Method Article

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

DOI:

10.3791/57889

⸱

August 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, 2Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, 3Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, 4Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלופי splicing (AS) מתרחשת אצל יותר מ-90% של גנים אנושיים. למשמעות הביטוי אקסון spliced לחילופין מוסדר לעתים קרובות אופנה ייחודיים לסוג התא. כביטוי דפוסי מנותחים בדרך כלל על ידי RT-PCR ו- RNA-seq באמצעות דגימות RNA מבודדים מתוך אוכלוסיה של תאים. בחיי עיר בחינת כמו דפוסי ביטוי עבור מבנה ביולוגי מסוים יכול להתבצע על ידי RNA בחיי עיר הכלאה (איש) משתמש ספציפי אקסון הגששים. עם זאת, השימוש המסויים איש הוגבלה בגלל exons חלופית הם בדרך כלל קצרים מדי בשביל עיצוב ספציפי אקסון הגששים. בדו ח זה, השימוש BaseScope, טכנולוגיה פיתחה לאחרונה מעסיקה oligonucleotides antisense קצר ב- RNA איש, מתואר לנתח כמו דפוסי ביטוי בסעיפים מוח העכבר. אקסון 23a של נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (Nf1) משמש דוגמא כדי להמחיש כי אקסון קצר-אקסון צומת הגששים להפגין אותות חזקים הכלאה עם ירידה לפרטים גבוה בניתוח RNA איש על חלקים במוח העכבר. חשוב מכך, אותות מזוהה עם הגששים הכללה דילוג ספציפיים או אקסון יכול לשמש באופן אמין לחשב את אחוז משולבים בערכים Nf1 אקסון 23a הביטוי תחומים אנטומיים שונים של מוח העכבר. נסיוני ואת שיטת חישוב עבור כמו ניתוח מוצגים. התוצאות מצביעות על כי BaseScope מספק כלי חדש חזק כדי להעריך בתור ביטוי דפוסי בחיי עיר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלופי splicing (AS) הוא תהליך נפוץ המתרחשת במהלך ההבשלה pre-mRNA. בתהליך זה, אקסון ניתן לכלול באופן שונה ב- mRNA בוגר. לכן, דרך AS, אחד הגנים ניתן להפיק רבות mRNAs את הקוד עבור מוצרי חלבונים שונים. ההערכה היא כי 92-94% של גנים אנושיים לעבור חלופי splicing1,2. חלופה חריג שחבור דפוסי נבעה מוטציות גנטיות נקשרו למספר רב של מחלות, כולל נוירודגנרטיביות, ניוון חולים myotonic וסרטן3,4. לפיכך חיוני לחקור ולהבין טוב יותר מנגנונים רגולטוריים splicing חלופיים, בניסיון למצוא טיפולים חדשים של מחלות אנושיות.

כפי מוסדר לעתים קרובות אופנה ייחודיים לסוג התא. חשוב לקבוע הדפוס ביטוי כמו של גן מסוים במערכת הביולוגית נתון. עם זאת, זה הופך מסובך כאשר איבר מורכב המכיל סוגים רבים ושונים של תאים, כמו במוח או בלב, הוא למד. במקרה זה, הוא הבחירה האידיאלית של מערכת assay RNA בחיי עיר הכלאה (איש) באמצעות רקמות סעיפים אז הדפוס ביטוי כמו של גן מסוים ניתן להבחין סוגי תאים רבים בו זמנית. אכן, אקסון ספציפיים הגששים שימשו להערכת רמות הביטוי של6,5,חלופי אקסון7. עם זאת, גישה זו אינה מתאימה עבור כמו ניתוח דפוס מהסיבות הבאות. שיטות איש הראשון, המקובלת בדרך כלל להשתמש יותר מ 300 הגששים bp, בעוד הגודל הממוצע של חוליות exons פנימי (אקסון לא הראשון או האחרון) הוא 170 נוקלאוטידים8,9. שנית, בעת בדיקה ספציפית אקסון לבחון את התבנית splicing של אקסון חלופי פנימי, isoform mRNA היחיד שזיהה את המכשיר הוא אחד המכיל את אקסון, תוך isoform mRNA בלי אקסון לא ניתן לאתרם. לפיכך, חישוב האחוזים משולבים (PSI) ערך עבור אקסון חלופי הוא מסובך. יתר על כן, איש פלורסנט קונבנציונלי משלבת לעיתים קרובות איש עם immunostaining, אשר מפחית את יעילות הזיהוי ואת החוסן. לדוגמה, במחקר שחקרה את מפגינות שחבור isoform מיתוג של אצטילכולין אסטראז (AChE) mRNA, digoxigenin סופחה החללית איש וזוהה באמצעות נוגדן anti-digoxigenin. לחלופין, בדיקה התווית על-ידי ביוטין זוהה על ידי המספר המשלים של phosphatase אלקליין/streptavidin מצע phosphatase אלקליין10. אף שיטה משתמשת בכל אסטרטגיה הגברה כדי להגביר את הרגישות של זיהוי. כתוצאה מכך, זה מאתגר כדי לזהות תעתיקים mRNA באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. לפיכך, מערכת assay איש פשוט יותר ועוצמתי יותר יש צורך לנתח בתור ביטוי דפוסי בחיי עיר.

BaseScope לאחרונה פותחה על הפלטפורמה של RNAscope, ומבוססת בסיס, בשימוש נרחב מערכת assay איש. שתי מערכות assay מעסיקים טכנולוגיה במטרה ההגברה מגביר את הרגישות של זיהוי11,12. מה שמבדיל את אחד מהשני הוא האורך של רצף המטרה, אשר הוא קצר ככל נוקלאוטידים 50 עבור BaseScope, 300-1000 נוקלאוטידים עבור RNAscope. לכן ניתן הגששים עיצוב שכוונו אקסון-אקסון צמתי כדי לזהות איזופורמים mRNA חלופיים ספציפיים. במחקר הנוכחי, הליך הוקמה כדי לבחון ההקלדה דפוסי ביטוי של נוירופיברומטוזיס 1 (Nf1) אקסון 23a, אקסון חלופי בהרחבה למד באותה מעבדה13,14,15 , 16 , 17, בסעיפים מוח העכבר. התוצאות מדגימים כי BaseScope הינה מערכת אידיאלי ללמוד דפוסי ביטוי של אקסון 23a Nf1 באתרו בתוך. מערכת זו assay יכול להיות מותאם כדי לנתח כמו דפוסי ביטוי של exons אלטרנטיביים רבים, הוא מייצג כלי רב עוצמה חדשה בלימודי בשם

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים המתוארים כאן המערבות עכברים אושרו על ידי התיק Western Reserve אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה. הכותרת של פרוטוקול 2016-0068 (PI: הואה לו) הוא תפקיד של שחבור חלופי pre-mRNA בפיתוח חוליות".

הערה: המידע של כל ציוד, ריאגנטים, אספקה בשימוש פרוטוקול זה נכללת טבלה של חומרים.

1. מכינים פורמלין פרפין קבוע משובצים קטעים (FFPE)

  1. המתת חסד 1 CD1 עכבר ועכבר C57BL/6J 1 מאת נקע בצוואר הרחם. בזהירות לחתוך את הגולגולת עם מספריים כירורגיים וחדים. מסירים את המוח עם סקופ.
    הערה: עכברים זכר בן 5 חודשים CD1 ועכברים בת 3 חודשים C57BL/6J זכר היו בשימוש, הראה תוצאות דומות.
    1. לשטוף את המוח עם PBS. לתקן את זה. עם פתרון המכיל 10% פורמלין בטמפרטורת החדר (RT) אחר 30 אבני על ידי לשים את כל המוח ב- 50 מ של הפתרון פורמלין.
    2. שנה הפתרון תיקון ל- PBS, דגירה המוח ב- PBS בן לילה ב 4 º C. מייבשים, להטביע את המוח עם קסילן, פרפין באמצעות הליכים סטנדרטיים18.
  2. השימוש של מיקרוטום לחתוך רקמות מוטבע למקטעים 5 מיקרומטר. לשים רצועת פראפין באמבט מים RT הראשון, ולאחר מכן באמבט מים 45 ° C כדי להפיץ את הסרט.
    1. כאשר קמטים, קפלי ברצועת הכלים נעלמים, מיד הר מקטעים בשקופיות זכוכית. האוויר יבש השקופיות בן לילה RT. אופים שקופיות עבור h 1 ב 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

2. דגימה רעלני

  1. Deparaffinize רקמה מקטעים. לבצע את הפעולות הבאות בברדס fume.
    1. למלא כביסה שתי מנות (איור 1 א') 250 מ של קסילן טריים ושתיים עם 250 מ של 100% אתנול. להוסיף שקופיות רקמה לתוך מתלה כביסה (איור 1 א') מקום השטיפה לארון תקשורת במנות כביסה בעקבות הסדר וזמן הדגירה המצוין בטבלה 1.
    2. במהלך כל הדגירה, להרים את מתלה הכביסה למעלה ולמטה יותר מ 3 פעמים בצלחת כביסה. לאחר כל דגירה, להעביר במהירות את מתלה הכביסה לתוך המנה הכביסה הבא כדי למנוע את קטעי רקמה מתייבשת.
    3. לאחר השלמת השלבים דגירה, הסר את מתלה הכביסה עם מגלשות המנה כביסה. מקום ארון התקשורת חממה 60 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות או עד השקופיות יבשים לחלוטין.
  2. צייר מחסום 0.75'' x 0.75'' סביב סעיף הרקמה עם עט הידרופובי המכשול. האוויר יבש המכשול למשך 3 דקות ב- RT.
  3. Pretreat פרוסות
    1. להכין ראגנטים וציוד
      1. להדליק את התנור הכלאה (איור 1B) ולהגדיר את הטמפרטורה עד 40 ° צלזיוס 30 דקות לפני השימוש.
      2. הרטיבו את הנייר humidifying (איור 1E) עם מים מזוקקים לחלוטין והניחו אותה במגש בקרת לחות (איור 1D, משמאל). השאר את המגש בקרת לחות בתנור הכלאה.
      3. הכינו 700 מ"ל של ריאגנטים אחזור יעד טרי 1 x על-ידי הוספת 630 מ ל dH2O 70 מ של 10 x יעד אחזור ריאגנטים.
    2. החל מימן על-חמצני.
      1. לשים את השקופיות deparaffinized על הספסל. להוסיף 5-8 טיפות מי חמצן מקטע לכסות לגמרי את הרקמה. תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.
      2. הקש על השקופיות על פיסת נייר סופג כדי להסיר הפתרון מימן על-חמצני, שקופית אחת בכל פעם. מיד להוסיף את השקופית לתוך מתלה כביסה ולהעביר את המדף אל צלחת כביסה מלאים dH2O.
      3. לשטוף את השקופיות על-ידי העברת ארון התקשורת למעלה ולמטה במים מזוקקים למשך שלוש עד חמש פעמים. להעביר את מתלה הכביסה צלחת כביסה מלאים מים מזוקקים ושקופיות לשטוף עוד פעם אחת.
    3. לבצע אחזור היעד
      1. במקום גביע זכוכית 1000 מ על פלטה חמה. להוסיף 700 מ"ל של טרי 1 x יעד אחזור ריאגנטים כשהספל ומכסים אותו עם נייר כסף. הכנס מדחום כשהספל לכיסוי רדיד (איור 1C). להדליק את הכיריים ולהגדיר גבוה למשך 10-15 דקות.
      2. כאשר הטמפרטורה של ריאגנטים אחזור מגיע 98 ° C, מעבר לשליטת טמפרטורה הכיריים בגובה נמוך כדי לשמור על החום הגדול מתון. לא להרתיח יותר מ 15 דקות.
      3. בינתיים, בזהירות פתח את רדיד האלומיניום, לשים את מתלה הכביסה עם פרוסות בתוך ההנהלה לאחזור. מכסה את הספל שוב, תקופת דגירה של 15 דקות.
      4. שימוש מלקחיים להסיר את המתלה הספל על צלחת כביסה מלאים 200 מ של dH2O ולשטוף 15 s.
      5. . לא ידענו על צלחת כביסה המכיל 100% אתנול טריים ותנו לשבת 3 מינימלית להסיר את השקופיות, נייבש אותם חממה 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. החלת פרוטאז השלישי
      1. מקם את השקופיות על המדף הכתם (איור 1D, נכון). להוסיף 5 טיפות פרוטאז השלישי כדי לכסות את הרקמה. בזהירות לשים ארון התקשורת במגש בקרת לחות (איור 1D, שמאלה), הכנס את המגש לתנור הכלאה 40 ° C. תקופת דגירה של 30 דקות.
      2. להסיר את המדף שקופיות, להחזיר את המגש לתנור. הקש על השקופיות כדי להסיר את עודפי הנוזל, שקופית אחת בכל פעם. להוסיף את השקופית מתלה כביסה ואת המקום המדף בקערה כביסה מלא dH2O. מהלך המתלה למעלה ולמטה כדי לשטוף את השקופיות עבור 3 - 5 פעמים.

3. איש Assay

  1. להכין חומרים
    1. לחמם 50 x שטיפת מאגר חממה 40 ° C עבור מינימלית 20 מיקס 2.94 L של dH2O ו- 60 מ של 50 x שטיפת מאגר לעשות 1 x מאגר לשטוף.
    2. להכין 50% Hematoxylin מכתימים פתרון על-ידי הוספת 100 מ של hematoxylin של גיל אני 100 מ של dH2O. הכן 0.02% (w/v) אמוניה מים על-ידי הוספת מ 1.43 ל 1 N אמוניה מימית 250 מ של dH2O. לערבב טוב במיכל.
    3. לשים את הגששים ואת המגבר 0-6 ריאגנטים ב RT 30 דקות לפני השימוש. השאר את המגש בקרת לחות בתנור הכלאה 40 ° C.
  2. הליך איש
    הערה: כדי לבדוק הביטוי של Nf1 שחבור איזופורמים ולחשב את אחוז משולבים (PSI) ערך עבור אקסון 23a, שלושה רגשים איש שונים המכוונות אקסון isoform כלול 23a, אקסון לא נכלל 23a isoform או שניהם איזופורמים הם משומשים (איור 2 ). הגששים משמשים על מקטעי רקמת adjacently לחתוך. כדי להבטיח את הדיוק של החישוב, זה קריטי כי הסעיפים רקמות שלושה מטופלים בדיוק בשלבי גילוי הכלאה, הגברה ושידור.
    1. בדיקה הכלאה.
      1. הסר את השקופיות מתלה הכביסה והקש על הנוזל העודף מהשקופיות. מקם את השקופיות בארון הכתם.
      2. השתמשי בעיפרון לתייג את השקופיות עם שם בדיקה. לשים את השקופיות רקמת המוח adjacently לחתוך שלושה שהוכלא יחד עם שלושה רגשים Nf1 שונים (איור 2). לבצע את השלבים הבאים באותו סדר של שקופיות.
      3. להוסיף 4 טיפות בדיקה כדי לכסות את הרקמה. אישור בכל פעם כדי למנוע את הסעיפים מתייבשת. מקום המדף הכתם במגש בקרת לחות והוספתו לתוך התנור 40 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
      4. לשטוף את השקופיות פעמיים עם שטיפה מאגר. עבור כל כביסה, למלא את הצלחת מכתימים 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר ולמקם מתלה כביסה בתוכו. הקש על עודף נוזל על מגבת נייר שקופית אחת בכל פעם והוספתו במהירות לתוך המדף כביסה. . לא ידענו שקופית למעלה ולמטה לתוך המנה עבור 3 – 5 פעמים למשך 2 דקות ב- RT.
      5. לשימוש לשטוף את השני, מאגר שטיפת טריים.
    2. הגברה של האות.
      1. הקש על המאגר שטיפת עודפי מהשקופיות ומניחים בארון הכתם. להוסיף 4 טיפות של המגבר 0 כדי לכסות את הרקמה. למקם ארון התקשורת הכתם במגש בקרת לחות, להכניס אותו לתנור למשך 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
      2. לשטוף את השקופיות פעמיים עם שטיפה מאגר כמתואר לעיל.
      3. חזור על שלב זה עם המגבר 1 – 6 בעקבות את ההזמנה ואת תנאי בטבלה 2. לשטוף את השקופיות פעמיים אחרי כל שלב הכלאה.
    3. אות זיהוי
      1. הקש על המאגר שטיפת עודפי מהשקופיות ומניחים בארון תקשורת הכתם. להוסיף 2 µL של מהר אדום B µL 120 מהר אדום (יחס יצירת) צינור microcentrifuge. לערבב היטב ולהוסיף כדי כיסוי מלא סעיף הרקמה.
        הערה: הנפח הכולל של אדומה / מיקס B מבוססת על המספר והגודל של רקמות מקטעים. עבור אזור 0.75'' x 0.75'', 120 µL הוא מספיק עבור מקטע אחד. לערבב בתוך 5 דקות והימנע חשיפה של המיקס לקרני השמש או אור UV.
      2. לסגור את המגש, תקופת דגירה של 10 דקות-RT. להסיר את הפתרון פח אשפה מיד להכניס את השקופיות מתלה כביסה ו למקם ארון התקשורת צלחת כביסה מלאים במי ברז. לשטוף שוב עם מים מהברז.
  3. Counterstaining של השקופיות
    1. הסר את מתלה הכביסה של מי ברז, הקש במהירות על נייר סופג כדי להסיר את עודף מים. להכניס ארון התקשורת hematoxylin 50% מכתים פתרון ולהעביר מיד את המדף לאורך מספר פעמים. תקופת דגירה של 2 דקות ב- RT.
    2. העברת המדף שקופית בחזרה לתוך המנה מי ברז. רחץ 3 – 5 פעמים על-ידי נע מעלה ומטה ארון התקשורת ושינוי טריים מי ברז עד השקופיות הופכים ברורים, בעוד ברקמות המוח להישאר סגול.
    3. . לא ידענו על תבשיל המכיל מים אמוניה 0.02% . לא ידענו למעלה ולמטה 2 – 3 פעמים עד הרקמות כחולות לשטוף את השקופיות 3 – 5 פעמים עם מים מהברז טריים בקערה מוכתמים.
  4. הרכבה של הדגימות
    1. להעביר המדף שקופיות מתוך קערה מכתימים חממה 60 מעלות צלזיוס, תקופת דגירה של פחות 15 דקות עד השקופיות יבשים לחלוטין.
    2. מקום 40 µL של הרכבה בינונית בשקופית ובזהירות הצב coverslip 24 מ"מ x 50 מ"מ על סעיף הרקמה. שקופיות אוויר יבש למשך 30 דקות ב- RT.

4. איסוף נתונים וניתוח

הערה: השתמש סורק שקופיות כדי לסרוק את התמונות בהגדלה X 40.

  1. פקדים חיוביים ושליליים
    1. עבור ניסוי, כוללים פקדים חיוביים ושליליים (איור 3). כפקד חיובי טוב, אות צריך להיות גלוי כנקודות punctate ב- 20-40 X הגדלה.
    2. השתמש עכבר (Mm) 1ZZ - PPIB - כפקד חיובי. המכשיר הזה מטרות הגן משק בית משותף PPIB. . באמת, נקודה אחת על כל התאים 20 הצגת הרקע מכתים לכל 20 X מיקרוסקופ שדה מקובל.
    3. השתמש החללית DapB-1ZZ כפקד שלילי. המכשיר הזה מטרות dapB של גנים חיידקיים. הגששים שליטה אלה שימשו איש רבים מבחני19.
  2. אות זיהוי וניתוח של כמו דפוסי ביטוי של אקסון Nf1 23a
    1. כמו האותות הכלאה מסומנות נקודות punctate, ספרו את הנקודות באופן ידני. מספר הנקודות הוא מתואם עם הרמה של התרשימים שמזוהה על-ידי בדיקה ספציפית. שימו לב כי מספר הנקודות יכול גם להיות מנותח על ידי תוכנות ImageJ או SpotStudio.
    2. להשתמש שלושה רגשים hybridize המכילים אקסון 23a, אקסון שחסרים 23a איזופורמים או Nf1 הכולל תעתיקים (איור 2). הגששים 3 אין אפשרות להשתמש בו זמנית, להשתמש בשלושת המקטעים של רקמת המוח סמוכים כדי hybridize על כל בדיקה.
      1. כדי לחשב אחוזים או, אבל בארט (PSI) עבור אקסון 23a, לספור את מספר תאים ונקודות באזורי מוח שונים. עבור כל אזור בעל עניין, לספור תאים יותר מ-400 מכמה תתי אזורים כמצוין באיור4.
      2. איסוף הנתונים מאזורים המשנה זהה עבור כל אחד משלושת רגשים. לחשב PSI במספר הנקודות בכל תא עם החללית הכללה אקסון 23a / (מספר של נקודות בכל תא עם אקסון 23a הכללה בדיקה + מספר נקודה לכל תא עם exon23a דילוג על בדיקה) x 100%.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איש BaseScope בוצע באמצעות העכבר שלושה זנים: CD1 פראי סוג עכברים, C57BL/6J פראי סוג עכברים ועכברים Nf123aIN/23aIN מוטציה ברקע C57BL/6J, ב אקסון אילו 23a נכלל כל סוגי תאים כתוצאה מכך מהונדסים splice באתר מוטציות14,15.

כצעד ראשון, המערכת assay איש נבדקה באמצעות החברה מסופקים ריאגנטים: שקופיות שיש תאים 3T3, ואת שלילי חיובי איש רגשים. כפי שמוצג

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקשורת זו מדווחת על השימוש BaseScope איש RNA לבדוק דפוסי ביטוי בסעיפים מוח העכבר. הוכח שבצומת הזה תחושה אנטי אקסון-אקסון רגשים קצרים יותר נוקלאוטידים 50 ניתן לייעד אקסון הכללה ולהקפיץ איזופורמים robustly, במיוחד. יתר על כן, האותות וכתוצאה מכך יכול לשמש כדי לחשב PSI של אקסון חלופית.

כמה וריאציות נבדקו במסגרת ההליך. לדוגמה, מקטעי רקמת קפוא שנוצר על ידי חלוקתה cryostat היו נבדקו והוכחה יעילותן כדי להצליח לשימוש בפרוטוקול איש זה. במקרה זה, עם זאת, הצעד deparaffinization 2.1 השתנה ל ניקוי של OCT עם...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקני [מענק הסיוע 0365274B כדי מרגשת], מכון הסרטן הלאומי [GI נבג P50CA150964 ל ז. ו.], מכוני הבריאות הלאומיים [Office של מחקר תשתית משותפת מכשור גרנט S10RR031845 כדי מיקרוסקופ אור הדמיה המתקן ב אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב], סין מלגת המועצה [עד X.G.].
המחברים תודה ריצ'רד לי אור מיקרוסקופ הדמיה הליבה על עזרתו עם מגלשה סריקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>ציוד
היברידיזציה תנורמתקדם לאבחון תאים241000ACD
מגש בקרת לחות (עם מכסה)אבחון תאים מתקדם310012
מתלה כתמים310017
מתקדם פלטה חמהפישר סיינטיפיק1160049SH
אימפריאל III חממה לשימוש כללימעבדה-קו302
סורק שקופיותLeicaSCN400
Name<strong>CompanyCatalog NumberComments
>Reagents
< ערכת טיפול מקד>ים חזקהאבחון תאים מתקדם322381
מי חמצןאבחון תאים מתקדם2000899
פרוטאז III*אבחון תאים מתקדם2000901
אחזור מטרה 10xאבחון תאים מתקדם2002555
ערכת ריאגנטים לזיהוי BaseScopeאבחון תאים מתקדם332910
AMP 0אבחון תאים מתקדם2001814
AMP 1אבחון תאים מתקדם2001815
AMP 2אבחון תאים מתקדם2001816
AMP 3אבחון תאים מתקדם2001817
AMP 4אבחון תאים מתקדם16229B
AMP 5-REDאבחון תאים מתקדם16229C
AMP 6-REDאבחון תאים מתקדם2001820
מהיר RED-Aאבחון תאים מתקדם2001821
מהיר RED-Bאבחון תאים מתקדם16230F
50x מאגר שטיפהאבחון תאים מתקדם310091
בדיקה בקרה שלילית- עכבר DapB-1ZZאבחון תאים מתקדם701021
בדיקה בקרה חיובית- עכבר (מ"מ)-PPIB-1ZZאבחון תאים מתקדם701081
בקרת שקופיות-עכבר 3T3 גלולת תאיםמתקדמת310045
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>אספקה אחרת
נייר לחותמתקדם אבחון תאים310015
מתלה כביסהאמריקאי מאסטר טק מדעי9837976
שטיפת כליםאמריקאי מאסטר טק מדעיLWS20WH
מחסום הידרופובימעבדה וקטוריתH-4000
זכוכית שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
כיסוי זכוכית, 24 מ"מ x 50 מ"מפישר סיינטיפיק12--545-F
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>כימיקלים
אמוניום הידרוקסידפישר סיינטיפיק002689
100% אתנול (EtOH)Decon Labs2805
תמיסת פורמלדהפישר סיינטיפיקSF94-4
המטוקסילין Iאמריקאי מאסטר טק סיינטיפיק17012359
הרכבה מעבדות וקטור בינוניH-5000
קסילןפישר סיינטיפיק173942
עט

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
  3. Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
  4. Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806(2015).
  5. Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
  6. Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
  7. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114(2014).
  8. Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
  9. Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
  10. Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
  11. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  12. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  13. Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
  14. Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
  15. Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
  16. Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
  17. Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
  18. Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
  19. Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  20. Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Alternative Splicing AnalysisRNA In Situ HybridizationBaseScope TechnologyExon Inclusion DetectionExon Skipping DetectionPercent Spliced In CalculationMouse Brain SectionsNF1 Exon 23aProbe HybridizationSignal Amplification

Related Articles