוד codon התחלה של ATG מאת 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'ו 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', בהתאמה. עבור 3' ההכנסה במסגרת עם התחום מחייב Gal4 DNA, לאגף השבר קידוד על ידי 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'ו 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. לבנייה פלסמיד, השתמש בשיטה הרכבה מהירה כפי שצוין ביישום הוראות יצרן על שברי שיבוט לתוך לחתוך pTEF-GBD.
    1. צלחת כל טרנספורמציה e. coli אל LB-Kanr לוחיות, תקופת דגירה של 16-20 h ב- 37 מעלות צלזיוס. מושבות דיור pTEF-GBD עם הוספת הרצוי ניתן לזהות באמצעות PCR הגברה באמצעות oligonucleotides של: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3' ו 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' עבור 5' insert ו- 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' ו 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' עבור 3' הכנס. אלה oligonucleotides יכול לשמש גם צבעי יסוד קביעת רצף של תותב.
    2. תוכנית על הכנת > 10 µg של כל נגזרת pTEF-GBD, pTEF-GBD לבד כדי לספק חומר להמרות רצף ושמרים.
    3. השתמש התנאים PCR הבאים: 3 דקות ב 98 ° C, ואחריו 25 מחזורים של 30 s ב 98 ° C, 30 s-55 ° C, ו- 2 דקות ב-72 מעלות, ואחריו 5 דקות ב-72 מעלות באמצעות מאגר המכיל 2.5 מ"מ MgCl2 , 0.5 U/100 µL DNA פולימראז, ומאגר קניינית.

3. ביטוי של חלבונים פיוז'ן Gal4-הדי-איגוד תחום

  1. להפוך שמרים המוסמכת.
    1. פס החוצה PJ69-4A שמרים לצלחת YPD על ידי לקיחת המוליך עץ סטרילי, גירוד 1 מ3 של-80 ° C קפוא מניות, לשפשף את זה בעדינות על פני הלוח YPD. להזיז את המוליך עץ למטה הצלחת כך כל מעבר עובר על פני חלק ללא שינוי פני המדיה. דגירה את הצלחת YPD ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים או עד יחיד מושבות גלויים. להפוך את המניה קפוא של PJ69-4A שמרים על ידי השעיית שמרים בתקשורת מים או צמיחה, שכשהם עם דימתיל סולפוקסיד ל 7% אחסון ב- 80 ° c
    2. לחסן מושבה בודדת ב 5 מ של תרבות YPD תרבות 20 מ מ x 150 מ מ צינור באמצעות של המוליך עץ עקר ולגדול ללון ב- 30 מעלות צלזיוס חממה חזק ב 200 סל ד.
    3. לחסן 50 מ של YPD ב 250 מ של הבקבוק Erlenmeyer סטרילי עם 4 מ"ל של התרבות לילה של זן שמרים PJ69-4A. גדלים חממה חזק ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל ד צפיפות אופטית (OD600) של 1.2, כפי שנקבע על ידי ספקטרופוטומטר עם נתיב אור רגיל 1 ס מ. הצמיחה בדרך כלל לוקח h 5-7.
    4. לבודד שמרים על-ידי שיקוע ב 50 מ ל צינור חרוטי ב g x 4,696 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ומפרידה benchtop. למחוק את תגובת שיקוע על-ידי זריקת לתוך. פסולת נוזלית. באמצעות פיפטה של, resuspend בגדר ב 5 מ של טרנספורמציה מאגר והעברתן ל-15 מיליליטר צינור חרוטי. Resediment למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את השמרים ב- 1 מ"ל נפח סופי של טרנספורמציה מאגר עם פיפטה 1000 µL.
    5. דגירה תאי שמרים למשך 60 דקות ב 30 מעלות צלזיוס תוך טלטול-200 סל ד ולאחר מכן מקם על קרח למשך 30-90 דקות.
  2. שמרים פלסמיד טרנספורמציה.
    1. ב- mL 1.5 צינור microcentrifuge סטרילי, להוסיף 1 µg של פלסמיד המבוססות על pTEF-GBD ו- µL 5 של 10 מ"ג/מ"ל זרע סלמון הספק פתרון ה-DNA. כוללים גם שפופרת המכילה רק זרע סלמון DNA המוביל כפקד שינוי שלילי. להוסיף 100 µL של התליה תא קר כקרח שמרים כל שפופרת באמצעות פיפטה. להוסיף 100 µL של 70% פתרון פג עם 1000 µL פיפטה, לערבב בעדינות על ידי מצליף הצינור 5 - 10 פעמים (לעשות לא מערבולת).
    2. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס, בחממה חזק ב 200 סל"ד למשך 45 דקות.
    3. מחממים את ההלם 42 º C למשך 15 דקות.
    4. משקעים ב microcentrifuge ב g x 845 למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, פיפטה למחוק את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 150 µL של מים סטריליים על-ידי pipetting למעלה ולמטה ו התפשטה על פני השטח של צלחת CSM-Trp.
    5. המקום בצד ימין הצלחות ב- 30 מעלות צלזיוס חממה, תקופת דגירה של 2-3 ימים עד מושבות גלויים. לוחות עשויים להיות מתהפך כדי למנוע עיבוי על פני צלחת לאחר דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 6-12 שעות.
    6. לקחת 2-3 מושבות לכל שינוי, פס כטלאי על צלחת CSM-Trp באמצעות קיסם סטרילי. אפשר לגדול במשך 24 שעות ביממה ב- 30 ° C.
  3. להפוך lysates ביטוי חלבון.
    1. לחסן 3 מ"ל של מדיה נוזלי CSM-Trp עם התאמה-הראש-גודל של שמרים מהמדבקה ולגדול בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס בשפופרת תרבות 20 מ"מ x 150 מ"מ, תוך כדי טלטול-200 סל ד. להפוך את שתי התרבויות לילה לכל פיתיון וקטור pTEF ריק-GBD.
    2. להוסיף 1 מ"ל של YPD כל 3 מ"ל של תרבות לילה CSM-Trp. לגדול עבור 1 h ב- 30 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול-200 סל ד. בדוק את יתר של תאים על ידי ספקטרופוטומטרים.
    3. משקעים מספר שווה של תאים, על-פי OD נירמול. השתמש mL 1.5 סטרילי של צינורות microcentrifuge עם ספין 5 דקות ב g x 2,348 בטמפרטורת החדר microcentrifuge. השתמש פיפטה כדי למחוק את תגובת שיקוע. המניה הסופי מקביל מינימום של 2.1 OD.
      הערה: בעת חישוב שווי ערך מספר התאים, זה יכול להתרחש אמצעי אחסון שונים העשויים להידרש מתרבות כל לילה כדי להשיג OD 2.1 מינימלי.
    4. Resuspend בגדר ב 450 µL של 0.2 M NaOH מאת pipetting למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. Recentrifuge תאים למשך 2 דקות ב g x 2,348 בטמפרטורת החדר, ולמחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה.
    5. Resuspend בגדר עם 50 µL מאגר עיוות סיבוב על-ידי pipetting למעלה ולמטה בזהירות לא לעשות בועות. דוגמת חום עבור 5 דקות ב- 70 מעלות צלזיוס.
  4. בדוק אם יש ביטוי חלבונים על ידי עמודים מרחביות.
    1. שימוש ג'ל הדרגתי של 4-20% כדי להבטיח מגוון רחב של משקולות מולקולרית ניתן לפתור. כמות שוות ערך עומס (OD אותו) דוגמאות לתוך מרחביות-דף של ג'ל, הקפד לכלול מדגם אחד לפחות המכיל את pTEF שלא שונתה-GBD וקטור13,14,15.
    2. לאחר הפרידה electrophoretic, העברה ג'ל ניטרוצלולוזה, immunoblot באמצעות נוגדנים אנטי-myc monoclonal או polyclonal ו- ECL זיהוי פתרון (איור 3).

4. הפעלה עצמית מבחן

  1. פס החוצה השמרים MATalpha מן המלאי-80 ° C המתאים המתח דיור הספרייה הטרף של ריבית על צלחת YPD על-ידי לקיחת של המוליך עץ סטרילי, גירוד כמות קטנה של שמרים מחוץ המבחנה שיורד זה הלוח YPD. דגירה את הצלחת YPD ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים או עד יחיד מושבות גלויים. תיקון כמה מושבות יחיד על צלחת YPD, דגירה בין לילה ב- 30 ° C.
    הערה: הזן החדש פותח כאן לספריית הבית טרפו היא PLY5725 בעוד כמה ספריות Y2H זמינים מסחרית תואם שוכנות Y187.
  2. בצע את ההליכים בסעיף 3.3.1 - 3.3.4 להפוך PLY5725 עם LEU2-המבוסס על פלסמיד רגילה להאוס הספרייה הרצויה טרף. עבור ספריות פותח כאן, פלסמיד המתאים הוא pGal4AD (pPL6343). כדי לשחזר שמרים transformants, צלחת על גבי לוחות CSM-Leu-נפגשו. לאחר מושבות עולות, פס כמו כתמים על גבי צלחת CSM-Leu-פגש את תקופת דגירה של 24 שעות ביממה ב- 30 ° C.
  3. לפי התקנון ב- 3.4 כדי לאשר את הביטוי של pPL6343 וקטור ריקה באמצעות אנטי-HA נוגדנים monoclonal או polyclonal ופתרון זיהוי ECL.
  4. פס שאחד של שמרים PJ69-4A טרנספורמציה בתבנית צלב עם PLY5725 בונה על צלחת YPD זה אושר אקספרס חלבון בפרוטוקול סעיף 3.4 ו- 4.3, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. קח 1 מ3 התאים גדלו ביחד ואיפה טלאי על גבי שני זנים להפריד CSM-Leu-נפגשו, CSM-Trp, וצלחות CSM-Trp-Leu ולגדול 24 שעות ביממה.
    הערה: diploids הרצויה תגדל על לוחות CSM-Trp-Leu. גידול על CSM-Leu-פגשתי וצלחות CSM-Trp לשמש פקד חיובי עבור צמיחת שמרים.
  5. לגדול diploids ב 1 מ"ל של מדיה CSM-Trp-Leu ללון ב- 30 ° C. משקעים 500 µL תאים 1.5 מ של microcentrifuge צינור ב 2,348 x g, 3 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge. למחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה. Resuspend תאי 1 מ"ל של מים סטריליים וחזור שקיעת ו- resuspension. בדוק את יתר600 של תאים.
  6. לעשות סידרה של 1:10 דילולים טורי של כל השעיה תא שימוש במים סטריליים עם ההתחלה הכי מרוכז פתרון של כל אחד ב- OD של 0.5. במקום 5 µL של כל דילול על גבי צלחת CSM-Leu-Trp צלחת CSM Leu-Trp-שלו, של CSM-Leu-Trp-שלו + צלחת 3AT. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ולבדוק לצמיחה מדי יום במשך 3 ימים (איור 4).
    הערה: עבור ה-1:10 דילול טורי, פיפטה 10 µL של הצינור המכיל OD 0.5 לתוך µL 90 מים ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. המשך לבצע 1:10 דילולים טורי עד יש בסך הכל 6 ריכוזים שונים לאתר.

5. ליצור את אוכלוסיות השמרים עם פיתיון וספריית טרף

הערה: בעקבות המתח Y187 שבו בתים טרף מסחרי ספריית פלסמידים לא חבר טוב. לפיכך, בתנאים אופטימליים הבאים נדרשים לשמור על המורכבות של הספרייה. PLY5725 זן המכיל Y2H טרף ספריות חברים כדאי, לאותו תהליך ההזדווגות יכולה לשמש עם זן זה (איור 5).

  1. לחסן mL 3 של תרבויות של כל אחד transformants PJ69-4A נושאת את שונים TRP1-המכילים pTEF-GBD פלסמיד פיתיון בתקשורת CSM-Trp בשפופרת תרבות. כוללים שתי תרבויות נפרד המכיל את פלסמיד וקטור pTEF-GBD לבד כדי לשמש כפקדי פרוצדורלי. דגירה תרבויות ב 30 מעלות צלזיוס, סל ד 200 עבור 6-אייץ ', ואז לדלל לתוך 25 מ של תרבות בבקבוקון Erlenmeyer סטרילי לצמיחה לילה.
  2. הפשרת בקבוקון קפואים (-80 מעלות צלזיוס) של התאים MATalpha המכילים את LEU2-נושא "טרף" ספריית בטמפרטורת החדר. לחסן 125 מ של התקשורת CSM-Leu-פגש את בקבוקון Erlenmeyer סטרילי עם המבחנה המופשרים לגמרי. לגדול בכל התרבויות בין לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
    הערה: ה OD600 של התרבויות לילה צריך לנוע בין 1.0 ל 1.5 לפני שתמשיך את הצעדים הבאים.
  3. צנטריפוגה 21 מקבילות OD של כל התרבויות transformant PJ69-4A עם ספין 5 דקות ב g x 4,696 בטמפרטורת החדר. כל 10 תגובות ההזדווגות הרצוי, גלולה OD 39600 במקבילות של המתח MATalpha סוחבת על פלסמידים ספריה נפרדת 50 מ של צינורות חרוט.
    1. Resuspend תאים ב- 10 מ"ל מים סטריליים, גלולה מחדש ב- 50 מ ל החדש של צינור חרוטי 4,696 g x 5 דקות בטמפרטורת החדר ומפרידה benchtop. בעדינות באמצעות פיפטה של, להסיר את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת התאים pelleted.
    2. Resuspend כדורי של תאים PJ69-4A 4 מיליליטר ותאים PLY5725 ב- 10 מ"ל של bYPDA (pH 3.7).
  4. שיבנו תגובות ההזדווגות, להוסיף 1 מ"ל של PJ69-4A טרנספורמציה תאים 1 מ"ל של תאים המכיל ספריית MATalpha, 1 מ"ל של pH bYPDA 3.7 עד חדש 50 מ"ל צינור חרוטי. דגירה ב 30 ° C עם עצבנות מסלולית עדין (100-130 rpm) במשך 90 דקות.
    1. צנטריפוגה תאים עבור 5 דקות ב g x 4,696, בטמפרטורת החדר ומפרידה benchtop. להסיר את תגובת שיקוע על ידי פיפטה, resuspend בגדר ב 2 מ של 1:1 bYPDA:YPD. צלחת כל 2 מיליליטר לצלחת YPD 100 מ מ באמצעות פיפטה, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך כ- 20 h.
  5. קציר תאים מן הלוחות YPD באמצעות מגרד תא מכך התאים אל תוך 2-3 מ"ל של CSM-Leu-Trp מדיה. פיפטה יצא ממקומו התאים 50 מ של צינור חרוטי. לשטוף צלחות 4 - 5 פעמים עם 2-3 מ"ל של CSM-Leu-Trp מדיה על-ידי pipetting למעלה התקשורת באמצעות µL של 1000 פיפטה ולהוציא בעדינות את המדיה פני צלחת YPD.
    1. צנטריפוגה תאים עבור 5 דקות ב g x 4,696 בטמפרטורת החדר ומפרידה benchtop. למחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה, resuspend התאים 40 מיליליטר CSM-Leu-Trp מדיה על-ידי pipetting למעלה ולמטה (do לא מערבולת).
  6. כדי להעריך את מספר התאים דיפלואידי נוצר, לדלל µL 4 של תערובת דיפלואידי לתוך 200 µL ומדיה CSM-Trp-Leu 2000 µL. צלחת µL 200 של כל דילול לצלחת CSM-Leu-Trp.
    הערה: שתי צלחות מייצגים לדילול קיפול 1:10,000, כוללות על מלאי diploids שנקטפו, מניב מושבות ~ 9,000 צפויים-27,000 בצלחת דילול 1:10,000 לאחר דגירה ב 30 ° C עבור ה 36-40 לוחות הסימון לאחר שלב 5.7. מספר מינימלי של 200 מושבות בצלחת דילול 1:10,000 נדרשת כדי להמשיך לשלב 5.8
  7. מיד לקחת את השארית לכל 40 מ של תא resuspension, לחסן של 1,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer המכיל 500 מ"ל של CSM-Leu-Trp מדיה. קח יתר ראשונית של600. דגירה המבחנות הללו ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-סל ד 180 עד שהם מגיעים לרוויה (~2.0 OD/mL). זה בדרך כלל לוקח כ 36-40 ה צג הצמיחה ב 24 שעות ואז שוב ב- 36 h מאת OD600.
  8. באמצעות פיפטה של, להסיר 20 מ של aliquots מכל mL 500 רוויה של תרבויות, innoculate מ 2,000 ל Erlenmeyer, צלוחיות, בושם אחד המכיל 750 מ של מדיה CSM-Leu-Trp, את השני המכיל 750 מ של CSM Leu-Trp-לו עם הרמה הנמוכה ביותר של 3AT את זה מבטל רקע (בעבר נקבע סעיף 4.5). מערבבים את תרבויות חדשות (770 מ"ל) היטב בעזרת מתערבל ולקחת יתר ראשונית של600.
  9. דגירה תרבויות ב 30 מעלות צלזיוס תוך טלטול-180 סל ד עד שהגיע רוויה, אשר בדרך כלל מתרחשת בתוך 24 שעות ביממה עבור התרבות CSM-Leu-Trp שלא נבחרו, יכול לקחת מעל 70 h עבור תרבויות תחת בחירת עבור אינטראקציות Y2H.
  10. פעם אחת התרבויות הגיעו רוויה (OD ~ 2.0), הסר מ 11 ל באמצעות פיפטה, משקעים התאים עם ספין 5 דקות ב g 4,696 x בטמפרטורת החדר, למחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה, להקפיא ב-20 ° C או המשך על מיצוי הדנ א. הדגימות שנבחרו, שלא נבחרו שניהם ישמש עבור רצף עמוק.

6. דוגמה לקראת רצף עמוק DEEPN

  1. מיצוי הדנ א.
    1. השתמש פיפטה כדי resuspend תא פתיתי פרוטוקול סעיף 5.7 ב- 500 µL של המאגר sTE והעברה 1.5 מ ל צינור microcentrifuge. מוסיפים 3 µL של betamercaptoethanol µL 10 Zymolase מניות. מערבבים היטב, דגירה בחממה 37 מעלות צלזיוס במשך 24-36 שעות.
    2. לחלץ את הדגימה פעמיים עם אלכוהול 500 של פנול/כלורופורם/isoamyl µL תוך שימוש הוד fume16.
    3. הוסף µL 7 של 4 M NaCl, µL 900 של אתנול 100% קר כקרח (ETOH), מיקס על ידי היפוך או להקפיא-20 ° C או להמשיך משקעים DNA על ידי ספינינג ב 21,130 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge.
    4. למחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה. לשטוף את צניפה שלוש פעמים עם 900 µL של 70% ETOH.
    5. משקעים הצניפה 21,130 g x עבור 2 דקות ולהסיר לשארי שטיפת ETOH על ידי פיפטה. צניפה יבש במשך 7 דקות ב 42 º C.
    6. Resuspend צנפה ב 120 µL של 0.1 x sTE באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, קפיצי הצינורות לערבב כל 30 דקות.
    7. פיפטה 60 µL של ה-DNA שחולץ לתוך mL 1.5 סטרילי צינור microcentrifuge. הוסף µL 120 של סטי, µL 3.5 RNase א מניות, תנועה כדי לערבב דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
    8. התמיסה אתנול נעשה כאמור ב סעיף 6.1.3 - 6.1.5, אבל להשתמש µL 7 של 5 מ' אמוניום אצטט במקום 4 M NaCl.
    9. Resuspend RNase דנ א שטופלו ב- 55 µL של 0.1 x sTE באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, קפיצי הצינורות לערבב כל 30 דקות Quantify DNA על-ידי ספיגת-260 ננומטר על ספקטרופוטומטרים.
  2. PCR cDNA מוסיף.
    1. לבצע שניים, 50 µL תגובות PCR לכל. דנ א. כל התגובה מכילה 25 pmol של כל פריימר ואחורה תואמים את פלסמיד טרף-ספרייה (ראה חומרים). תגובות גם מכילים µL 25 של אמינות גבוהה 2 x PCR מיקס מאסטר, µg 5 של דנ א, ומים עד 50 Amplify תגובות µL. עבור 25 מחזורי עם סיומת פעמים של 3 דקות ב 72 מעלות צלזיוס, טמפרטורה anneal של 55 ° C ל 30 s, ו denaturing ב 98 ° C עבור לפני ס' 10 רכיבה על אופניים מאת דנטורציה s 30 ב 98 ° C ופעל עם הדגירה 5 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס.
    2. לנתח 4 µL של כל תגובה PCR על-ידי 1% DNA בג'ל agarose עם agarose ה-DNA ג'ל המכיל 0.2 - 0.5 µg/mL EtBr17. המחש. דנ א על-ידי UV transillumination. דוגמאות יציגו כתם של הדנ א בסביבות 1-3 kb, איפה התבנית סימון עלול להימצא לדוגמאות איפה האינטראקציה Y2H היה נבחר (איור 6).
    3. לשלב דוגמאות PCR כפולים, לטהר באמצעות ערכת טיהור PCR בהתאם להוראות היצרן, לכמת את ה-DNA על ידי ספיגת ב-260 nm ב ספקטרופוטומטרים.

7. רצף עמוק

הערה: הכנת הדוגמא ורצף בפלטפורמה רצף עמוק זמין בדרך כלל מסחרי והאקדמי של מתקנים הליבה של DNA רצף.

  1. הטיה 600 ng של מוצר ה-PCR באמצעות אולטרה-sonicator של ביצועים גבוהים כדי לתת שברי אורך ממוצע של ~ 300 bp.
  2. ליצור רצף אינדקס ספריות באמצעות ערכת הכנה עבור רצף עמוק המוסיפה הטרמה אתרים, קידוד ברקודים, linkers וללכוד רצפים בצורה א-סימטרית על הקצוות של שברי DNA.
  3. לבצע הכנה הספרייה לפי הנחיות היצרן. בריכת באינדקס ספריות של רצף כמו זמן לזווג-end קריאות על פלטפורמה רצף עמוק (למשל, 2 x 150 קריאות bp PE). מספר קריאות ממוקד עבור כל דגימה הרצוי הוא בין 10 ל- 40 מיליון, עם קריאות יותר הרצויים עבור האוכלוסיות שלא נבחרו כי הם בדרך כלל מורכבים יותר. אנו ממליצים על פחות 20 מיליון או יותר קריאות עבור האוכלוסיות שלא נבחרו.

8. Bioinformatic עיבוד ואימות

  1. תהליך ה-DNA רצף נתונים בצורה של fastq עם קבוצת תוכנה עצמאי תוכניות שנבנו למפות (1) רצף לקרוא קבצים בפורמט סאם אוניברסלי (2) לכמת ג'ין העשרה בין נתונים (datasets) (3) לבצע ניתוח סטטיסטי של נתונים סדר לדרג המועמד אילו גנים הם חיוביים לאינטראקציה Y2H (4) לספק מידע לגבי מה region(s) ועל מה translational במסגרת כל cDNA טרף לכל הגן קטעים זה תשואה חיובית Y2H אינטראקציות מורכבות, ו- (5) כלים לשחזר לא רק את 5' אלא גם את 3' סופו של השברים שמעצבת ומאפשר שחזור ואימות שלהם בתבנית Y2H המסורתי. הפעולה של תוכניות אלה מפורט במחקר הנלווה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

וזמינותו Y2H כבר בשימוש נרחב לאיתור אינטראקציות חלבון: חלבון, פותחו מספר עיבודים ומערכות. ברוב המקרים, שאותם שיקולי המסייעות להבטיח הצלחה עם הגישות הקודמות האלה חשובים עבור DEEPN. חלק חשוב אמות כוללות: הבטחת ביטוי של תחום ה-DNA מחייב חלבונים פיוז'ן, הבטחת רקע נמוך של כדין שלו + צמיחה diploids המכילה הפיתיון של האינטרס פלסמיד טרף ריק, יעילות גבוהה ההזדווגות של הפיתיון המכילים שמרים מאטה עם הספריה המכיל שמרים MATalpha, ואפילו בסופו של דבר, נמוך-לכתחילה תנאים המאפשרים האוכלוסייה לגדול בתנאים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מספקים מדריך כיצד לבצע מבחני Y2H אצווה באמצעות שיטות אופטימיזציה. ישנם כמה צעדים קריטיים במסגרת ההליך כדי לסייע להבטיח כי האוכלוסייה של שמרים כי להימצא תחת הבחירה הוא נציג של הספרייה ההתחלה, כי מספיק של האוכלוסייה שמרים המוצא משמש בתהליך הבחירה כדי להגביל את השתנות . חשוב לציין, אמות-מידה אלה הם קל יחסית להשיג לצד התאמת את שיטות וחומרים מסורתיים Y2H assay, ובכך גישה זו נגיש ברוב מעבדות מאובזרים עבור תקן ביולוגיה מולקולרית. DEEPN מאפשר בחירה ספריית טרף מאותה אוכלוסייה תוך שימוש פלסמידים שונים פיתיון. לפיכך, קבוצת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף

תודות

אנו מודים לצוות בתוך המכון לגנטיקה אנושית על הגדרות ספריית הכנה ורצף. אנו מודים עינת שניר על המומחיות שלה בהכנת שברי ספרייה גנומית של הספריה פלסמיד Y2H כאן. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: NIH R21 EB021870-01A1, על ידי ה-NSF מחקר פרויקט מענק: 1517110.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פלטפורמת ריצוף עמוקשל Illumina HiSeq 4000Illumina
נוגדנים חד-שבטיים נגד HABiolegend901514נוגדן ראשוני לזיהוי ביטוי של HA במבנים pGal4AD
נוגדנים אנטי-myc פוליקלונלייםQED BiosciencesInc 18826נוגדן ראשוני לזיהוי ביטוי של MYC במבני pTEF-GBD NarI
New England BioLabsR0191S
EcoRI-HFניו אינגלנד BioLabsR3101S
BamHI-HFניו אינגלנד BioLabsR3236S
XhoIניו אינגלנד BioLabsR0146S
פוליאתילן גליקול 3350, אבקהJ.T. BakerU2211-08
סלמון זרע DNATrevigen, Inc נמכר על ידי Fisher Scientific50-948-286DNA נשא לטרנספורמציה של שמרים סעיף 3.2.1.
Kanamycin Monosulfateמחקר מוצרים בינלאומייםK22000
LE AgaroseGeneMateE-3120-500המשמשים לייצור DNA agarose ג'לים
נתרן כלורידמוצרי מחקר בינלאומייםS23025
טריפטוןמוצרי מחקר בינלאומייםT60060
D-סורביטולמוצרי מחקר בינלאומייםS23080
ליתיום אצטט דיהידראטMP ביומדיקל155256
סידן כלוריThermoFisherC79
EDTA נתרן מלחמחקר מוצרים בינלאומיE57020
אבקת תמצית שמריםמוצרי מחקר בינלאומיY20020
שמרים בסיס חנקן (אמוניום גופרתי) ללא חומצותאמינומוצרי מחקר בינלאומייםY20040
CSM-Trp-Leu+40ADEFormediumDCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADEFormediumDCS1169
CSM-Leu-MetFormediumDCS0549
CSM-Trp-MetBio 101, Inc4520-922
L-MethionineFormediumDOC0168
Adenine Research Products InternationalA11500
D-(+)-GlucoseResearch Products InternationalG32045
Bacto AgarBD214010המשמש לייצור לוחות מדיה בסעיף 1
PeptoneResearch Products InternationalP20240
3-amino-1,2,4 TriazoleSigmaA8056
2- מרקפטואהנול (BME)סיגמא-אולדריץ'M6250
זימוליאז 100TUSBiologicalZ1004
אשלגן פוספט דו-בסיסיסיגמאP8281
פנול: כלורופורם: IAAאמביוןAM9732
אמוניום אצטטסיגמא-אולדריץ'238074
אתנולדקון מעבדות, INC2716
RNAse AThermoFisherEN0531
אוריאהבינלאומייםU20200
SDSמוצרי מחקר בינלאומייםL22010
גליצרולסיגמא אולדריץ'G5516
Tris-HClGibco15506-017
ברומופנול כחולאמרסקו449
ערכת שיבוט הרכבה של גיבסוןניו אינגלנד BiolabsE5510Sשיטת הרכבה מהירה לשיבוט פלסמידים בסעיף 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541Sמשמש להגברה של מוצרים להרכבת גיבסון בסעיף 2.3 וכן הכנת מדגם לריצוף עמוק של DEEPN בסעיף 6.2.1
Ethidium BromideAmresco0492-5G
ערכת טיהור PCR QIAquickQiagen28104משמשת לטיהור מוצרי PCR בסעיף 6.2.3
ערכת מיצוי ג'ל Qiaquick DNAQiagen28704משמשת לטיהור pTEF-GBD מעוכל בסעיף 2.1
ערכת KAPA Hyper PrepKAPA BiosystemsKK8500לריצוף עמוק
אופטימיזציה של קודוןhttp://www.jcat.de
אופטימיזציה של קודוןhttps://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocksטכנולוגיותמשולבות שברי DNA המשמשים לשיבוט בסעיף 2.2
מחרוזותמקטעי DNA של תרמופישרהמשמשים לשיבוט בסעיף 2.2
ערכת מיני-הכנה של GenCatch Plasmid DNAEPOCH מדעיהמשמשים להכנת כמויות DNA בסעיף 2.3
Covaris E220Covarisאולטרה-סוניקטור בעל ביצועים גבוהים בסעיף 7
oligo nucelotide 5'- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisherהמשמשות להגברה ורצף PCR 5 'הכנס pTEF-GBD במהלך בניית פלסמיד
oligo nucelotide 5'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisherהמשמשות להגברה ורצף PCR 5 'הכנס pTEF-GBD במהלך בניית פלסמיד
oligo nucelotide 5'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTCTC-3'		טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisherהמשמשות להגברה ורצף PCR 3 'הכנס pTEF-GBD במהלך בניית פלסמיד
oligo nucelotide 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3'		טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisherהמשמשות להגברה ורצף PCR 3 'הכנס pTEF-GBD במהלך בניית פלסמיד
אוליגונוקלאוטיד 5'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher5' Pimer המשמש להגברת הכנסה של pGAL4AD
oligonucelotide 5'-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3'		טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher3' Pimer המשמש להגברת הכנסה של pGAL4AD
oligonucelotide 5'-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3'		טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher5' Pimer המשמש להגברת הכנסה של pGADT7
oligonucelotide 5'- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3'		טכנולוגיות DNA משולבות או Thermofisher3' Pimer המשמש להגברת הכנסה של זן שמרים pGADT7
PJ69-4A MatAhttp://depts.washington.edu/yeastrc/ ג'יימס פ, האלאדיי ג'יי, קרייג EA: ספריות גנומיות וזן מארח המיועד לבחירה דו-היברידית יעילה ביותר בשמרים. גנטיקה 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBDד"ר רוברט פייפר מעבדהGal4-DNA מחייב ביטוי doimain פלסמיד
pGal4AD (pPL6343)ד"ר רוברט פייפר מעבדהGal4-הפעלה דומיין ביטוי פלסמיד
100 מ"מ צלחות פטריKord-Vallmark נמכר על ידי VWR2900
125 מ"ל בקבוק PYREX ErlenmeyerFisher ScientificS63270
250 מ"ל בקבוק PYREX Erlenmeyer FisherScientificS63271
1,000 מ"ל בקבוק PYREX Erlenmeyer FisherScientificS63274
2,000 מ"ל בקבוק PYREX Erlenmeyer FisherScientificS63275
20 X 150 מ"מ צינור תרבית חד פעמיThermofisher14-961-33
פיפט-איידדראמונד4-000-100
5 מ"ל פיפטה סרולוגיתדנווילP7127
10 מ"ל פיפטה סרולוגיתדנווילP7128
25 מ"ל פיפטה סרולוגיתדנווילP7129
1,000 מ"ל PYREX גריפיןפישר סיינטיפיק02-540P
1,000 מ"ל PYREX בקבוק אחסון מדיה לשימושפישר סיינטיפיק06-414-1D
1,000 מ"ל צילינדר מדורגפישר סיינטיפיק08-572-6G
SpectraMax 190מכשיריםהמשמשים למדידת הצפיפות האופטית של תאים
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000ספקטרופוטומטר המשמש לכימות כמות ה-DNA
UV אלקטרוני טרנס-אילומינטורUltra LumMEB 20המשמש להדמיית DNA בג'ל אגרוז אתידיום ברומיד
P1000 גילסון פיפטמןפישר סיינטיפיקF123602G
P200 גילסון פיפטמןפישר סיינטיפיקF123601G
P20 גילסון פיפטמןפישר סיינטיפיקF123600G
P10 גילסון פיפטמןפישר סיינטיפיקF144802G
1250 ומיקרו; L טיפים פיפטה שמירה נמוכהGeneMateP-1236-1250
200 ומיקרו; טיפים לשימור פיפטות LLowVWR10017-044
10 ומיקרו; L XL קצות פיפטה שמירה נמוכהVWR10017-042
50 מ"ל צינור חרוטיVWR490001-627
15 מ"ל צינור חרוטיVWR490001-621
מגרד תאיםדנוויל סיינטיפיקTC9310
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהארה"ב מדעי1615-5500
HClפלוקה אנליטי318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
אפליקטורים מעץSolon Care55900
Eppendorf microcentrifuge 5424Fisher Scientific05-400-005מיקרוצנטריפוגה
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381צנטריפוגה ספסל
Amersham ECL Rabbit IgG, AB שלם מקושר HRP (מחמור)GE HealthcareNA934-1MLנוגדן משני
Amersham ECL עכבר IgG, מקושר HRP Ab שלם (מכבשים)GE HealthcareNA931-1MLנוגדן משני
SuperSignal West Pico מצע כימילומינסנטThermo FisherScientific 34080פתרון זיהוי ECL
חממת איזוטמפThermo Fisher חממה מדעית
Mutitron 2INFORS HTחממת טלטול
איזוטמפ בקרה דיגיטלית אמבט מים דגם 205פישר סיינטיפיקאמבט מים
Y2H עכבר ספריית cDNA ב-Y187 (רקמת פאן)Clontech630482ספריית cDNA זמינה מסחרית ספריית cDNA
עכבר Y2H ב-Y187 (מוח עכבר)Clontech630488ספריית cDNA זמינה מסחרית
pGADT7 AD וקטורClontech630442וקטור AD זמין מסחרית המאכלס ספריות cDNA רבות
pGBKT7 DNA-BD וקטורClontech630443 זמין מסחרית DNA-BD וקטור
ביולאז DNA פולימראזביוליןBIO-21042DNA פולימראז המשמש לסעיף 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal CyclerBioExpressP-6050-60pcr מכונת
TempAssure 0.5 מ"ל צינורות PCRארה"ב סיינטיפיק1405-8100
מוצרי מחקר ערכת הכנה DNA החיים חוזר מולקולריים

מקורות

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DEEPNDNAPCR
מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.