הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן
במאמר זה
סיכום
תקציר
השמנת יתר מלווה של שיפוץ נרחב של רקמת שומן בעיקר דרך adipocyte היפרטרופיה. צמיחה adipocyte קיצוניים גורמת תגובה המסכן אינסולין, היפוקסיה המקומי של דלקת. על ידי המרצת את הבידול של adipocytes לבן פונקציונלי של אבות, היפרטרופיה הרדיקלית של האוכלוסייה adipocyte ניתנת למניעה, כתוצאה מכך, ניתן לשפר את הבריאות המטבולית של רקמת שומן יחד עם הפחתה של דלקת. כמו כן, על ידי גירוי של הבידול של חום בז/adipocytes, הוצאות האנרגיה של הגוף הכולל ניתן להגדיל, וכתוצאה מכך ירידה במשקל. גישה זו יכולה למנוע ההתפתחות של השמנת יתר morbidities שיתוף כגון סוכרת מסוג 2 ומחלות לב וכלי דם.
מאמר זה מתאר את הבידוד הרחבה, הבידול של adipocytes לבן ובייז של תת-קבוצה של רקמת שומן אנושי תאי אנדותל המבטאים במשותף את סמני CD34 ו- CD31. השיטה הוא זול יחסית ואינו מהגידולים. זה דורש גישה אנושית רקמת שומן ומתאים בתחנה תת עורית הדגימה. עבור פרוטוקול זה, רקמת שומן טריים דגימות מן הנבדקים חולנית [אינדקס מסת הגוף (BMI) > 35] נאספים במהלך הליכי ניתוח בריאטרי. שימוש של immunoseparation רציפים של השבר בכלי הדם סטרומה, מספיק תאים מיוצרים מ קטנה כמו 2-3 גרם של שומן. תאים אלה ניתן להרחיב בתרבות במשך 10-14 ימים, יכול להיות cryopreserved, שומרים על תכונותיהם adipogenic עם passaging עד מעבר 5-6. התאים מטופלים במשך 14 ימים עם קוקטייל באמצעות שילוב של אינסולין אנושי ואגוניסט-רוזיגליטזון את PPARγ adipogenic.
מתודולוגיה זו יכול לשמש להשגת הוכחת הרעיון ניסויים על המנגנונים המולקולריים לנהוג adipogenic תגובות בתאי האנדותל אדיפוז, או לסינון תרופות חדשות זה יכולה לשפר את adipogenic של תגובה מכוונת גם כלפי לבן או adipocyte חום בז/בידול. באמצעות ביופסיות תת-עורי קטן, מתודולוגיה זו ניתן לסנן נושאים שאינם-למגיב לניסויים קליניים שמטרתם לעורר adipocytes בז/חום ולבן לטיפול של השמנת יתר, שיתוף morbidities.
מבוא
לאחרונה מעידים כי הן בעכברים ובבני אדם, קבוצת משנה של תאים המתגוררים להערכת רקמת שומן יכול להיות מובחן גם2,1,adipocytes לבן או חוםבז/3. פנוטיפ תאים כאלה היא נושא למחלוקת, עם ראיות התומכות תאי אנדותל, שריר חלק/pericyte או קשת של פנוטיפים ביניים4,5,6,7. היקף פיתוח מתודולוגיה זו היה לבחון את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + תאי אנדותל מבודד מן המחסנים שומן שונה מבני מהשמנת יתר. מחקרים אחרים בספרות מתמקדים adipogenic הפוטנציאליים של השבר בכלי הדם ס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הוועדה המוסדית של לוח סקירה בבית הספר לרפואה במזרח וירג'יניה אישרה אוסף של דוגמאות רקמת שומן אנושי השתמשו במחקר ומחקר. הסכמה בכתב מושכלת נאסף מן המטופלים.
1. הכנת מאגרי מדיה, כלי נגינה
- להכין פתרון Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 מ"מ נתרן כלורי, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ מ מגנזיום גופרתי, 0.4 מ מ אשלגן פוספט dibasic, גלוקוז בעובי 5.5 מ מ, 1 מ מ אדנוזין, לערבב אנטיביוטיקה/antimycotic 0.01% (50 µg/mL הפניצילין, 50 µg/mL סטרפטומיצין, 30 µg/mL של גנטמיצין, ng/mL 15 של שהוא גוסס) ו- 10 מ מ HEPES (ה-pH = 7.4). פתרון זה מוכן טרי כל זמן עיכול ואוסף רקמות.
- להכין פתרון collagenase טריים: 1 מ"ג/מ"ל של collagenase, הקלד 1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול שלנו שואפת לספק גישה במבחנה כדי לקבוע את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + כלי דם תאים מחסני שונים של רקמת שומן אנושי. תרשים זרימה מפושטת מוצג איור 1A. הצעד הראשון באמצעות מבחר חיובית של CD34 לבטא תאים תוצאות > 95% CD34 + תאים באוכלוסייה של תאים מבודדים טרי (איור 1 א'). חשוב לציין, סמן זה אובד לאחר התאים מתורבתים לכמה קטעים. מאחר CD34 נפוצות סמן אבות hematopoietic ו- hematopoietic מגוונת, השלב הבא הנדרשים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המוקד של מאמר זה נועד לספק מתודולוגיה עבור בידוד, הרחבה adipogenic אינדוקציה של CD34 + CD31 + תאי אנדותל של מחסני מהבטן, תת עורית של רקמת שומן אנושי.
מתודולוגיות דווחו על בידוד תאי אנדותל של מיטות נימי הדם השונים של מכרסמים או בני אדם המערבות טכניקות בעיקר באמצעות נוגדנים CD31 או fluorescently עם התווית או מצמידים beads מגנטי18, 19 , 20 , 21 ,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להכיר בקי מרקז, למתאמת הקלינית במרכז Bariatric Sentara, על הסיוע עם התהליך של החולה ההקרנה ואני מסכים. מחקר זה נתמך על ידי R15HL114062 כדי Dobrian ד לימור קלו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ציוד גדול | |||
| ארון בטיחות ביולוגית | Nuaire | nu-425-400 | |
| חממת תרבית תאים | Thermo-Fisher Scientific | 800 DH | |
| אמבט מים | Forma Scientific | 2568 | Reciprocal Shaker |
| מכונת RT-PCR < | p>BIO-RAD | CFX96-C1000 | |
| Electrophoresis Box | BIO-RAD | Mini PROTEAN 3 תאים | |
| Transblot Box | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell | |
| ספק כוח אלקטרופורזה | BIO-RAD | PowerPac Basic | |
| ELISA Reader | התקנים מולקולריים | SpectraMax M5 | |
| קורא כתמים | LI-COR | Odyssey | Near Infrared |
| צנטריפוגה מקוררת | Eppendorf | 5810 R | |
| צנטריפוגה שולחנית | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Olympus | BX50 | |
| מיקרוסקופ הפוך | Nikon | TMS | |
| KRBSS Buffer | |||
| HEPES | Research Products International | H75030 | |
| נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| סידן כלורי דיהידרט | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| אשלגן פוספט מונובסיסי | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| מגנזיום גופרתי | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| נתרן כלורי | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| נתרן פוספט מונוהידרט | Sigma-Aldrich | S9638<> | |
| אשלגן chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Adenosine | Acros Organics | 164040250 | |
| Bovine Serum Albumin | GE מדעי הבריאות הביולוגיים | SH30574.02<> | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Thermo-Fisher Scientific | 15070063 | |
| עיכול רקמות<> | |||
| 20 מ"ל מזרק | Global Medical | 67-2020 | |
| רשת ניילון, 250 ומיקרו; m | Sefar | 03-250/50 | |
| מחטי צנרת | פופר | 7934 | |
| מספריים עדינים | כלים מדעיים עדינים | 14058-11 | |
| מלקחיים לרקמות | ג'ורג' טימן & Co | 160-20 | |
| קולגנאז, סוג I | Worthington ביוכימיה | LS004196 | |
| < p> | ארה"ב מדעי | 5666-4160 | TC מטופל |
| צינורות אפנדורף, 1.5 מ"ל<> | ארה"ב מדעי | 1615-5500 | |
| צינורות חרוטיים, 15 מ"ל | Nest Scientific | 601052 | |
| צינורות חרוטיים, 50 מ"ל | Nalgene | 3119-0050 | |
| בקבוקוני נצנוץ
| Kimble | 74505-20 | Tissue Dicing |
| Cell Isolation<> | |||
| Cellometer | Nexcelom | אוטומטי 2000 | |
| שקופיות צלומטר | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| כתם כדאיות צלומטר | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Acridine Orange/Prop אידיום יוד |
| אנטי-CD34 חרוזים מגנטיים | StemCell Technologies | 18056 | Kit |
| EasySep מגנט | טכנולוגיות תאי גזע | 18000 | |
| אנטי-CD31 חרוזי פלסטיק | pluriSelect USA | 19-03100-10 | |
| pluriSelect 10x מאגר כביסה | pluriSelect USA | 60-00080-10 | |
| pluriSelect טבעת מחבר | pluriSelect USA | 41-50000-03 | |
| pluriSelect מאגר ניתוק | pluriSelect USA | 60-00046-12 | |
| pluriSelect Incubation Buffer | pluriSelect USA | 60-00060-12 | |
| pluriSelect מסננת תאים S | pluriSelect USA | 43-50030-03 | |
| Cell Culture | |||
| 6-well Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | TC מטופל |
| 4- שקופיות בתא טוב | קורנינג מדעי החיים | 354559 | מצופה פיברונקטין |
| 4-welled slides | Thermo-Fisher Scientific | 154526PK | זכוכית לא מצופה |
| תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי (HAMVEC) | מעבדות המחקר של Sciencell | 7200 | קו תאים ראשוני |
| מדיה תאי אנדותל (ECM) | ScienCell Research Laboratories | 1001 | ערכה מלאה |
| DMEM/F12 Basal Media | Thermo-Fisher Scientific | 11320082 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Rocky Mountain Biologicals | FBS-BBT | |
| Insulin | Lilly | U-100 | Humalog |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| ניתוח תאים | |||
| שמן צבע O אדום | Sigma-Aldrich | O0625 | מוכן באיזופרופנול |
| 96 צלחות באר | USA Scientific | 1837-9600 | |
| 96 באר PCR צלחות | Genesee Scientific | 24-300 | |
| RNA Extraction | Zymo Research | R2072 | Kit |
| cDNA Synthesis | BIO-RAD | 1708841 | Supermix |
| JumpStart PCR פולימראז | Sigma-Aldrich | D9307-250UN | התחלה חמה, עם מאגר PCR N |
| תמיסת מגנזיום כלוריד | Sigma-Aldrich | M8787-5ML | 3 מ"מ סופי בתגובת PCR |
| dNTPs | Promega | U1515 | |
| TaqMan AdipoQ | Thermo-Fisher Scientific | Hs00605917_m1 | |
| TaqMan CIDEA | Thermo-Fisher Scientific | Hs00154455_m1 | |
| TaqMan RPL27 | Thermo-Fisher Scientific | Hs03044961_g1 | |
| TaqMan UCP1 | Thermo-Fisher Scientific | Hs00222453_m1 | |
| BCA Assay | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | Kit |
| Bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610146 | 40% תמיסת מלאי |
| אמוניום פרסולפט | BIO-RAD | 1610700 | |
| TEMED | BIO-RAD | > 1610800 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Glycine | BIO-RAD | 1610718 | |
| נתרן דודקאל סולפט | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-100 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| ממברנת כתמים | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-SK4 | |
| מאגר חסימת אודיסיאה, Tris | LI-COR | 927-50000 | |
| < p>נוגדן אנטי-AKT | טכנולוגיית איתות תאים | 2920S | עכבר חד-שבטי |
| נוגדן אנטי-pAKT | טכנולוגיית איתות תאים | 9271S | Rabbit polyclonal |
| נוגדן Anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | שבטי ארנב |
| נוגדן IgG נגד עכבר | LI-COR | 926-68070 | goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| נוגדן IgG נגד ארנב | LI-COR | 926-32211 | "עז פוליקלונלית, IRDye 800CW |
| נוגדן IgG נגד ארנב | Jackson ImmunoResearch | 111-025-003 | goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline | Thermo-Fisher Scientific | 10010049 | |
| 37% תמיסת פורמלדהיד | מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים | 15686 | תמיסה 4% לקיבוע תאים |
| סרום עיזים רגיל | Vector Laboratories | S-1000 | 10% תמיסת חסימה |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | 0.תמיסת חדירות 1% |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D1306 | |
| Calcein AM | Thermo-Fisher Scientific | 65-0853-39 | הדמיה פלואורסצנטית של תאים |
| מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף | Corning Life Sciences | 356231 | גורם גדילה מופחת |
| DiI עם התווית אצטילציה LDL | Thermo-Fisher Scientific | L3484 |
מקורות
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metaboli....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
