אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אורגניזמים חיים באופן קבוע צריך להתמודד עם סביבות המשתנות במהלך מחזור החיים שלהם, לרבות שינויי טמפרטורה, pH, ההצטברות של מינים חמצן תגובתי, ועוד. תנודות אלו יכולים להוביל חלבון נפוץ התגלגלות, מצבור, והתא מוות. לכן, התאים התפתחו רשת דינמיים, הלחץ ספציפיות של מלווים מולקולרית, המקיימות פרוטאום "בריא" במהלך מתח תנאים. מלווים תלויית ATP מהווים שיעור מרכזי אחד של משגיחים מולקולרית, אשר לשמש מולקולות שורה ראשונה הגנה, הגנה מפני צבירת חלבון באופן תלויי-מתח. תכונה אחת שאלה מלווים שמשותף הוא היכולת לנצל פלסטיות מבניים שלהם ההפעלה הספציפי מתח, זיהוי של שחרור של הלקוח misfolded.
בנייר זה, אנו מתמקדים ניתוח פונקציונלי ומבניים של אחד כזה מהותי המתוסבכים, המלווה חיידקי מוסדר חמצון-חיזור Hsp33, אשר מגן על חלבונים נגד צבירת במהלך סטרס חמצוני. כאן, אנו מציגים ארגז של טכניקות מגוונות ללמוד פעילות המלווה מוסדר חמצון-חיזור, כמו גם עבור מיפוי הסתגלותי שינויים של המלווה, בבסיס פעילותה. באופן ספציפי, אנו מתארים זרימת עבודה הכולל הכנת חלבונים מופחת באופן מלא, מלא מחמצנים, ואחריו ניתוח של ה מלווה פעילות אנטי-צבירת במבחנה באמצעות פיזור אור, התמקדות מידת פעילות אנטי-צבירת וקינטיקה שלה. כדי להתגבר על ליניאריים תכופים שנצבר במהלך מבחני צבירה, נתאר את השימוש Kfits, כלי גרפי חדשנית המאפשרת עיבוד קל של מדידות קינטי. בכלי זה ניתן להחיל בקלות סוגים אחרים של מדידות קינטי עבור הסרת ליניאריים התאמת הפרמטרים קינטי. כדי לתאם את הפונקציה עם מבנה החלבון, נתאר את ההתקנה של זרימת העבודה של טכניקה ספקטרומטר מסה מבניים, מימן-דאוטריום exchange ספקטרומטר מסה, המאפשר את המיפוי של שינויים הסתגלותי על המלווה, המצע בשלבים שונים של פעילות Hsp33. המתודולוגיה אותן ניתן ליישם אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-ליגנד אחרים.
מבוא
תאים פוגש לעתים קרובות הצטברות של מינים חמצן תגובתי (ROS) הפיק כמו תוצרי לוואי של נשימה1,2, חלבון, שומנים בדם-חמצון-3,-4תהליכים נוספים5, 6,7. למרות תפקיד של ROS מועיל בתהליכים ביולוגיים מגוונים כגון הסלולר איתות8,9 , התגובה החיסונית10, חוסר איזון בין ROS הייצור שלה ניקוי רעלים עשויה להתרחש, המוביל חמצוני להדגיש7. המטרות הביולוגי של ROS הם חלבונים, ליפידי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת חלבונים מופחת באופן מלא, מלא מחומצנת
-
הכנה של חלבון מלא מופחת
הערה: כאן, אנו מתארים ההפחתה של חלבונים המכילים אבץ ושימוש ZnCl2 פתרון כדי לשחזר את המצב חלבון Zn-שילב, מופחתת. הפתרון2 ZnCl ניתן להחליפם או שנמחקו. שימו לב כי הזמן ואת הטמפרטורה של תהליך הפחתת תלוי חלבון יציבות ואת תפקוד, ולכן הוא ספציפי לכל חלבון.- להפשיר את הדגימה חלבון על הקרח ולסובב את זה עד אגרגטים הסרה. דגירה המדגם לפחות 1.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס עם 5 מ מ DTT ו- 20 מיקרומטר ZnCl2 (עד ל-70% ריכוז חלבון).
הערה: הטמפרטורה בשלב זה היא תלוית חלבון, צריך להיות מותאם ליציבות חלבון. - הסר DTT תוך שימוש בעמודות desalting.....
- להפשיר את הדגימה חלבון על הקרח ולסובב את זה עד אגרגטים הסרה. דגירה המדגם לפחות 1.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס עם 5 מ מ DTT ו- 20 מיקרומטר ZnCl2 (עד ל-70% ריכוז חלבון).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שתי השיטות הציג מאפשרים לעקוב אחר פעילות קינטי של הדינמיקה של חלבון אינטראקציות בין מלווה את המצע שלה. יתר על כן, הפרוטוקול הפחתת-חמצון מאפשר הכנת מלווה מופחת באופן מלא, מלא מחמצנים, נותן הבנה מעמיקה יותר של מנגנון ההפעלה של משגיחים המתוסבכים תלויי-חמצון-חיזור.
ראשית, השתמשנו פיזור אור על מנת לבחון את הפעילות תלויי-חמצון-חיזור של המלווה. פיזור אור בוצעה על חלבון CS denatured כימית, תרמית בנוכחות מחמצנים (פעיל) או מופחתת (לא פעיל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בנייר זה, סיפקנו פרוטוקולים עבור הניתוח של פעילות המלווה תלוי-חמצון-חיזור, אפיון שינויים מבניים על הכריכה של חלבון הלקוח. אלה משלימים מתודולוגיות להגדיר מתחמי המלווה-המצע פוטנציאליים ולנתח אתרים אינטראקציה פוטנציאלית.
כאן, אנחנו מוחלים פרוטוקולים אלה עבור אפיון קומפלקס בין מוסדר חמצון-חיזור המלווה Hsp33 עם מצע המלווה למד היטב CS. הצגנו שני סוגים שונים של ניתוחים צבירת חלבון, אשר נבדלים מדינתם קינטי, הראשונית: במהלך דנטורציה כימי, המצע מתחיל תהליך התגלגלות שלו מהטופס denatured, בזמן צבירה תרמי,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים הם אסיר תודה מיטל להריץ מתקפה לדיונים מועיל שלה קריטי הקריאה של המאמר, ואת פטריק גריפין, חברי המעבדה שלו לסיוע שלהם ללא הגבלה בזמן הקמת פלטפורמה ניתוח HDX. המחברים מודים על קרן גרמניה-ישראל (I-2332-1149.9 2012), הקרן הדו-לאומית למדע (2015056), מארי קירי אינטגרציה המענק (618806), הקרן הלאומית למדע (1765/13 ו- 2629/16), ואת המדע הגבול האנושי תוכנית (CDA00064/2014) לתמיכה הפיננסית שלהם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>כימיקלים, ריאגנטים | |||
| אצטוניטריל HPLC בתוספת | סיגמא אולדריץ' | 34998-2.5 ליטר | ממס |
| חומצה פורמית אופטימה LC/MS | פישר כימיקלים | A117-50 | תוסף ממס |
| איזופרופיל אלכוהול, HPLC כיתה | פישר כימיקלים | P750717 ממס | |
| מתנול | פישר כימיקלים | A456-212 | ממס |
| טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן | סיגמא אולדריץ' | 252859 | חומצה |
| טריפלואורואצטית | סיגמא אולדריץ' | 76-05-1 | ממס |
| מים ל- HPLC | סיגמא אולדריץ' | 270733-2.5L-M | ממס |
| ZnCl2, אבץ כלוריד | Merck | B0755416 308 | מגיב |
| DTT | Goldbio | 27565-41-9 | חומר הפחתה |
| PD מיני מלכודת G-25 עמודות GE healthcare | healthcare | 29-9180-07 | עמודת התפלה |
| אשלגן פוספט | תאגיד ביוכימי של ארצות הברית | 20274 | מאגר |
| מי חמצן 30% | Merck | K46809910526 | חומר חמצון |
| ציטראט סינתאז | סיגמא אולדריץ' | C3260 | מצע |
| HEPES חומצה ללא חומצה | סיגמא אולדריץ' | 7365-45-9 | מאגר |
| Gndcl | סיגמא אולדריץ' | G3272-500G | דנטורנט |
| תמיסת דאוטריום כלוריד | סיגמא אולדריץ' | 543047-10G | מאגר |
| תחמוצת דאוטריום 99% | סיגמא אולדריץ' | 151882-100G | ממס |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | חומר |
| הפחתהמיקרו-אינספר 150uL עם פנים ציר & רגליים פולימריות, 29*5 מ"מ | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5 מ"ל בקבוקון חוט קצר שקוף 9 מ"מ חוט, 11.6*32 מ"מ | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| קוורץ קובט | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 פלואורוספקטרומטר | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, ספסל צנטריפוגה | Thermo Scientific | ||
| מד pH , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| עמוד פפסין משותק AffiPro (אורך 20 מ"מ, קוטר 2.0 מ"מ). | AffiPro | ||
| Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | טור אנליטי Waters | ||
| C18 (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| תא ויניל אנאירובי עם דלת Airlock | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap ספקטרומטר מסה | תרמו-פישר מערכת PAL מדעית | ||
| LHX - מערכת רובוטית לטיפול בדגימות HDX | מערכת PAL | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, משאבת XRS משאבת | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS | Thermo Scientific | ||
| Software, כלי תוכנה, חיפוש במאגר | |||
| Kfits: Fit Aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| תוכנת Thermo Scientific Xcalibur | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| תוכנת Chronos (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| תוכנת Proteome Discoverer V1.4 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| תוכנת שולחן עבודה HDX | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html |
מקורות
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
