מאמר שיטה

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

DOI:

10.3791/57804

⸱

17 ביולי 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר מלווה של שיפוץ נרחב של רקמת שומן בעיקר דרך adipocyte היפרטרופיה. צמיחה adipocyte קיצוניים גורמת תגובה המסכן אינסולין, היפוקסיה המקומי של דלקת. על ידי המרצת את הבידול של adipocytes לבן פונקציונלי של אבות, היפרטרופיה הרדיקלית של האוכלוסייה adipocyte ניתנת למניעה, כתוצאה מכך, ניתן לשפר את הבריאות המטבולית של רקמת שומן יחד עם הפחתה של דלקת. כמו כן, על ידי גירוי של הבידול של חום בז/adipocytes, הוצאות האנרגיה של הגוף הכולל ניתן להגדיל, וכתוצאה מכך ירידה במשקל. גישה זו יכולה למנוע ההתפתחות של השמנת יתר morbidities שיתוף כגון סוכרת מסוג 2 ומחלות לב וכלי דם.

מאמר זה מתאר את הבידוד הרחבה, הבידול של adipocytes לבן ובייז של תת-קבוצה של רקמת שומן אנושי תאי אנדותל המבטאים במשותף את סמני CD34 ו- CD31. השיטה הוא זול יחסית ואינו מהגידולים. זה דורש גישה אנושית רקמת שומן ומתאים בתחנה תת עורית הדגימה. עבור פרוטוקול זה, רקמת שומן טריים דגימות מן הנבדקים חולנית [אינדקס מסת הגוף (BMI) > 35] נאספים במהלך הליכי ניתוח בריאטרי. שימוש של immunoseparation רציפים של השבר בכלי הדם סטרומה, מספיק תאים מיוצרים מ קטנה כמו 2-3 גרם של שומן. תאים אלה ניתן להרחיב בתרבות במשך 10-14 ימים, יכול להיות cryopreserved, שומרים על תכונותיהם adipogenic עם passaging עד מעבר 5-6. התאים מטופלים במשך 14 ימים עם קוקטייל באמצעות שילוב של אינסולין אנושי ואגוניסט-רוזיגליטזון את PPARγ adipogenic.

מתודולוגיה זו יכול לשמש להשגת הוכחת הרעיון ניסויים על המנגנונים המולקולריים לנהוג adipogenic תגובות בתאי האנדותל אדיפוז, או לסינון תרופות חדשות זה יכולה לשפר את adipogenic של תגובה מכוונת גם כלפי לבן או adipocyte חום בז/בידול. באמצעות ביופסיות תת-עורי קטן, מתודולוגיה זו ניתן לסנן נושאים שאינם-למגיב לניסויים קליניים שמטרתם לעורר adipocytes בז/חום ולבן לטיפול של השמנת יתר, שיתוף morbidities.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחרונה מעידים כי הן בעכברים ובבני אדם, קבוצת משנה של תאים המתגוררים להערכת רקמת שומן יכול להיות מובחן גם2,1,adipocytes לבן או חוםבז/3. פנוטיפ תאים כאלה היא נושא למחלוקת, עם ראיות התומכות תאי אנדותל, שריר חלק/pericyte או קשת של פנוטיפים ביניים4,5,6,7. היקף פיתוח מתודולוגיה זו היה לבחון את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + תאי אנדותל מבודד מן המחסנים שומן שונה מבני מהשמנת יתר. מחקרים אחרים בספרות מתמקדים adipogenic הפוטנציאליים של השבר בכלי הדם סטרומה הכולל או של8,92,אבות adipocyte הידוע. מאז הטכנולוגיה הקיימת כיום ניתן לייעד באופן ספציפי רקמת שומן בתאי אנדותל עבור משלוח סמים10, להבין את הפוטנציאל של תאים כאלה לעבור adipogenic אינדוקציה לכיוון adipocytes לבן או בז הוא חשוב טיפולים ממוקדים בעתיד.

קבוצות שונות דיווחו על השילוב של סמני CD34 ו- CD31 כתחליף בידוד תאי אנדותל של רקמת שומן אנושי11,12,13. בדרך כלל, הבידוד מתבצעת באמצעות שני שלבים רציפים ומבחר חיובי באמצעות beads מגנטי. בדו ח זה, immunoseparation באמצעות CD34 + beads מגנטי בשילוב חרוזי פלסטיק CD31 היה מנוצל. מצאנו שיטה זו נעלה immunoseparation מגנטי רציפים ביחס לשימור מורפולוגיה אנדותל המרוצף טיפוסי. כמו כן, הצלחנו לייצר מספיק תאים הדרושים עבור אינדוקציה הרחבה, adipogenic החל מ קטנה כמו 1-2 גרם של שומן. ביופסיה מדגם קטן של שומן תת עורי מספיקה כדי לייצר את הכמות הנדרשת של תאים עבור יישומים במורד הזרם. היבט זה חשוב שעשוי להיות, במיוחד אם תשתמש בשיטה זו להקרנה על היענות אינדוקציה adipogenic של ניסויים.

בניגוד למערכות אחרות דיווחו בספרות, שיטה זו משתמשת רק שני מרכיבים אינדוקציה adipogenic CD34 + CD31 + תאים: אגוניסט PPARγ — רוזיגליטזון —, אינסולין אנושי. חשוב מכך, כמות האינסולין משמש נופל בטווח נורמלי/גבוהה של מחזורי אינסולין post-absorptive בני14. מידת ההיענות לאינסולין של ה תאי במבחנה, נמדד על ידי זרחון Akt, לא לתאם את יכולתם להגיב אינדוקציה קוקטייל. מעניין, באמצעות תנאים קוקטיילים ו ניסיוני זה אינדוקציה, שילוב של לבן, חום בז/תאים התקבלו כפי שנקבע בהתאם לגודלו, מספרים של השומנים תאיים טיפות, הביטוי של סמנים מולקולריים. פרוטוקול זה אינדוקציה פשוטה וחסכונית יחד עם הערכה כמותית של פנוטיפ של התאים למשיב (לבן לעומת בז) מאפשר הקרנה של סוכנים פוטנציאלי יכול לשנות את האיזון של בז הבדיל : לבן adipocytes.

שיטה זו מספקת גם בגישה translational להבנת המנגנון הבסיסי של adipogenesis של אבות אנדותל כלי הדם ברקמת שומן אנושי. באמצעות טכניקה ספציפית בידוד/בידול זו, החוקרים שניתן לחקור מסלולים שונים אחראים adipogenesis בקבוצת משנה של תאי אנדותל כלי הדם מן המחסנים שומן שונות אצל בני אדם רזה והשמנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוועדה המוסדית של לוח סקירה בבית הספר לרפואה במזרח וירג'יניה אישרה אוסף של דוגמאות רקמת שומן אנושי השתמשו במחקר ומחקר. הסכמה בכתב מושכלת נאסף מן המטופלים.

1. הכנת מאגרי מדיה, כלי נגינה

  1. להכין פתרון Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 מ"מ נתרן כלורי, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ מ מגנזיום גופרתי, 0.4 מ מ אשלגן פוספט dibasic, גלוקוז בעובי 5.5 מ מ, 1 מ מ אדנוזין, לערבב אנטיביוטיקה/antimycotic 0.01% (50 µg/mL הפניצילין, 50 µg/mL סטרפטומיצין, 30 µg/mL של גנטמיצין, ng/mL 15 של שהוא גוסס) ו- 10 מ מ HEPES (ה-pH = 7.4). פתרון זה מוכן טרי כל זמן עיכול ואוסף רקמות.
  2. להכין פתרון collagenase טריים: 1 מ"ג/מ"ל של collagenase, הקלד 1, KRBSS; לעשות 3 מ"ל/גרם של שומן. לחמם את הפתרון collagenase ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים לפני העיכול רקמות.
  3. הכנת מאגר בידוד תאי CD34: 2% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1 מ מ EDTA סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
  4. הכן Adipogenesis מדיה: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL של פניצילין/סטרפטומיצין, µL/mL 1.25 של אינסולין אנושי (µg 5/mL או מו 144/mL) ו- µL/mL 0.36 של 2.8 מ"מ רוזיגליטזון (1 מיקרומטר).
  5. להכין 0.3% שמן אדום O (אורו) מניות פתרון (משקל/נפח) על ידי המסת 0.3 g של אורו לתוך 100 מ של אלכוהול איזופרופיל.

2. אדיפוז השבר בכלי הדם סטרומה בידוד

הערה: המחקר כללו עמית חתך הרוחב של שמנים בצורה חולנית סוג 2 סוכרת (T2D), שאינו חולה סוכרת הנושאים, בגילאי 18-65 שנים, שעברו ניתוח בריאטרי Sentara מטבולית, מרכז אובדן משקל של הניתוח (קבוצה הרפואי Sentara, נורפולק, וירג'יניה). לקבלת פטור כלל מחלה אוטואימונית כולל סוכרת סוג 1, מצבים הדורשים טיפול לדיכוי המערכת החיסונית כרונית, תרופות אנטי דלקתיות, thiazolinendiones, השימוש בטבק פעיל, זיהומים חריפה או כרונית או היסטוריה של ממאירות שטופלו תוך 12 החודשים האחרונים. T2D היה מוגדר של גלוקוז בצום של 126 מ"ג/ד"ל או גדול, של גלוקוז של 200 מ"ג/ד"ל או יותר לאחר בדיקת עמידות גלוקוז 2 h או את השימוש בתרופות antidiabetic.

  1. לאסוף אדם עם פגיעה (OM) ואת רקמת השומן התת עורית (SC) (ב) ניסויים שעברו ניתוח בריאטרי.
  2. שמור את אום ו- SC AT נפרד מבחנות שמכילות של האנק Buffered תמיסת מלח עם 50 µg/mL של פניצילין/סטרפטומיצין בטמפרטורת החדר מיד לאחר החילוץ רקמות.
  3. בזהירות לנקות ולהסיר והחלק שהותירה נצרבו של הרקמה באמצעות מספריים ניגבה אתנול 70% ופינצטה כאשר המדגם מגיע במעבדה אחרי החילוץ רקמות.
  4. שוקל את רקמת שומן, למחיצות זה לתוך 5 g (או פחות) aliquots לעיכול collagenase.
  5. דק מינצ 5 גר' AT ב 5 מ של פתרון collagenase ב בקבוקון נצנוץ בטמפרטורת החדר, באמצעות שני זוגות מספריים.
  6. להוסיף נוספים של 10 מ"ל של פתרון collagenase הרקמה טחון על סך 15 מ"ל.
  7. לעכל את הדגימות עבור h 1, 37 ° C, באמבט מים ברעידות רציפה.
  8. חותכים את הקצה מזרק 20 mL כדי להפוך קצה קהה.
  9. גזור ריבוע 9 ס מ x 9 ס מ מ רשת מיקרומטר 250 ודחף אותו באמצע הדרך לתוך צינור חרוטי 50 מ ל באמצעות המזרק הקהה.
  10. יוצקים את הדגימות לתוך מזרק הקהה 20 מ"ל ו מסנן דרך רשת ניילון מיקרומטר 250 לתוך הצינור חרוט 50 מ ל כדי להפריד בין adipocytes וסטרומה תאים לכלי הדם מרקמות מעוכל.
    הערה: אין להשתמש יותר מ 5 g של AT למחזור חרוט 50 מ ל, רשת השינוי לקבל צפופים עקב עודף חומר מעוכל שהותירה.
  11. לשטוף את המבחנה נצנוץ עם 10 מ"ל של KRBBS, שפוך את זה דרך המסנן כדי לאסוף תאים שיורית.
  12. דגירה הדגימות המסוננת עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: השלב זה חשוב לאפשר adipocytes כדי לצוף בחלק העליון של הצינור חלק מהתאים וסקולרית סטרומה להתיישב על החלק התחתון של הצינור.
  13. לנצל מזרק 20 מ ל ו- 20 G x 6 במחט pipetting להסיר את שכבת סטרומה השבר בכלי הדם. ולהעביר אותו ל צינור חרוטי נקי 50 מ.
  14. להוסיף 10 מ של KRBBS ולאפשר את הדוגמאות כדי לשבת על הספסל במשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
  15. חזור על שלבים 2.12 – 2.14 פעמיים.
    הערה: השלבים יבטיח כי אין שום זיהום של תאי סטרומה כלי דם עם adipocytes צף.
  16. למנוע שברים וסקולרית סטרומה שני מחסני על הקרח לשם עיבוד נוסף, כפי שמתואר את השלבים שלהלן.
    הערה: אל תשאירו את התאים על קרח לשעה יותר כמו זה עשוי להשפיע על הכדאיות תא. Adipocytes יכול להיות קפוא בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך או משמש טרי לניסויים.

3. בידוד תאי אנדותל רקמת שומן

  1. ספין שברים וסקולרית סטרומה (SVF) ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
  2. הסר את הדגימות לצנטריפוגה ולאחר יוצקים בזהירות את תגובת שיקוע; שמור בגדר המכילות את התאים SVF.
  3. Resuspend בעדינות את כדורי תא ב 5 מ של PBS.
    הערה: אם יותר מ- 5 גר' דיפו AT היה מעובד aliquots מרובים (ראה שלב 2.4), מאגר כדורי תא ביחד.
  4. ספין הדגימות ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
  5. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל ל- PBS, ולספור את התאים.
    הערה: כאן, מונה אוטומטי תא הניתן שימש לספירת תאים. הכדאיות תא היה מתקבל על ידי ערבוב µL 12 תא השעיה עם 12 µL של פתרון יודיד כתום/propidium (AO/PI) acridine (ראה טבלה של חומרים). המספר הממוצע של תאים לגרם של AT עבור כל דיפו: (א) דיפו אום: 1.69 x ± 4.51 x 10 105 4; (ב) SC דיפו: 1.24 x5 10 ± 6.45 x 104. הכדאיות של התאים שניכם מחסני היה > 90%.
  6. גלולה הדגימות ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
    הערה: פרוטוקול בחירת CD34 immunomagnetic (ראה טבלה של חומרים) הותאמה עבור שלבי 3.7-3.15.
  7. Resuspend בגדר ב µL 100 CD34 בידוד המאגר.
    הערה: ספירת התאים הכולל לדרוש אמצעי האחסון re-השעיה הבאים: (א) < 2 x 107 תאים: resuspend בגדר ב 100 µL; (ב) 2 x 108–5 x 108 תאים: resuspend בגדר ב 1 מ"ל. שלבים 3.9-3.16, הכרכים של ריאגנטים פעם היו מוקטן עבור < 2 x 107 תאים.
  8. להוסיף 10 µL של CD34 קוקטייל, דגירה המדגם למשך 15 דקות, בטמפרטורת החדר.
  9. מוסיפים 5 µL של beads מגנטי, דגירה המדגם למשך 10 דקות, בטמפרטורת החדר.
  10. להוסיף 2.5 מ ל CD34 בידוד מאגר כל מדגם ולמקם את הדגימות לתוך המגנט, למשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
  11. היפוך המגנט עבור 5 s כדי יוצקים את המאגר בידוד.
  12. הסר את הדגימות של המגנט, חזור על השלבים 4 x 3.10 ו- 3.11.
  13. הסר את הצינורית של המגנט ולהוסיף 2 מ"ל CD34 בידוד המאגר.
  14. גלולה התאים ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
  15. Resuspend תא כדורי ב 1 מ"ל CD34 בידוד מאגר ולספור את התאים.
    הערה: כאן, הוא המספר הממוצע של תאים לגרם של AT: (א) דיפו אום: 4.75 x ± 3.36 x 10 104 4; (ב) SC דיפו: 1.06 x4 10 ± 9.53 x 103. פרוטוקול immunobead פלסטיק CD31 הותאמה עבור שלבים 3.16 –  3.34 (ראה טבלה של חומרים).
  16. גלולה תאים ב x 500 g למשך 5 דקות, resuspend בגדר µL 250 של מאגר B, µL 250 שטיפת המאגר.
  17. Resuspend ביסודיות את החרוזים CD31 על ידי vortexing ברכבת התחתית.
  18. הוסף 20 µL של CD31 חרוזים.
    הערה: עקב בתא סכום שנחשב > עונה 1 פרק 106, אמצעי האחסון המידה לפי הקלט של היצרן.
  19. דגירה הדגימה עם נדנדה למשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר.
  20. לצרף מסננת צינור חרוטי סטרילי 50 מ.
    הערה: הפתח גדול יותר של מסננת חייב להיות על העליונה.
  21. לפני ההפרדה תא, להוסיף 1 מ"ל שטיפת המאגר כדי equilibrate את מסננת. החל את התערובת שנוצר תחת צעד 3.16. מסננת.
  22. לשטוף את מסננת עם 5 מ של שטיפת מאגר בתנועה סיבובית על הנפח הכולל של 20 מ. לצרף במחבר צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל וסגור את נעל-סכינים סטריליים.
  23. לצרף את מסננת המחבר. להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר לאורך החומה של מסננת. להוסיף 1 מ"ל מופעל מאגר D לאורך החומה של מסננת. מערבולת המדגם בעדינות, דגירה זה 10 דקות, בטמפרטורת החדר.
  24. להוסיף 1 מ"ל שטיפת המאגר. להפריד את התאים החרוזים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 x.
    הערה: למנוע יצירת בועות אוויר.
  25. . לפתוח את המנעול-סכינים סטריליים ולאפשר את התאים מנותקת לזרום לתוך הצינור חרוט 50 מ. לשטוף את מסננת 10 x עם 1 מ"ל של מאגר לשטוף בכל פעם.
  26. למחוק את המחבר ואת מסננת, centrifuge את הדגימות ב x 300 גרם במשך 10 דקות, ב 4 º C. Resuspend בגדר תא ב- 2 מ של מדיה EGM-2 מלאה לתרבות.
    הערה: המספר הממוצע של תאים לגרם של AT בנקודה זו היא: (א) דיפו אום: 5.92 x ± 4.27 x 10 103 3; (ב) SC דיפו: 4.12 x3 10 ± 2.1 x 103. הכדאיות של תאים בשני מחסני היה מעל 90%.

4. אינדוקציה של Adipogenesis בתאי האנדותל מבודד

  1. לגדל תאי 6-ובכן שטופלו תרביות רקמה צלחות עם מדיה מלאה EGM-2 ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים. החלף את המדיה כל 3-4 ימים עד התאים מגיעים למפגש 80-90%.
    הערה: הכפלת האוכלוסייה היא בין 2-3 ימים.
  2. להרחיב את התאים על ידי ציפוי אותם על צלחות פטרי 100 מ מ, לפצל את התאים פעם 1:3. בשלב זה, התאים הם על מעבר 2.
  3. ספירת התאים באמצעות תא אוטומטי מונה (ראה טבלה של חומרים).
  4. תאי זרע כ 100 – 200,000 לוחות 6-ובכן הבטחת בארות כפולים לכל דיפו ותרבות אותם מוחלט מדיה EGM-2 במשך יומיים.
  5. האחות את כל התקשורת צמיחה ולהחליף אותו עם 2 מ של DMEM/F12 עם 5% FBS ו- µg/mL 50 של פניצילין/סטרפטומיצין עבור הפקד תאים ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של מדיה Adipogenesis (ראה שלב 1.4) עבור התאים טיפול.
  6. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified חממה של2 CO 13 יום, החלפת המדיה המתאימים כל 3-4 ימים.
    הערה: תאים יתחילו לצבור שומנים לאחר 4 ימים של טיפול.
  7. לנהל את אורו, הנילוס אדום מכתים לפי שיטות שפורסמו15–17.
  8. כדי לבודד תאים לחילוץ RNA, התקשורת להסיר לוחות השראה 6-ובכן, לשטוף אותו עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
  9. להוסיף 350 µL של guanidium thiocyanate-פנול-כלורופורם פתרון (ראה טבלה של חומרים) כל טוב, דגירה זה בטמפרטורת החדר למשך 5 – 10 דקות.
  10. לגרד את התאים מהצלחת באמצעות מגרד תא ולהעביר את התאים צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    הערה: הדגימות ניתן לאחסן במקפיא-80 ° C עבור החילוץ-RNA ועיבוד נוסף במועד מאוחר יותר.
  11. תמצית ה-mRNA מדגימות באמצעות הוצאה RNA מותאם פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים).
  12. לבצע תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) כדי להעריך בביטוי הגן באמצעות את הגששים הבאים: אדיפונקטין, UCP-1 ו- CIDEA (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: כאן, RT-PCR פרוצדורות בוצעו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי הבאים: דנטורציה (95 ° C; 15 s), חישול, והסיומת (60 ° C; 1 דקות) מחזורים 40. הדגימות לידי ביטוי גנים עם ערכים CT > 35 נחשבו בלתי מורגשת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול שלנו שואפת לספק גישה במבחנה כדי לקבוע את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + כלי דם תאים מחסני שונים של רקמת שומן אנושי. תרשים זרימה מפושטת מוצג איור 1A. הצעד הראשון באמצעות מבחר חיובית של CD34 לבטא תאים תוצאות > 95% CD34 + תאים באוכלוסייה של תאים מבודדים טרי (איור 1 א'). חשוב לציין, סמן זה אובד לאחר התאים מתורבתים לכמה קטעים. מאחר CD34 נפוצות סמן אבות hematopoietic ו- hematopoietic מגוונת, השלב הבא הנדרשים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוקד של מאמר זה נועד לספק מתודולוגיה עבור בידוד, הרחבה adipogenic אינדוקציה של CD34 + CD31 + תאי אנדותל של מחסני מהבטן, תת עורית של רקמת שומן אנושי.

מתודולוגיות דווחו על בידוד תאי אנדותל של מיטות נימי הדם השונים של מכרסמים או בני אדם המערבות טכניקות בעיקר באמצעות נוגדנים CD31 או fluorescently עם התווית או מצמידים beads מגנטי18, 19 , 20 , 21 ,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להכיר בקי מרקז, למתאמת הקלינית במרכז Bariatric Sentara, על הסיוע עם התהליך של החולה ההקרנה ואני מסכים. מחקר זה נתמך על ידי R15HL114062 כדי Dobrian ד לימור קלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות

ציוד גדול

ארון בטיחות ביולוגית

Nuaire

nu-425-400

חממת תרבית תאים

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

אמבט מים

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

מכונת RT-PCR

< 		p>BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 תאים

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

ספק כוח אלקטרופורזה

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

התקנים מולקולריים

SpectraMax M5

קורא כתמים

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

צנטריפוגה מקוררת

Eppendorf

5810 R

צנטריפוגה שולחנית

Eppendorf

MiniSpin Plus

מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Olympus

BX50

מיקרוסקופ הפוך

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

נתרן ביקרבונט

Sigma-Aldrich

792519

סידן כלורי דיהידרט

Sigma-Aldrich

C7902

אשלגן פוספט מונובסיסי

Sigma-Aldrich

P5655

מגנזיום גופרתי

Sigma-Aldrich

M2643

נתרן כלורי

Sigma-Aldrich

746398

נתרן פוספט מונוהידרט

Sigma-Aldrich

S9638<>

אשלגן chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE מדעי הבריאות הביולוגיים

SH30574.02<>

פניצילין/סטרפטומיצין

Thermo-Fisher Scientific

15070063

עיכול רקמות<>

20 מ"ל מזרק

Global Medical

67-2020

רשת ניילון, 250 ומיקרו; m

Sefar

03-250/50

מחטי צנרת

פופר

7934

מספריים עדינים

כלים מדעיים עדינים

14058-11

מלקחיים לרקמות

ג'ורג' טימן & Co

160-20

קולגנאז, סוג I

Worthington ביוכימיה

LS004196

<

p>

ארה"ב מדעי

5666-4160

TC מטופל

צינורות אפנדורף, 1.5 מ"ל<>

ארה"ב מדעי

1615-5500

צינורות חרוטיים, 15 מ"ל

Nest Scientific

601052

צינורות חרוטיים, 50 מ"ל

Nalgene

3119-0050

בקבוקוני נצנוץ

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation<>

Cellometer

Nexcelom

אוטומטי 2000

שקופיות צלומטר

Nexcelom

CHT4-SD100-002

כתם כדאיות צלומטר

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Prop אידיום יוד

אנטי-CD34 חרוזים מגנטיים

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep מגנט

טכנולוגיות תאי גזע

18000

אנטי-CD31 חרוזי פלסטיק

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x מאגר כביסה

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect טבעת מחבר

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect מאגר ניתוק

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect מסננת תאים S

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC מטופל

4- שקופיות בתא טוב

קורנינג מדעי החיים

354559

מצופה פיברונקטין

4-welled slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

זכוכית לא מצופה

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי (HAMVEC)

מעבדות המחקר של Sciencell

7200

קו תאים ראשוני

מדיה תאי אנדותל (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

ערכה מלאה

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

סרום בקר עוברי (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

ניתוח תאים

שמן צבע O אדום

Sigma-Aldrich

O0625

מוכן באיזופרופנול

96 צלחות באר

USA Scientific

1837-9600

96 באר PCR צלחות

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR פולימראז

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

התחלה חמה, עם מאגר PCR N

תמיסת מגנזיום כלוריד

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 מ"מ סופי בתגובת PCR

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% תמיסת מלאי

אמוניום פרסולפט

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

 >

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

נתרן דודקאל סולפט

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

ממברנת כתמים

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

מאגר חסימת אודיסיאה, Tris

LI-COR

927-50000

< p>נוגדן אנטי-AKT

טכנולוגיית איתות תאים

2920S

עכבר חד-שבטי

נוגדן אנטי-pAKT

טכנולוגיית איתות תאים

9271S

Rabbit polyclonal

נוגדן

Anti-UCP1

Abcam

ab10983

שבטי ארנב

נוגדן IgG נגד עכבר

LI-COR

926-68070

goat Polyclonal, IRDye 680RD

נוגדן IgG נגד ארנב

LI-COR

926-32211

"עז פוליקלונלית, IRDye 800CW

נוגדן IgG נגד ארנב

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% תמיסת פורמלדהיד

מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים

15686

 תמיסה

4% לקיבוע תאים

סרום עיזים רגיל

Vector Laboratories

S-1000

10% תמיסת חסימה

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.תמיסת חדירות 1%

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

הדמיה פלואורסצנטית של תאים

מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף

Corning Life Sciences

356231

גורם גדילה מופחת

DiI עם התווית אצטילציה LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
  2. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
  3. Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
  4. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  5. Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
  6. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  7. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  8. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  9. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
  10. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  11. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  12. Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
  13. Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
  14. Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
  17. Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
  18. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
  19. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
  20. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
  22. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
  24. Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072(2015).
  25. Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
  26. Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644(2015).
  27. Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
  28. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
  29. Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
  30. Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
  31. Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
  32. Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
  33. Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
  34. Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
  35. van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Oil Red OPCREGM2

מאמרים קשורים