מאמר שיטה

שיטה פולשני עבור ההפעלה של הכישור משוננת העכבר על ידי גירוי בתדירות גבוהה

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57857

⸱

2 ביוני 2018

 , 
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מראה כיצד להגדיר שיטה אמינה מערכת קבצים הירארכית בעכברים. נוירונים ברחבי הכישור משוננת בהיפוקמפוס הם גירוי חשמלית על-ידי מערכת קבצים הירארכית ישירות ובעקיפין בתוך vivo. פעילות. עצבית והאיתות מולקולרית נבדקים על ידי c-פוס Notch1 immunofluorescent מכתים, בהתאמה; נוירוג'נסיס לכמת על-ידי bromodeoxyuridine תיוג וזמינותו.

תקציר

גירוי בתדירות גבוהה חשמלי (מערכת קבצים הירארכית), באמצעות אלקטרודות מושתל מיקוד אזורים שונים במוח, הוכח כטיפול יעיל עבור נוירולוגיות שונות והפרעות פסיכיאטריות. מערכת קבצים הירארכית באזור עמוק של המוח, גם בשם גירוי עמוק-מוחי (DBS), הופך להיות חשוב יותר ויותר בניסויים קליניים. התקדמות אחרונים בתחום ניתוח DBS (HF-DBS) בתדירות גבוהה החלה להפיץ את האפשרות של טכניקה פולשנית זו במצבים אחרים, כגון טיפול הפרעת דיכאון (MDD), הפרעה אובססיבית-כפייתית (OCD), וכך ב.

למרות אלה אינדיקציות מתרחבת, המנגנון הבסיסי של ההשפעות המיטיבות של HF-DBS נשארים חידתי. כדי להתייחס לשאלה זו, גישה אחת היא להשתמש אלקטרודות מושתל שמפעילים בדלילות subpopulations מבוזרת של נוירונים על-ידי מערכת קבצים הירארכית. דווח כי מערכת קבצים הירארכית בגרעין הקדמי של התלמוס יכול לשמש לטיפול של אפילפסיה עקשן במרפאה. המנגנונים שבבסיס קשורות נוירוג'נסיס מוגברת ואין לשנותן פעילות. עצבית. לכן, אנו מעוניינים לגלות שינויים פיזיולוגיים על ידי זיהוי פעילות. עצבית, כמו גם נוירוג'נסיס ב הכישור משוננת העכבר (ג'י) לפני ואחרי טיפול מערכת קבצים הירארכית.

כתב יד זה, אנו מתארים מתודולוגיות עבור מערכת קבצים הירארכית למקד את הפעלת די. ג'י בעכברים, ישירות או בעקיפין, באופן אקוטי או כרוני. בנוסף, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט להכנת פרוסות המוח c-פוס Notch1 immunofluorescent מכתים כדי לפקח על הפעילות העצבית והאיתות ההפעלה וכן עבור bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג כדי לקבוע נוירוג'נסיס לאחר אינדוקציה HF-DBS. ההפעלה של פעילות. עצבית ו נוירוג'נסיס לאחר הטיפול HF-DBS מספק ראיות ישירות הנוירוביולוגי ויתרונות טיפוליים פוטנציאליים. במיוחד, מתודולוגיה זו יכולה להיות שונה ומוחלים כדי להתמקד באזורים אחרים במוח מעוניין כגון the הגרעינים הבזליים ואזורים subthalamic עבור הפרעות מוח ספציפיים במרפאה.

מבוא

HF-DBS הוא טכנולוגיה נוירוכירורגיים סטימולציה חשמלית במוח, אשר פותחה מאז המאה ה-1. בשנות ה-80 המאוחרות, מערכת קבצים הירארכית שימש תחילה התערבות טיפולית פוטנציאל מחלת פרקינסון, הפרעות תנועה אחרת2. ב העשורים האחרונים, HF-DBS כבר יותר בשימוש נרחב לטיפול הפרעות במוח אשר נמצאים כיום חשוכת על ידי אסטרטגיה טיפולית מסורתיים. במיוחד, עקב השיפור דיוק של האלקטרודה מערכת קבצים הירארכית, תוצאות יעילות מאוד, תופעות לוואי מינימליות, מספר הפרעות מוח מטופלים על ידי HF-DBS באופן משמעותי גדל במהלך עשרות שנים3,4, 5. לדוגמה, HF-DBS אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לטיפול של מחלת פרקינסון (PD), סוג אלצהיימר של, רעד חיוני וסוגים אחרים של התנועה הפרעות2,6, 7. חולי PD, התרופה וכולינרגיים מצטמצם עד 50% במהלך HF-DBS8. בנוסף לטיפול מוצלח של הפרעות תנועה, HF-DBS הוכיחה גם השפעותיו רב עוצמה לטיפול במחלות פסיכיאטריות במרפאה, ועל הגדלת קוגניטיביים כמו גם2,9, 10 , 11. יצוין כי המחקר של מערכת קבצים הירארכית לטיפול של הפרעות פסיכיאטריות אחרות נמצאות בשלבים שונים, המציעים מבטיח הרבה חולים12.

למרות מחקרים רבים הוכיחו כי מערכת קבצים הירארכית מוקד יש השפעות הן מקומי והן מרוחק ברחבי המוח13, המנגנונים נוירולוגיות ומולקולרית של ההשפעות יישארו חמקמק2,14. במרפאה, HF טיפולית-DBS מיושם בדרך כלל באופן ארוך טווח לטיפול של מחלת פרקינסון, כאב כרוני, ועוד שהרבה דעות מגודלים להסביר את השיפור שנוצר על ידי טיפול HF-DBS, בין אילו אפשרות אחת כי הזרם מערכת קבצים הירארכית שמחליש את פעילות הרשת העצבית, כנראה על ידי דפולריזציה חוזרות של האקסונים באזור האלקטרודה מערכת קבצים הירארכית מושתל. לחלופין, HF-DBS עלול לשנות את קצב פריקה של הנוירונים פלט ואת המטרות המוקרנת. בנוסף, HF-DBS עלולה לגרום לשינויים סינפטית לטווח ארוך, לרבות הויסעגט (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ), אשר עשויים לתרום שיפור סימפטומטי. עד כה, זה עדיין לא ברור אם מערכת קבצים הירארכית influences האירועים המולקולריים מפתח לווסת את הסלולרי תהליכים כאלה כמו למבוגרים נוירוג'נסיס בתוך vivo. מספר שורות של מחקרים הוכיחו כי מערכת קבצים הירארכית בחולדות עשויה לחקות דומה תגובות עצביות DBS קלינית יישומית15,16. כדי להבין את המנגנונים הסלולר הבסיסית של HF-DBS, במחקר זה, תחילה הקמנו של ויוו מערכת קבצים הירארכית מתודולוגיה בעכברים חריפה (יום אחד) או באופן כרוני (חמישה ימים). שנית, הקמנו מתודולוגיה הפעלה ניתוח כדי לקבוע את שינוי פעילות. עצבית ו נוירוג'נסיס לאחר הלידה HF-DBS.

בהתחשב בכך הייצור עצביים מתאי גזע עצביים הוא שופע במהלך התפתחות עובריים אך ממשיכה לאורך כל חיי הבוגרים, אזור subgranular בהיפוקמפוס הוא אחד האזורים העיקריים בו נוירוג'נסיס מתרחשת. התהליך של נוירוג'נסיס מושפע על ידי גורמים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. במקרים מסויימים אפילפטי, נוירוג'נסיס בהיפוקמפוס הוא ירד באופן דרמטי17,18. בנוסף, נזעי חשמל יחיד יכול להגדיל באופן משמעותי את ייצור עצביים הפיתול משוננת19. מקרים אלה מצביעים על הפעילות אלקטרופיזיולוגיות שמשחק תפקיד מרכזי בויסות נוירוג'נסיס למבוגרים ופלסטיות סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס. לכן, להפגין עוד יותר את ההשפעות של HF-DBS על פעילות. עצבית ו נוירוג'נסיס, אנחנו קודם לבצע את וזמינותו של immunostaining של מיידית מוקדם ג'ין (הרגל) c-פוס אשר מהווה סמן ידועים של הפעילות העצבית לטווח קצר הנובע ניסיון20. Notch1 איתות מזוהה גם לעקוב אחר הפעלת איתות לאחר מערכת קבצים הירארכית משלוח21,22. יתר על כן, אנו גם לזהות ההפקה עצביים מאת BrdU תיוג ניתוח לאחר אינדוקציה HF-DBS בצורות שונות, למרות BrdU מכתים ניתן גם סמן gliogenesis.

במחקר הנוכחי, שתי מתודולוגיות מערכת קבצים הירארכית מותאמים כדי למקד את ההפעלה של די. ג'י בהיפוקמפוס במישרין ובעקיפין. האלקטרודה הוא מושתל לתוך DG ישירות או מושתל לתוך הנתיב perforant המדיאלי (PP) אשר שולח הקרנות כדי להפעיל את הנוירונים די. ג'י. עבור אינדוקציה HF-DBS, ממריץ לתכנות מוצג עבור גירוי מתמשך דרך האלקטרודה קבוע על גבי הראש העכבר. כדי לקבוע את ההשפעות של מערכת קבצים הירארכית על הפעלת עצביים, נוירוג'נסיס, אנו מזהים את הביטוי של c-פוס , Notch1 על ידי צביעת immunofluorescent ואת המספר של שילב-BrdU נוירונים חיובי באזור DG בהיפוקמפוס, בהתאמה, לאחר הטיפול מערכת קבצים הירארכית. במיוחד, ההשפעות של HF-DBS על נוירוג'נסיס בדי. ג'י משווים בין חריפה באופן גירוי כרוני, או בין ישיר ובין באופן עקיף גירוי, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בעלי חיים בצרות בעקבות ההנחיות המוסדי של בייג'ינג המכון של יסוד מדעי הרפואה (בייג'ינג, סין), תקנות ממשלתיות הסינית על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. העכברים (26, זכר למבוגרים ~ 30 g) היו שוכנו, נשמרים בטמפרטורה קבועה של 23 ° C, עם מים ומזון ad libitum, תחת 12-h אור/12-h כהה מחזור (אורות ב- 7:00 בבוקר). כל ההליכים ניסיוני בוצעו במהלך מחזור אור.

1. הכנה כירורגית

הערה: אלקטרודה מותאם אישית היה ביתי באמצעות השיטה שונה של הלפרן ח23.

  1. השתמש 2 מיקרו-חוטי נחושת (עם הקוטר החיצוני של 200 מיקרומטר) האלקטרודה דו-קוטבי מקבילים. לעטוף את האלקטרודות סביב אחד את השני כדי ליצור אלקטרודות גליליות הגירוי.
    הערה: כאן, האורך אלקטרודה בתוך ' עמודים ' או ' DG היו מגוונים לפי עומק הגרעין אנטומיים.
  2. לעקר את האלקטרודות באמצעות ארון חיטוי של אתילן אוקסיד. לטפל ולאחסן האלקטרודות תיל מיקרו-ערוץ 2-תוצרת בית ללא כל זיהום. האלקטרודות צריך להיות מעוקר לחלוטין לפני כל ניתוח ההשתלה.
  3. אוטוקלב מכשירי הניתוח.
  4. לפני הניתוח, להחדיר את העכבר פנטוברביטל (20-50 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally, כדי להשיג מטוס כירורגי של הרדמה.
  5. להזריק את העכבר עם השעיה procaine סטרילי פניצילין G (75,000 U, I.M.), סוכן מאלחש (carprofen, 0.05 - 1 מ"ג/ק"ג, SC) כדי להקטין את הסיכון של דלקות וכאבים, בהתאמה24.
  6. לאחר ההרדמה בעלי חיים, חלות סיכה העין בשתי העיניים למניעת יובש בעין. להבטיח את תנאי הגיוס של הרגעה ואת העומק של ההרדמה על-ידי רפלקסים החיה בתגובה טו צובט ולהמשיך הפעולה רק כאשר אין תגובה.
    הערה: משחה הוטרינר הוא אפשרות נוספת למניעת יובש בעין.
  7. לגלח רוב פרווה בתקרת הראש העכבר עם קוצץ שיער חשמלי או סכין גילוח, לחטא את האזור מגולח עם שלושה מתחלפים קרצוף של אלכוהול 70% פתרון betadine, להמשיך בפעולה לאחר הבטאדין יבש על העור.

2. בתדירות גבוהה גירוי ניתוח25,26

הערה: בשלב זה, אלקטרודה היא באורח חד-צדדי מושתל לתוך את DG הגבי או אזור PP המדיאלי, חלק ההיפוקמפוס עם תפקידים חיוניים אפיזודי בלמידה ובזיכרון.

  1. הנח את העכבר anesthetized אל מסגרת סטיאוטטי. לשמור את הראש של העכבר משותק, ליישר את הסורגים האוזן כהלכה והתקן אותם במהירות. הדק בפסי האוזן בעדינות כך הם לתמוך בראש ממורכז ולאבטח את העכבר מעט.
  2. להשתמש בפתקים תרמוסטטי כדי לשמור על טמפרטורת גוף של החיה ב 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס.
  3. להשתמש מלקחיים כדי לתפוס את העור והשתרשה עמוק בלבה אוזני העכבר. ולהפסיק עם מספריים סטיריליים להסיר על 1 ס"מ2 אזור של העור בראש הגולגולת של העכבר.
    הערה: כמות קטנה של הדימום יכול להיות שנצפו לאורך שולי של חיתוך העור.
  4. הסר את השריר וקובץ מצורף אחרים המכסים את הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן כדי לחשוף את פני השטח של הגולגולת. השתמש ניקוי אוזניים עם מפסלת ויבתר כדי לנקות כל קרום העצם, גידים ורקמות מן השטח לחלוטין כדי לזהות את הווריד וקווים התפרים למדא, הגולגולת.
  5. לזהות את bregma ואת נקודת למדא. צומת הרחובות את התפר הפרונטליים ו התפר המשונן על החלק האמצעי סופריור calvaria הוא שם bregma ממוקם. החיתוך של התפר lambdoid על ידי התפר המשונן. שם נמצא למדא גלוי להשתמש bregma את הנקודה המקורית כדי להגדיר את המיקום גרעין אחרים.
  6. לאחר זיהוי המיקום bregma, למדה את הגולגולת, להתאים את אלה שתי נקודות במישור האופקי. ודא כי הגובה של שתי נקודות אלה הוא כמעט זהה לכיוון הגבי הגחוני / (שגיאות צריך להיות < 0.05 מ"מ). כמו כן, ודא כי הגולגולת הוא רמת לכיוון הצד המדיאלי ב26באותה דרך.
  7. ניתוח חד צדדית, הר של תוצרת בית 2-ערוץ נחושת מיקרו-אלקטרודות לתוך מחזיק האלקטרודה מסתובב על המסגרת כירורגי סטיאוטטי.
  8. מקם את האלקטרודה אנכית מעל לנקודת bregma בהתחלה ולאחר להגדירו כאתר המקורי. שימוש הדיגיטלי מוצגים סטיאוטטי מסגרת ניתוח כדי לציין הקדמי-האחורי (AP), המדיאלי-לרוחב (ML), ומיקום dorso-הגחוני / (DV).
    הערה: כדי למנוע קבלת רכנה האלקטרודה, אין לגעת בקצה אלקטרודה לתוך הגולגולת במהלך המבצע.
  9. להעביר את האלקטרודה בעדינות המיקום הנכון (איור 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 עבור DG ו- AP-3.8/ML ± 3.0 עבור עמודים, בהתאמה)27 לעיל הגולגולת ללא כל מגע. כאשר האתר הרצוי זוהה להכנסה אלקטרודה, להשתמש ההתאמות סטיאוטטי dorsoventral כדי גבוה בעל אלקטרודות, לסמן את המיקום עם סמן שחור.
    הערה: המיקום המדויק התייחסות לנקודות הציון stereotaxic עשויים להשתנות על ידי העכבר זן, משקל, סקס. עכברים בוגרים מאותו המין אמור לשמש כדי למזער את כל וריאציה במיקום. במידת האפשר, סריקות אנטומיות pre-operational אמור לשמש לזהות את מיקומו בסיס הנושא בודדים27.
  10. השתמש תרגיל בסיוע micromanipulator כף יד (קידוחים גודל = 0.5 מ מ) לעשות חור בגולגולת במיקום בולט דווקא. לחטא את קצה בר עם אתנול 70% לפני הקידוח. לעלות את המקדחה מיני דרך הגולגולת לאורך ציר z 0.8 - 1.0 מ מ ללא שינוי מיקומו X-Y. להשתמש כותנה סטרילי כדי לעצור דימום במהלך המבצע.
    הערה: כדי למנוע דור חום יתר קידוח, מופרז במהלך קידוח, להבטיח מהירות קידוח היא 15,000-18,000 סיבובים לדקה (סל ד), לעתים קרובות למשוך המקדחה burr החור s כל 8-10.
  11. לשמור על קידוח עד השכבה הקשה של המוח חשוף. השתמש מחט כפוף כדי להסיר כל חתיכה העצם נוצרים במהלך קידוח וגורמים הקדמוניות על השכבה הקשה של המוח ללא גרימת נזק לרקמת המוח רך המשמש כבסיס.
    הערה: כדי למנוע נזק לרקמת המוח, המחט בוטה כפוף גם ניתן להחליף עם מלקחיים בוטה בסדר.
  12. כדי לוודא כי נקבים נעשו כראוי במיקום הרצוי, להפחית את גובה אלקטרודה על ידי התאמת המסגרת ניתוח סטיאוטטי ולהבטיח כי האלקטרודה יכול להיות מוכנס בצורה חלקה דרך החור burr בלי לגעת כל המכשולים. אם כך, לאט להוסיף האלקטרודות עד לעומק של 1.8 מ מ די. ג'י (או 3.0 מ מ עבור PP) מפני השטח של הגולגולת הממוקמת ב PP המדיאלי די. ג'י (PP-DG).
    הערה: נגב את כל הנוזל השדרתי או דם outflows מכל החורים burr עם צמר גפן סטרילי במהלך תהליך ההשתלה אלקטרודה.
  13. לאחר הוספת של מיקרו-האלקטרודות לתוך החור בגולגולת, מחזיק אותו במקום עם מלט שיניים נאותה באמצעות מרית קטנה. כמו המלט מסתבכת, לעצב את זה סביב אלקטרודה שנוספו ברגים כדי ליצור חלקה כובע נחמד. הרקמה המתה ולחטא קצוות הפצעים.
  14. שמעת אותי האלקטרודה ממחזיק אלקטרודה. להסיר את העכבר מהמסגרת סטיאוטטי ולהחזיר את כלוב חמים.
    הערה: לאחר הניתוח, לחכות עם החזרת החיות לכלובים שלהם עד הם התאוששו לגמרי מההרדמה עם התודעה מספיק.
  15. תן את העכבר לנוע בחופשיות ולאפשר לו להתאושש במשך יומיים בכלוב. לאחר מכן, חבר את האלקטרודה מושתל העכבר למוח ממריץ לתכנות באמצעות מוביל. להגדיר את ממשק התוכנה כפי שהוצג באיור2. קבע את הפרמטרים מערכת קבצים הירארכית כסידרה 6 6 רכבות של פולסים 6 ב 400 הרץ (איור 1B, ms 100 בין הרכבות, 20 s בין הסדרות)28. קבע את עוצמת גירוי 200 μA.
  16. לספק מערכת קבצים הירארכית עבור תקופת הזמן כפי שנקבע הרצוי. לספק גירוי 2 x יום בשעה 8 בבוקר, בשעה 8 בערב...
  17. עבור קבוצת בקרה, משתילים אלקטרודות בעכברים, אל תבצע של גירוי.
  18. עבור ההכתמה c-פוס , לעורר את העכברים ניסיוני בחריפות (2x ליום). עבור תיוג BrdU, לחלק את העכברים ניסיוני קבוצת גירוי אקוטי (החלת 2x ליום) וקבוצת גירוי כרוני (החלת x 10 תוך 5 ימים, 2x ליום). במהלך של הגירוי, ודא שהעכבר הוא ער. זכור להבטיח שההפניות לא מעוותים.
    הערה: ביום האחרון של ההליך, העכברים בקבוצה גירוי אקוטי היו מגורה בו-זמנית.
  19. כאשר הגירוי נעשה, נתק בזהירות את הסיכה אלקטרודה של המחזיק אלקטרודה, המחבר של מערכת הקלטה.

3. immunofluorescence מכתים, Bromodeoxyuridine תיוג29

  1. כדי להפוך את c-פוס Notch1 מכתים, כ-3 שעות לאחר הגירוי HF-DBS האחרון, עזים ומתנגד העכברים באמצעות הזרקת פנטוברביטל (20-50 מ"ג/ק"ג, I.P.) כדי להשיג מטוס כירורגי של הרדמה.
  2. עבור תיוג BrdU, כ- 12 שעות לאחר הגירוי HF-DBS האחרון, תן 6 זריקות של BrdU את הפקד ואת העכברים מגורה במרווחים של 2-h (50 מ"ג/ק"ג ב- saline 0.9%, I.P.). 36 שעות לאחר הזריקה האחרונה, עזים ומתנגד העכברים באמצעות הזרקת פנטוברביטל (20-50 מ"ג/ק"ג, I.P.) כדי להשיג מטוס כירורגי.
  3. לעשות חתכים באמצעות אזמל בתוך קשת הצלעות כדי לחשוף את הלב ולאחר מכן להעביר מחט קליבר 22 בוטה זלוף אל החדר השמאלי. עושים חתך קטן באטריום ימין. Transcardially perfuse זה עם 50 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS) ואחריו 50 מ של paraformaldehyde 4% קר (PFA) ב 1 x PBS (pH 7.4).
    הערה: לעבור את PBS מחברים כאשר העכבר דם ויוו מוחלף הנוזל רץ ברורה. זלוף טוב יכולה להישפט על ידי קרחת היער של הכבד. יש להפסיק את זלוף לאחר קיבוע רעידות נצפו30.
  4. לערוף את העכבר עם מספריים אופטלמולוגיות, אעשה חתך על העור ולחשוף את הגולגולת. באמצעות מלקחיים, שבב את הגולגולת מעט ומנתחים בקפידה את המוח כל עכבר. פוסט-fix המוח ב- 4% paraformaldehyde 2 ימים נוספים, להעביר אותו פתרון 30% סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. שימוש של cryostat, לחתוך את המוח למקטעים הילתית 20-מיקרומטר. העברת הר הסעיפים לשקופית זכוכית עם מברשת ואחסן אותם ב-20 ° C.
    הערה: חיות עם אלקטרודה misplacements או נזק מכני מופרז ייכללו מניתוח עוקבות.
  6. להעביר את השקופיות PBS נורמלי (0.1 M, pH 7.4) המכילה לא מקבע. לשטוף את הפרוסות עם PBS עבור 3-4 x עבור 5 דקות כל אחד כדי להסיר כל מקבע עודף. עבור קבוצת התווית על-ידי BrdU, דגירה בסעיפים 2-N HCl למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולשטוף אותם במאגר בוראט 0.1-M (pH 8.4; 10 דקות). לאחר מכן לשטוף את פרוסות 2 x עבור 5 דקות ב- PBS.
    הערה: Immunostaining ואז מבוצעת.
  7. לטפל פרוסות על ידי דגירה בחסימה פתרון (סרום עז רגיל 1%, 3% אלבומין שור < BSA >, 0.5% טריטון X-100 ו- 0.02% אזיד הנתרן ב- PBS 1 x) h 1 בטמפרטורת החדר (RT).
  8. דגירה את הפרוסות עם אנטי -c-פוס polyclonal נוגדנים (שבערך; ארנב), נוגדן anti-Notch1 (1:50; עז) או נוגדן anti-BrdU (1:800; חולדה) בפתרון חסימה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. לשטוף את פרוסות 3 x ב- PBS, ואז דגירה אותם עם אלקסה עבור חיל הים 568 מצומדת אנטי-הארנב (שבערך), אלקסה עבור חיל הים 488-מצומדת נגד עז (1:1, 000), או נוגדנים משניים מצומדת אלקסה עבור חיל הים 488 אנטי חולדה (שבערך) עבור h 1-RT.
  10. לשטוף את הדגימות 3 x ב- PBS (10 דקות כל פעם). מכסים הסעיפים התווית על-ידי חיסונית המוח באמצעות בינוני הרכבה של ריאגנט לדעוך אנטי המכיל דאפי. . תן את הפרוסות מילה נהדרת ולאחסן אותם מוגן מפני אור ב 4 º C.
  11. לרכוש תמונות של האזורים בהיפוקמפוס ומהצדדים מגורה, unstimulated של המוח עם ערוץ מרובה ברזולוציה גבוהה (רציף) מיקרוסקופ קונפוקלי סורק. להגדיר את הפרמטרים הדמיה בעקביות בין שליטה לבין קבוצות הניסוי.
  12. בצע הדמיה של פסיפס באמצעות מטרה גבוהה ההגדלה (20 X אוויר המטרה, נה 0.45) לרכוש תמונות (XYZ) תלת-ממד רציף של המבט של שדות סמוכים, באמצעות השלב ממונע ולנצל את התוכנה המתאימה לתפור אותם יחד כדי להפוך את הפרדות צבע גדול תמונות.
    הערה: ריצוף פונקציות כוללים אפשרויות לתמונות חלקה משופרת תפרים והחלקת אמיתי. תמונות בקלות ובמהירות מוכנות תוך שימוש בפונקציה תפרים, כדי ליצור תמונה על פני אזור נרחב.
  13. C-פוס , Notch1 מכתים, לבצע ניתוח כמותי חיובי גרעינים של צפיפות immunofluorescent21 של תמונות התפר. באופן אקראי בחר 3 אזורי rostral, הגבי ו הגחון בהיפוקמפוס DG לאזורי משנה ולמדוד את הצפיפות immunofluorescent באופן פעמיים עיוור באמצעות תמונה J תוכנה (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. עבור BrdU תיוג, לנתח את הפרוסות מסביב לנקודת קידוח באמצעות ההיפוקמפוס הגבי (-1.7 מ"מ עד מ"מ-2.7 יחסית bregma) באופן פעמיים עיוור.
  15. לספור רק BrdU-חיוביות נוירונים בריכוזים די. ג'י. כוללים את התאים שוכב בתוך 2-תא קטרים בתא גרגר הרוזן.
    הערה: כאן, ספירת בוצעה באמצעות 40 X אוויר המטרה. באופן אקראי, סעיפים 3-5 לכל חיה נספרו, הסעיפים היו בממוצע והביע כאמצעי לכל DG19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות גירוי HF-DBS אכולי DG בהיפוקמפוס ישירות או את אכולי PP כדי להפעיל את DG בעקיפין באמצעות הוספת אלקטרודות באמצעות התאמות סטיאוטטי, המכרסמים היו מרדימים עם פנטוברביטל, שנדגמו 3 h לאחר גירוי HF-DBS האחרון עבור c-פוס ו Notch1 immunostaining. עבור BrdU מכתים, 36 שעות לאחר הזריקה BrdU האחרון לאחר יום 1 או 5 ימים של גירוי HF-DBS, המכרסמים היו מרדימים עם פנטוברביטל עבור הכנת חלקים במוח. איור 3 מראה כי הביטוי של c-פוס היה משמעותי מוגבר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הטכניקה HF-DBS כבר בשימוש נרחב לטיפול בהפרעות נוירולוגיות רבות מאז שנות ה-90 ככלי רב עוצמה. עד כה, הוא ציון דרך עבודתו של HF-DBS לטיפול של מחלת פרקינסון, רעד חיוני, אשר משכה הרבה תשומת לב ועניין הן את המרפאה והן הקהילה המדעית. ישנם סוגים שונים של לימודי מתמשך HF-DBS על ידי קבוצות רבות עבור יישום טיפולי של HF-DBS ב32,מסוימים נוירולוגיות והפרעות פסיכיאטריות33. כמה מחקרים אלו הם כיום בשלבים שונים של ניסויים קליניים2,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש ריהצהל.

תודות

נתמך על ידי קרן מדעי הטבע הלאומית של סין מענקים 31522029, 31770929 ו- 31371149 (כדי Haitao Wu), תוכנית 973 (2014CB542203) מתוכנית פיתוח המפתח המדינה למחקר בסיסי של סין (כדי Haitao Wu), גרנט Z161100000216154 מ בייג'ינג העירוני למדע וטכנולוגיה (כדי Haitao Wu). המחברים תודה לכל חברי המעבדה Haitao וו שלהם עידוד ודיונים. המחברים הם מאוד אסירת תודה ליו Zhenwei לעזרתו עם באגים המנגנון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכשיר סטריאוטקסי למוחStoelting51730Dהשתלה תוך גולגולתית סטריאוטקטית לעכבר
ממריץמערכות AM,דגם 3800MultiStim ממריץ לתכנות 8 ערוצים
מקדח שינייםSaeshin Precision Co., LtdSTRONG 90לקידוח וקרניתוטומיה 
ברמייסינגרHM1 005#לקידוח וקראינוטומיה 
Digidata 1550 Digitizerמכשירים מולקולרייםAXON 1550רכישת נתונים ברזולוציה גבוהה
CryotomeThermo Fisher ScientificThermo Cryotome FSEחיתוך חלקים קפואים של דגימות
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוסFV-1200יפן, עם 20x מטרה (NA 0.45)
כלי ניתוח עכברמספריים, מלקחיים, חותך עצמות, מחזיקים וכו '.
פנטוברביטל נתרןR& מערכות D457920-50 מ"ג/ק"ג להזרקת ip
פניצילין G Sigma-AldrichP303275,000 U להזרקת i.m.
קרפרופןסיגמא-אולדריץ'SML17135-10 מ"ג/ק"ג, להזרקת s.c.
4% פרפורמלדהיד (PFA)בייג'ינג Solarbio Sci-Tech Co. P1110תמיסת גרב לקיבוע רקמות
מאגר פוספט (PBS)Invitrogen10010023pH7.4, 500 מ"ל בגרב
תרכובת Tissue-Tek O.C.T.סאקורה4583ניסוח של גליקולים ושרפים מסיסים במים
נוגדן נגד BrdUAbcamab6326דילול: 1/800
נוגדן נגד c-fosAbcamab209794דילולים:1/500
עיזים נגד ארנב IgG (Alexa Fluor 568)Thermo Fisher ScientificA11036דילול: 1/500
חמור נגד חולדות IgG (Alexa Fluor 488)Jackson ImmunoResearch712-546-150דילול: 1/500
מדיום הרכבה נגד דהייה עם DAPIVector LaboratoriesH-1200צביעה נגדית עם
נוגדן DAPI anti-Notch1 (C-20)Santa Cruz Biotechsc-6014דילול: 1/50
חמור נגד עזים IgG (Alexa Fluor 488)Abcamab150073דילול: 1/1000
F.S.T.14084-08,11254-20,16109-14

מקורות

  1. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  2. Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
  3. Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214(2014).
  4. Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
  5. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
  6. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
  7. Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
  8. Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
  9. Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
  10. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
  11. Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
  12. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
  13. McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
  14. Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
  15. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
  16. Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457(2015).
  17. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).
  18. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
  19. Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
  20. Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35(2010).
  21. Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
  22. Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
  23. Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
  24. Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266(2016).
  25. Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066(2015).
  26. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
  27. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6(2007).
  28. McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
  29. Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  31. Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220(2014).
  32. Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2(2012).
  33. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
  34. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
  35. Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
  36. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).
  37. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37(2014).
  38. Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
  39. Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BrdUc fos Notch1

מאמרים קשורים