מאמר שיטה

וזמינותו התקפה אלימה חיידקי מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה

DOI:

10.3791/57844

⸱

27 ביוני 2018

 , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את התקפה אלימה של חיידקים פלנקטוניים או צמוד-השטח באמצעות discoideum ד (אמבה) כמחשב מארח. התקפה אלימה נמדד על פני תקופה של 1 h, המארח הורג הוא לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח התמונה. נדגים את פרוטוקול זה באמצעות החיידק aeruginosa פ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני התקפה אלימה חיידקי מסורתי לערב חשיפה ממושכת של חיידקים במשך מספר שעות, התאים המארחים. במהלך תקופה זו, חיידקים יכולים לעבור השינויים בפיזיולוגיה עקב החשיפה לסביבת הגידול מארח ואת נוכחותם של התאים מארח. פיתחנו assay למדוד במהירות את מצב התקפה אלימה של חיידקים כי למזער את מידת שאליו הבקטריה גדלה בנוכחות התאים המארחים. חיידקים, amoebae מעורבבים יחד, ותשמרו על מטוס יחיד הדמיה באמצעות רכיב pad אגר. ההליך משתמש פלורסצנטיות בתא יחיד הדמיה עם אסתר calcein-acetoxymethyl (calcein-AM) כמחוון של בריאות התא המארח. ידי קרינה פלואורסצנטית של התאים המארחים ניתוח לאחר h 1 של חשיפה של התאים המארחים חיידקים באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. התמונה ניתוח תוכנה משמשת לחישוב בעל אינדקס הרג המארח. בשיטה זו נעשה שימוש כדי למדוד התקפה אלימה בתוך פלנקטוניים ומחוברת משטח Pseudomonas aeruginosa תת אוכלוסיות במשך השלב ההתחלתי של ביופילמים, שעשוי להיות מותאם חיידקים אחרים ושלבים אחרים biofilm הצמיחה. פרוטוקול זה מספק שיטה מהיר וחזק של מדידת התקפה אלימה, מונע רבים של המורכבויות המשויכות את הצמיחה ואת התחזוקה של שורות תאים בתרבית. התקפה אלימה פנוטיפים נמדד כאן באמצעות amoebae יש גם מאומתים באמצעות העכבר מקרופאגים. בפרט, זה וזמינותו שימש להקים את התקפה אלימה upregulates מצורף משטח aeruginosa פ.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום חיידקי הוא אחד הגורמים המובילים התמותה האדם וחיות1,2. היכולת למדוד התקפה אלימה של חיידקים תרבויות או biofilms חשוב הגדרות בריאות ומחקר. כאן, אנו מתארים שיטה רב תכליתי, מהירה, פשוטה יחסית לכמת התקפה אלימה חיידקי. האורגניזם האיקריוטים Dictyostelium discoideum (אמבה) משמש האורגניזם המארח מודל. ד discoideum שימש כמארח כדי לזהות גורמים התקפה אלימה Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ)3,4,5 ו אחרים חיידקים6,7 ,8 , היא חשופה בעיקר אותם התקפה אלימה גורמים להרוג תאים בתרבית של כולל סוג III הפרשת9,10. מבחני התקפה אלימה הקודם באמצעות discoideum ד מעורב חשיפה ממושכת של חיידקים עם תאים discoideum ד במהלך שעות3,4,5. הפרוטוקול, כאן, מציג שיטה מהירה של קביעת התקפה אלימה באמצעות זה אמבה. פרוטוקול זה (איור 1) מתאר כיצד: (1) לגדל את amoebae axenically (בהיעדרו של חיידקים), (2) לגדול חיידקים על וזמינותו, (3) להכין חיידקים, התאים המארחים עבור מיקרוסקופ, (4) לבצע epifluorescence מיקרוסקופ, ולנתח (5) אמבה קרינה פלואורסצנטית.

Amoebae בתחילה קווצות שער החוצה מן המלאי קפוא, גדל על מדשאה של Escherichia coli (e. coli), שבו amoebae מייצרים נבגים. הנבגים האלו הם הרים, מחוסן לתוך בינוני מועשר לצמיחה axenic. Amoebae מתוחזקים באמצעות צמיחה axenic בתנאים עשירות עד שהם יהיו מוכנים להיות מעורב עם חיידקים להערכה של התקפה אלימה חיידקי. ההישרדות או מותו של amoebae זה לכמת על ידי מדידה של זריחה של calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), אשר הוא ביקע מאת תאיים esterases, ובכך, מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית11,12. Amoebae חיה להפגין מעט או ללא קרינה פלואורסצנטית ואילו הדגיש, תאים הגוסס לזרוח באופן אינטנסיבי. תוצאה זו נובעת תיאגוד מעט או ללא calcein-אם amoebae בריאה, התאגדות, המחשוף של המצע לחוץ amoebae13. התנהגות זו היא בעיקר נבדלת זריחה calcein-אם תאים בתרבית של11,14,15,16.

חיידקים ייבחנו על התקפה אלימה גדלים בנפרד. כאן, אנו נתאר כיצד למדוד את התקפה אלימה של המחלה הזדמנותית aeruginosa פ וכן פירוט איך לכמת את התקפה אלימה של יצורי (שחייה), צמוד-פני אוכלוסיות משנה. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם כדי לבדוק את התקפה אלימה של חיידקים אחרים. במקטע תוצאות נציג, אנו מראים כי התקפה אלימה מופעלת בצמוד-משטח תאים והוא נמוך פלנקטוניים תאים, אשר דווחה בעבר13. מופעל התקפה אלימה צמוד-משטח aeruginosa פ הורג amoebae ואילו-מידבק תאים פלנקטוניים שנצרכים על ידי amoebae. אם אך ורק הוא להיות לבדיקה של התקפה אלימה של יצורי חיידקים, חיידקים יכולים להיות בתרבית צינורות רגילים תרבות יותר מאשר באמצעות צלחות פטרי כמפורט בפרוטוקול.

הצמיחה של amoebae ותרבויות aeruginosa פ חייבים להיות מתואמים כך aeruginosa פ תרבויות להגיע שלב הצמיחה המיועד ואילו amoebae גדלים על מצב יציב בתנאים עשירות. מצב זה מחייב בדרך כלל amoebae תרבויות אלקליניים לפחות יום אחד לפני כאשר הם מעורבבים עם חיידקים. Amoebae וחיידקים הם מתאושש באמצעות רפידות אגר, שיתוף incubated לשעה, עם תמונה ברזולוציה נמוכה (10 X, מפתח נומרי 0.3) חלבון פלורסצנטיות אובייקטיבי, ירוק (GFP) מסננים באמצעות מצלמה הדמיה. הניתוח יכול להתבצע באמצעות תוכנת ImageJ זמינה בחופשיות או אישית התמונה ניתוח תוכנה. הניתוח שלנו בוצעה באמצעות התוכנה שלנו שנכתבו באמצעות חבילת13ניתוח מדעי. התוכנה צריכה ליצור מסיכה באמצעות שלב חדות התמונה, לחלץ ערכים זריחה האזורים עם מסיכה בתמונה זריחה. קרינה פלואורסצנטית ערכים הם בממוצע לפחות מאה תאים, וכתוצאה מכך אינדקס הרג מארח מספריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים ניסיוני בוצעו ב אוניברסיטת קליפורניה, אירווין.

1. מאגרי ופתרונות

  1. להכין מרק Lysogeny (LB) בבקבוק זכוכית 1 ליטר על-ידי הוספת 25 גרם מיקס LB-מילר 1 ליטר של מים מזוקק פעמיים (ddH2O). צלחות פטרי, הוסיפו של 20 גרם נוספים של אגר. אוטוקלב לחטא. יוצקים 25 מ של אגר מותכת בינוני 10 ס מ קוטר פטרי ולאפשר שבמהלכו בטמפרטורת החדר. לאחסן מדיה נוזלי בטמפרטורת החדר, פלטות אגר ב 4 º C.
  2. הכנת לוחות Peptone שמרים גלוקוז (באסה) בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 1g של D-גלוקוז, 2 גר' peptone, 0.25 g של שמרים לחלץ, 4.2 גר'2פו ח'4, g 5.1 של נה2HPO47 שעות2O ו- 25 גרם אגר ב- 1 ליטר של ddH2 או אוטוקלב לחטא. שופכים 25 מ של אגר מותכת לתוך צלחות פטרי בקוטר ס מ 10 ולאפשר שבמהלכו בטמפרטורת החדר. חנות ב 4 º C.
  3. הכנת Peptone S (PS) בינוני בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 10 גרם של peptone, 7 גר' שמרים לחלץ, 15 גרם של D-גלוקוז, 0.12 גר' נה2HPO47 שעות2O, 1.4 גר'2פו ח'4, 40 µg של ויטמין B12 , ו- 80 µg חומצה פולית 800 מיליליטר ddH2O. לכייל מד pH אלקטרוני באמצעות pH 4 ותקנים pH 7 אם לא נעשה שימוש מד pH תוך יום.
    1. למדוד את רמת החומציות של המדיום PS באמצעות מד pH. להוסיף 5 מ' קו או 5 מ' H3פו4 כדי להתאים את ה-pH ל 6.5. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH2O. מסנן לחטא באמצעות מסנן ואקום מיקרומטר 0.22 ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: להמשיך בזהירות ההתאמות pH מאת ללבוש ציוד מגן כולל כפפות, ביגוד מגן, הגנה העין, ופונים הגנה.
  4. הכינו 10 x פיתוח מאגר ראשוני (DB') מאגר בבקבוק זכוכית 1 ליטר על-ידי הוספת 3.4 גרם2פו ח'4, 13.4 גר' נה2HPO4 7 שעות2O ו- ddH2O הנפח הכולל של 800 מ ל. לכייל מד pH אלקטרוני באמצעות pH 4 ותקנים pH 7 אם לא נעשה שימוש מד pH תוך יום.
    1. למדוד את רמת החומציות של המאגר באמצעות מד pH אלקטרוני. להתאים את ה-pH ל 6.5 על-ידי הוספת בעדינות 5 מ' קו או 5 מ' H3פו4 לפי הצורך. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH2O ולחטא על-ידי autoclaving. לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: להמשיך בזהירות ההתאמות pH מאת ללבוש ציוד מגן כולל כפפות, ביגוד מגן, הגנה העין, ופונים הגנה.
  5. להפוך 1 x פיתוח מאגר (DB) על-ידי ערבוב 100 מ של 10 x DB' מאגר עם 1 מ"ל של עיקור MgCl 2 מ'2, 1 מ"ל של עיקור CaCl 1 מ'2. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר בתוך בקבוק זכוכית 1 ליטר באמצעות ddH סטיריליים בלוק של2O. חנות בטמפרטורת החדר.
  6. הכנת PS:DB בינוני בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 100 מ של מדיום PS מעוקר, 100 מ של עיקור 10 x DB' מאגר, ו- ddH סטיריליים2O כדי הנפח הכולל של 1 ל' השלמה עם 1 מ"ל של עיקור 2 מ' MgCl2 ו 1 מ"ל של עיקור מ' 1 CaCl 2-חנות ב 4 º C.
  7. להכין את הפתרון מניות calcein-אם על-ידי הוספת µL 50 של דימתיל סולפוקסיד 50 µg של calcein-אם במכל פלסטיק המסופקים על ידי היצרן. חנות ב-20 ° C.

2. צמיחה ותחזוקה של Amoebae

  1. לגדל זן e. coli B/r17 כמקור מזון עבור amoebae במהלך תקופת הגידול הראשוני. רצף של e. coli B/r של מניה קפוא המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס על גבי צלחת אגר ליברות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשיג אחת המושבות.
  2. לחסן מושבה בודדת של e. coli B/r לתוך 2 מ ל LB בינוני, דגירה תוף רולר או מטרף ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. להביא e. coli תרבות הלילה טמפרטורת החדר. באמצעות מקל עץ, לחסן amoebae של מניה קפוא שמרו ב-80 מעלות צלזיוס לתוך µL 750 של התרבות בין לילה.
    הערה: שימוש discoideum ד זן AX3, בעל יכולת של צמיחה axenic18. שלב זה אינו מחייב צמיחה axenic, אבל והשלבים יהיה הדרישה שלו.
  4. מיד להוסיף 700 µL של amoebae -e. coli התערובת לצלחת Peptone שמרים גלוקוז (ג'יפ). להפיץ את התרבות באופן שווה על פני השטח של הצלחת בהטיית גב וושוב גם הוא צד אל צד כנדרש. הימנע משימוש מפזר.
  5. מקם את הצלחת ללמוד עם אגר פונה כלפי מעלה בתוך קופסה השומר על לחות גבוהה. שימוש שני מיכלי פלסטיק חד פעמיות (183 ס"מ על 183 ס"מ x 91 ס מ) נערמו בראש אחד את השני. למלא את המיכל התחתון כ 25 מ ל מים ומניחים את המיכל העליון עם כמה פתחים 0.5 ס מ קוטר קדח דרך הריצוף של המיכל כדי לאפשר לחות להעביר המים הקרים המיכל העליון.
  6. תקופת דגירה של ג'יפ צלחת ותיבת ב 22 ° C של 4-5 ימים עד אמבה נבגים הם נצפו גדל קרוב לפני השטח של הצלחת (איור 2). השתמש חממה בקירור כדי דגירה צלחות ולא הדגירה בטמפרטורת החדר.
    הערה: לאחר נבגים גדלו, הם נשארים קיימא על צלחות למשך מספר שבועות כאשר הוא מאוחסן ב 4 º C. חנות את הלוחיות עם אגר צד פונה כלפי מעלה. לאחר 3-4 ימי דגירה, אזורי, אגף בתוך הדשא חיידקי יכול להיות שנצפו, מעידות על תחילת הנבגה אמבה.
    1. שימו לב amoebae קטן נבגים מעל פני השטח צלחת אחרי 4-5 ימי דגירה (איור 2).
      הערה: לא גדלים על amoebae במשך יותר משבוע, ככל שאיכות הנבגים הקטנת מעבר פרק זמן זה.
  7. איסוף amoebae נבגים כדי להתכונן הגידול axenic של amoebae מאד טיפ פיפטה עקר 1 מ"ל מקביל פני השטח של הצלחת. לאסוף חצי של 10 ס מ פטרי נבגים.
    הערה: להימנע מלגעת בקצה השטח של צלחת אגר תנועה זו לאסוף מספר רב של e. coli.
  8. Resuspend את amoebae על קצה פיפטה על ידי הטבעית הטיפ לתוך 1 מ"ל של PS בינוני בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
  9. להעביר את התערובת חוסנו לתוך בקבוקון 250-mL המכיל 25 מ של המדיום PS בתוספת הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic-0.25 x ריכוז.
    הערה: אחסן את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic כמו aliquots µL 250 ב-20 ° C. הימנע מחזורים חוזרים ונשנים של מפשיר, הקפאה של פתרון זה כמו זו עלולה להפחית את יעילותה.
  10. לגדול amoebae axenically ב 22 ° C ב שייקר מסתובב ב 100 סל"ד. עבור וזמינותו התקפה אלימה בשלב 5, מגדלים תאים צפיפות אופטית הנמדד על 600 nm (OD600) של 0.2 עד 0.5.
    הערה: שלב זה דורש 3-4 ימים של גידול מימי חיסון (שלב 2.7). אם התאים גדלו צפיפות גבוהה יותר, לדלל את התרבות בחזרה ב- PS בינוניים יתר600 של 0.05 או נמוך, לגדול חזרה יתר600 של 0.2-0.5.

3. צמיחת aeruginosa פ

  1. לבחור מושבה בודדת של aeruginosa פ מ צלחת LB לחסן אותו לתוך 2 מ ל PS:DB תרבות, לגדול בין לילה ב 37 ° C כדי רוויה.
    הערה: לא להוסיף את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic לתקשורת PS:DB.
  2. לדלל את בטחונות תרבות לילה או 1:1,000 לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 ס מ באמצעות PS:DB. אם אך ורק הוא להיות לבדיקה של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים, לגדול תרבויות באמצעות צינורות תרבות המקובלת במקום. נתנער התרבות rotator benchtop שוכן בגובה 100 סל"ד ב 37 º C.
  3. קציר תרבויות בנקודות זמן מסוים כדי להבטיח הפארמצבטית. ב- 30 דקות עד h 1 לפני הערכת התקפה אלימה, להכין את רכיב pad אגר כמתואר בסעיף 4.
    הערה: התקפה אלימה ב פ aeruginosa הנגרמת על ידי כ 8 שעות של צמיחה על משטחים.
  4. כדי לבודד את תאי השטח-attached, להסיר את המדיום הנוזלי הפטרי לשטוף מיד עם 1 מ ל DB המאגר כדי להסיר תאים פלנקטוניים, פנה/י מיד לשלב 5.1.
    התראה: אנחנו לא שוטפים יותר מ 30 s כמו זה perturb, ניתוק צמוד-משטח תאים, עשוי להשפיע על המדידה התקפה אלימה.
  5. בידוד תאי פלנקטוניים, להעביר 10 µL של התרבות צלחת פטרי צלחת פטרי נקי, פנה/י מיד לשלב 5.1.

4. מיקרוסקופ - הכנת משטח אגר

  1. להכין רפידות אגר בערך 30 דקות ל- 1 h לפני amoebae מוכנים להיות מעורב עם aeruginosa פ.
  2. מיקרוגל 50 מ של 1% (w/v) אגר במאגר DB בבקבוקון 250 מ. לערבב כל 20 s עד גושים של אגר נעלמים.
  3. מגניב של אגר מותכת על-ידי הצבתו באמבט מים טרופה 55 ° צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. להוסיף µL 15 של הפתרון מניות calcein-אם-15 מיליליטר אגר מותכת צינור חרוטי. לערבב על-ידי היפוך בעדינות את הצינור 4 - 5 פעמים, פנה/י מיד לשלב הבא.
    הערה: לבצע שלב זה בשפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן 15 מ"ל. אל תשתמש/י מיכל זכוכית עבה כמו זה יגרום את אגר שבמהלכו מהר מדי.
  5. שופכים את התערובת אגר מותכת על גבי צלחת זכוכית 12 ס"מ x 10 ס"מ ולאפשר את אגר שבמהלכו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחתוך משטח אגר הקרושה למקטעים קטנים יותר של 1.5 ס מ x 1.5 ס מ על ידי הצבת לוח הזכוכית על רשת מודפסת חיתוך לאורך הרשת בעזרת סרגל מתכת.
  6. שמור את הג'ל להתייבש בתוך קופסה לחים עד שזה מוכן לשימוש.

5. מיקרוסקופ - הכנת המדגם חיידקים-אמבה עבור הדמיה

  1. כדי assay של התקפה אלימה של צמוד-משטח תאים חיידקיים, להוסיף 10 µL של תאים אמבה מהשלב 2.10 צמוד-השטח חיידקים מהשלב 3.4.
    הערה: שלב זה מתאר את ערבוב של amoebae עם חיידקים.
  2. כדי assay של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים, מערבבים µL 10 תאים אמבה מהשלב 2.10 עם 10 µL של חיידקים פלנקטוניים מהשלב 3.5.
    הערה: לא רחץ את התאים אמבה תוצרת axenically (-יתר600 של 0.2 עד 0.5) לפני ערבוב עם החיידקים. אין התפתחות החיידק יתקיימו בתרבות אמבה עקב השימוש של הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic.
  3. מיד במקום משטח אגר calcein-אם 1.5 ס מ x 1.5 ס מ שלב 4.5 מעל תערובת חיידקים-אמבה על פני צלחת פטרי.
    הערה: מקום משטח אגר מעל התערובת באמצעות תנועה חלקה מהירה. אל תסירו משטח לאט לתוך התערובת כמו תנועה זו נוטה לקדם תאים לעבר הפריפריה, מן החלק התחתון של משטח. שלב זה יבטיח כי חיידקים, amoebae הם אחיד מעורב, ללא יכולת תנועה וסלולרי כי שני סוגי מוגבלים על אותו מישור.
  4. להסיר עודפי נוזלים על-ידי pipetting בעדינות את כל הנוזל הנותר סביב משטח אגר. לאפשר הפטרי לייבוש למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מכסה עם הפטרי עם מכסה, דגירה התערובת אמבה קיבוע-חיידקים בטמפרטורת החדר במשך נוספים 40 דקות להמשיך לשלב 6.1.
    הערה: חשוב דגירה כל דוגמאות עבור אותה כמות של זמן, כמו עליות פלורסצנטיות רקע לאורך זמן. זמן הדגירה של 1 h מומלץ. Incubations יותר מ 1 h הם פחות לשחזור כפי amoebae תאים עשויים להתחיל פרץ.

6. מיקרוסקופ - ייבוא תמונות

  1. Amoebae תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מסוגל לרכוש תמונות זריחה brightfield וירוק. עבור ירוק פלורסצנטיות, השתמש במסננים חלבון (GFP) זריחה ירוק עם 474/27 nm ו 525/45 ננומטר עירור, פליטה, בהתאמה. השתמש מטרה (≥0.3 מפתח נומרי) X 10 כדי amoebae את התמונה.
    הערה: calcein-AM באגר תגרום amoebae גוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית בערוץ פלורסצנטיות ירוק. Amoebae בריא אינם אחרת פלורסנט.
  2. להתאים את רכישת פעמים לניגודיות שלב, ערוצי ה-GFP כדי להגביל את phototoxicity, ולמטב את הטווח הדינמי של התמונה עוצמות. החלף את הניגוד שלב ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית במידת הצורך.
    הערה: השתמש חשיפות 100-200 ms עבור שלב חדות, זריחה GFP במידת האפשר. שמור את הגדרות החשיפה, מכשיר ללא שינוי לאורך כל הניסוי כולו. . זה קריטי עבור מחשוב מדד הרג המארח.
  3. לרכוש תמונות עבור תאים אמבה לפחות 100 על מנת לקבל נתונים סטטיסטיים טוב לחישוב המארח הרג אינדקס.

7. תמונה ניתוח ואינדקס הרג מארח

  1. לבצע ניתוח התמונה באמצעות ImageJ.
  2. לפתוח את קובץ התמונה של ניגודיות שלב ב ImageJ על ידי לחיצה על קובץ | פתוח ובחירת התמונה. התאם את הסף על ידי לחיצה על תמונה | ניתוח | סף. התאם את הסף העליון והתחתון כדי לבחור רק את עוצמת שיא (איור 3א).
  3. המירו את התמונה לערך בינארי על ידי לחיצה תהליך | בינארית | להפוך בינארי. למלא חורים על-ידי בחירה תהליך | בינארית | למלא חורים.
    הערה: שימוש בדמותו באיור 1 כמקור, צעדים 7.1-7.2 יפיק תמונה שבה amoebae וחיידקים צמוד-משטח מופיעים אזורים כהים (איור 3ב').
  4. להבטיח כי תיבות אזור ו מתכוון וערך אפור מוכנסים נתח | לקבוע מידות. למדוד את גודל משוער amoebae על-ידי בחירת הכלי אליפסה בסרגל הכלים הראשי. לחץ על ניתוח | מדד ושים לב האזור של נציג amoebae.
  5. ליצור מסכות amoebae על ידי לחיצה נתח | לנתח חלקיקים. בתיבה גודל, הזן את האזור כוללים את amoebae אבל לא לכלול את החיידקים. בחר מסכות בשורת התפריט הנפתח של הצג את האפשרות. ודא כי התיבה להוסיף מנהל מסומנת.
  6. לחץ על OK תמונה המציגה רק את amoebae ואת מנהל רועי הדו-שיח תופיע (איור 3ג').
  7. פתחו את התמונה פלורסצנטיות באמצעות קובץ | פתוח ובחירה את הקובץ המתאים. בחר את כל האזורים של רועי מנהל על-ידי החזקת מקש shift לחוץ ולאחר לחיצה על כל אזור ברשימה (איור 3ד').
  8. לחץ על לחצן למדוד רועי מנהל. פעולה זו תפתח חלון תוצאות הצגת בערך כלומר העוצמה של כל אמבה.
  9. להעתיק את הערכים פלורסצנטיות עבור כל אמבה לתוכנית של גליון נתונים ולחשב המארח הורג אינדקס על ידי לקיחת הממוצע של כל הערכים זריחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גדלנו פראי-סוג aeruginosa פ זן PA1419 או ΔlasR זן20 ברקע PA14 אותו ב- 6 ס מ קוטר פטרי, לבדיקה של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים וצמוד-פני השטח. תרבויות חוסנו של יחיד-המושבות לתוך תרבויות PS:DB, גדל בין לילה תרבות צינורות תוף רולר ב 37 ° C כדי הרוויה, מדולל מטריים PS:DB, בוגר עבור 8 שעות ב- 6 צלחות פטרי בקוטר ס מ, רועדת-100 סל"ד, ואת פלנקטוניים צמוד-השטח פ aeruginosa תת אוכלוסיות היו מבודדים כמתואר בסעיף 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה כמותיים כדי assay התקפה אלימה ב aeruginosa פ. פרוטוקול זה עשוי להיבדק עם חיידקים אחרים. עם זאת, חשוב לזכור כי מדיום הגידול צריך להיות תואם תנאי הגידול של אמבה. בפרט, אנו יש אופטימיזציה הפרוטוקול באמצעות PS:DB כמו מדיום הגידול חיידקי. אם נעשה שימוש מדיה אחרת, ייתכן צורך לבצע צמיחה התקשורת בלבד פקד שבו ישנם תאים חיידקיים לא נוכח כדי לאמת כי המדיום תואמת amoebae.

בשיטה זו ניתן להרחיב assay התלות שלב הצמיחה של התקפה אלימה. בפרט, ניתן לגדל תרביות חיידקים למגוון ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KP ככל כתב, כתב היד המתוקן. KP לבצע הניסויים וניתוח. עבודה זו נתמך על ידי פרס מעבר קריירה הלאומית המכונים לבריאות (NIH) (K22AI112816) כדי בשם

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
אגר בקטו, מיובשBD Difco214010
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה (100X)Life Technologies15240062Aliquot < 1 מ"ל ואחסן ב-20 מעלות; C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)Life TechnologiesC34852Calcein Acetoxymethyl (AM)
סידן כלורי, סיגמא-אולדריץ' נטול מיםC1016
D-גלוקוזפישר כימיקלD16500דקסטרוז
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץD5879
חומצה פוליתסיגמא-אולדריץ'F8758
LB-MillerBD Difco244620
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ'M8266
תמצית שמריםאוקסואידLP0021
פפטון מיוחדאוקסואידLP0072
אשלגן הידרוקסידפישר כימיקלP250
אשלגן פוספט מונובסיסי Sigma-AldrichP0662
נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrateפישר כימיקלS373
ויטמין B12סיגמא-אולדריץ'V2876
<זנים חזקים>
Dictyostelium discoideumSiryaporn labזן AX318
Escherichia coliSiryaporn labזן B/r17
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn labPA14strain19
Pseudomonas aeruginosa Δ lasRSiryaporn labAFS20.1PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µ מסנן M MilliporeSCGPT01REלעיקור פילטר
צינור חרוטי, 15 מ"לקורנינג352097
בקבוקי אחסון זכוכיתפיירקס13951L250 מ"ל, 500 מ"ל, 1000 מ"ל
צלחת פטרי, קוטר 6 ס"מ351007 קורנינג60 על 15 מ"מ צלחות פוליסטירן
צלחת פטרי, קוטר 10 ס"מפישרFB0875712100 על 15 מ"מ לוחות פוליסטירן
מיכלי פלסטיק עם מכסהZiploc2.57E+09מיכלים מרובעים 3 כוסות
צלחות זכוכיתBio-Rad1653308להכנת רפידות אגר. ניתן להשתמש בלוחות זכוכית אחרים במידות דומות.
מקלות עץפישר23-400-102 
<חזק>ציוד
מיקרוסקופ ליקוי Ti-E הגדרת מיקרוסקופMEA53100 ניקון
10X תוכנית פלואור Ph1 אובייקטיבי  0.3 NAמיקרוסקופMRH20101 ניקון
מקור עירור פלואורסצנטי מנועהגדרת מיקרוסקופמנוע אור סט
מסנן פלואורסצנטיSemrockLED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 הגדרת מיקרוסקופ
מצלמת Orca Flash 4.0 V2Hamamatsu77054098הגדרת מיקרוסקופ
ImageJNIHv. 1.49תוכנה לניתוח תמונה
MATLABMathworksR2013תוכנה לניתוח תמונה
חממת שייקר אורביטליVWR89032-092לגידול חיידקים ב-37 מעלות; שייקר
פלטפורמהפישר13-687-700לגידול אמבות ב-22 מעלות; C
ספקטרופוטומטרBiochromUltrospec 10
חממה מקוררת מתחת לדלפקFisher97990Eלגידול אמבות ב-22 מעלות; C
אמבטיית מים איזוטמפית פישר15-462-21Qלקירור מדיה ל-55 מעלות; ג
' הגדרת אור C

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
  2. Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
  3. Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
  4. Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
  5. Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
  6. Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
  7. Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
  8. Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
  9. Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
  10. Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
  11. Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58(1990).
  12. Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
  13. Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
  14. Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
  15. Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
  16. Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
  17. Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
  18. Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
  19. Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  20. O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Calcein AMPseudomonas aeruginosa

מאמרים קשורים