מאמר שיטה

ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה

DOI:

10.3791/57904

⸱

11 באוגוסט 2018

 ,  ,  ,  , 
1Biochemistry Program, Wellesley College, 2Department of Chemistry, Wellesley College, 3Department of Biological Sciences, Wellesley College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצר גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) spheroplasts, גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) protoplasts כדי להמחיש באופן ברור ולאפיין במהירות אינטראקציות פפטיד-חיידקים. זה מספק שיטה שיטתית כדי להגדיר ממברנה ההתאמה לשפות אחרות, translocating פפטידים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית כשיטה להעריך פפטיד תבניות לוקליזציה בתוך חיידקים בדרך כלל מעוכב לגבולות ברזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי. כמו הרזולוציה עבור מיקרוסקופ נתון לא יכול להיות משופרת בקלות, אנו מציגים פרוטוקולים להפוך את קטן בצורת מוט גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) ואת גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) בטפסי כדורית, בקלות תמונה גדולים נקרא spheroplasts או protoplasts. שינוי זה מאפשר משקיפים במהירות ובבהירות לקבוע אם פפטידים lodge עצמם לתוך קרום חיידקי (קרי, ממברנה לוקליזציה) או לעבור את הממברנה כדי להזין את התא (קרי: translocating). מתוך תפיסה זו, אנו מציגים גם שיטה שיטתית כדי לאפיין פפטידים כמו קרום לוקליזציה או translocating. ואילו בשיטה זו יכול לשמש למגוון רחב של פפטידים ממברנה-פעיל, זני חיידקים, נדגים את התועלת של פרוטוקול זה על ידי התבוננות האינטראקציה של Buforin השני P11A (BF2 P11A), פפטיד מיקרוביאלית (אמפר), עם e. coli spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פפטידים מיקרוביאלית (אמפר) השיגו תשומת לב בשל שימושם פוטנציאליים כחלופות אנטיביוטיקה קונבנציונלית1,2,3,4,5. מגברים להרוג חיידקים על ידי translocating על פני קרום התא או אינטראקציה עם רכיבים תאיים כגון חומצות גרעין, או על-ידי permeabilizing קרום גורמת זליגת של תוכן התא6. בנוסף, השימוש בהם כמו אנטיביוטיקה translocating אמפר שעשוי להיות מותאם עבור יישומים משלוח סמים כי הם יכולים לעבור ללא disruptively7,את קרום התא אטום8. אנו, לכן מבקשים להבין את המגבר הבסיסי, מנגנוני פעולה כדי להניח את הבסיס לשימוש שלהם בעיצוב סמים.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מציע דרך להערכת לוקליזציה דפוסי אמפר fluorescently שכותרתו תאים חיידקיים לספק תובנות שלהם מנגנון פעולה9,10,11,12, 13 , 14. על-ידי תיוג הקרום של החיידקים, ניתן לקבוע אם פפטיד fluorescently שכותרתו רגישה הקרום או המרחב תאיים של תא החיידק. עם זאת, טכניקה זו הוא מוגבל על ידי הצורה הגודל של רוד קטנה של חיידקים, אשר יכול לגרום הדמיה מאתגר עקב לגבולות ברזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ואת הכיוון משתנה של החיידקים על שקופית15.

מטרת השיטה הציג היא לאפשר הדמיה משופר של הדפוסים לוקליזציה פפטיד fluorescently שכותרתו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ויזואליזציה היא משופרת על-ידי הפעלת את קטן, דק וקל מוט בצורת גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) ואת גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) חיידקים בטפסי מוגדלת, כדורית המכונה spheroplasts (עבור זנים גראם שליליים), protoplasts (עבור זנים גראם חיוביים)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts ו- protoplasts הם קל יותר התמונה בשל גודלם מוגבר והן צורתם סימטרי, מה שהופך את הכיוון של חיידק בשקופית לא רלוונטי עבור הדמיה שלה. בנוסף, אנו מציגים בגישה שיטתית לנתח באופן כמותי מיקרוסקופיה קונפוקלית נתונים על מנת לאפיין אמפר כמו גם קרום לוקליזציה או translocating. יישום שיטות אלה מקל להבחין fluorescently שכותרתו פפטיד לוקליזציה דפוסים. הפרוטוקולים המובאות כאן ניתן להעריך הלוקליזציה של מגוון של ממברנה-פעיל סוכני חוץ אמפר, לרבות פפטידים חודר לתא.

אחד יתרון משמעותי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תובנות מנגנון הפעולה של מגברים ברמה תא בודד, אשר עלול לגלות-לתא הטרוגניות15, לעומת שאר מבחני פלורסצנטיות נפוץ כדי לזהות מנגנוני הפעולה של מגברים, אשר מספקים רק בצובר הערכות9,22,23,24,25. השימוש spheroplasts ו- protoplasts על מנת להעריך את ערך התא המגבר הוא שימושי במיוחד26 כי הם רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית15 מאשר דגמים אחרים בשימוש להערכת ערך התא, כגון שלפוחית השומנים24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פתרון הכנה

הערה: להכין פתרונות שתואר בשלבים 1.1 – 1.9 ו- 1.8-1.11 כדי לייצר e. coli spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts, בהתאמה.

  1. להכין 1 מ' טריס-קלרנית, pH 7.8 על ידי המסת 10.34 g טריס HCl ו- g 4.17 של טריס או ב- 50 מ של dH2O בבקבוקון 125 מ ל. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  2. להכין פתרון (20 מ מ MgCl2, 0.7 M סוכרוז, 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 7.8) על ידי המסת 0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) ו- 11.98 g סוכרוז (342.3 g/mol) 25 מ ל dH2O בבקבוקון 125 מ. להוסיף 500 µL 1 מ' טריס-קלרנית (pH 7.8) ולכוונן את העוצמה עד 50 מ"ל. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  3. להכין פתרון B (10 מ מ MgCl2, 0.8 מ' סוכרוז, 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 7.8) על ידי המסת 0.05 גרם MgCl2 (95.2 g/mol) ו- 13.69 g סוכרוז (342.3 g/mol) 25 מ ל dH2O בבקבוקון 125 מ. להוסיף 500 µL 1 מ' טריס-קלרנית (pH 7.8) ולכוונן את העוצמה עד 50 מ"ל. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  4. להכין סוכרוז 0.8 מ' על ידי המסת 13.69 גרם סוכרוז (342.3 g/mol) 50 מ ל dH2O בבקבוקון 125 מ. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  5. להכין 5 מ"ג/מ"ל deoxyribonuclease אני (DNase אני) על ידי המסת 0.015 גרם DNase. אני ב- 3 מ"ל של dH2O בבקבוקון 50 מ ל. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום מיקרומטר 0.2. פתרון aliquot לתוך צינורות microfuge, חנות ב-20 ° C.
  6. הכנת 0.125 מ' ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), pH 8.0 על ידי המסת 0.698 g EDTA ניתרן (372.2 g/mol) מייבשים לתוך 15 מ"ל dH2O בבקבוקון 125 מ. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  7. להכין cephalexin µg/mL 600 על ידי המסת 0.03 נקודות גר' cephalexin הידרוקסיד (365.404 g/mol) ב- 50 מ של dH2O בבקבוקון 125 מ. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי ב 4 º C.
  8. להכין 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים על ידי המסת ליזוזים 0.015 גרם ב- 3 מ"ל של dH2O בבקבוקון 50 מ. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום מיקרומטר 0.2. פתרון aliquot לתוך צינורות microfuge, חנות ב-20 ° C.
  9. להכין 3% w/v ציר סויה Trypticase (TSB) על ידי המסת 30 גר' TSB ב- 1 ליטר של dH2O בבקבוקון 2 ל'. Aliquot הפתרון לתוך מבחנות המכילות 25 מ ל או 100 מ ל TSB כדי לשמש בהכנה של e. coli spheroplasts או megaterium נולד ב- protoplasts, בהתאמה. אוטוקלב מבחנות לחטא המדיום הנוזלי. TSB סטרילי ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר או 4 ° C.
  10. להכין פתרון C (1 M סוכרוז maleate 0.04 M, 0.04 M MgCl2, pH 6.5) על ידי המסת סוכרוז 34.23 g (342.3 g/mol), חומצה maleic 0.46 g (116.07 g/mol) ו 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) ב- 100 מ של dH2O בבקבוקון 250 מ. להתאים את ה-pH ל 6.5. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  11. להכין 200 מ ל פרוטופלאסט בינוני על ידי ערבוב 100 מ ל 3% w/v TSB 100 מ ל פתרון C בבקבוק זכוכית 1 ליטר. אוטוקלב לעקר את הפתרון ולאחסן בטמפרטורת החדר.

2. הכנת תרבות לילה

הערה: ביצוע סעיפים 2-4 תוך שימוש בטכניקות סטרילי המתאים. אם רצונך בכך, זן חיידקי יכול להכיל פלסמיד של עמידות לאנטיביוטיקה לצמצם את זיהום פוטנציאליים. אם משתמש זן עם עמידות לאנטיביוטיקה, להוסיף את האנטיביוטיקה נחוץ בשלבים 2.1, 3.1 – 3.2, ו- 4.1-4.4.

  1. להכין תרבות הלילה על-ידי בחירת מושבה בודדת של חיידקים באמצעות טיפ פיפטה סטרילי והצבתו לתוך צינור תרבות 14 מ"ל, המכיל 2-3 מ"ל של 3% w/v TSB. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול עבור h 16 – 21.

3. הכנת גראם שליליים e. coli Spheroplasts

  1. בבקבוקון 250 מ ל, לדלל את בטחונות תרבות לילה בכרך 25 מ של 3% w/v TSB, דגירה הפתרון חיידקי ב 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול עבור 2.5 h עד הפתרון הגיע של צפיפות אופטית של 0.5-0.8 על 600 ננומטר. למדוד הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטרים.
  2. בבקבוקון 250 מ ל, לדלל את תרבות 1:10 ב 30 מ של 3% w/v TSB, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול עבור 2.5 h בנוכחות cephalexin µg/mL 60 (347.4 g/mol) כדי לייצר תא בודד חוטים של 50 – 150 מיקרומטר באורכו , אשר מהן נצפות תחת 1,000 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 1B).
  3. הקציר של חוטים מאת צריך שתוציאו את הפתרון חיידקי ב 1,500 x גרם, 4 ° C עבור 4 דק Decant ולמחוק את תגובת שיקוע, את הזמנת את גלולה.
  4. לשטוף את חוטים על-ידי הוספת 1 מ"ל של סוכרוז 0.8 מ', נזהר שלא להפריע בגדר בעדינות. תקופת דגירה של 1 דקות, ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.
  5. להוסיף 150 µL של 1 מ' טריס-קלרנית (pH 7.8), µL 120 של 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים, 30 µL של 5 מ"ג/מ"ל DNase ואני µL 120 של 0.125 מ' EDTA ב שלהם בהתאמה כדי בגדר, דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  6. להוסיף 1 מ"ל של פתרון A בהדרגה מעל 1 דקות הפתרון המבושלות 3.5 באמצעות micropipette בעוד בעדינות מתערבל הפתרון בעבודת יד. דגירה הפתרון עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. מכניסים 7 מ של פתרון 4 ° C B שני צינורות חרוט 15 מ"ל. להוסיף כמויות שוות של הפתרון המבושלות 3.6 לכל אחד שני צינורות אלה. Centrifuge הפתרון ב 1500 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
  8. שימוש של פיפטה סרולוגית, הסר בזהירות והכל אבל תגובת שיקוע–מ 2 ל 1 מבלי להפריע בגדר. Resuspend בגדר מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה באמצעות micropipette של P1000. בדיקה חזותית לראות היווצרות spheroplasts על ידי התבוננות המדגם-1,000 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 1C).
  9. אחסן את spheroplasts ב-20 מעלות צלזיוס במשך שבוע, או עד שהם עברו 3 מחזורים ההקפאה-הפשרה.

4. הכנת גראם חיוביים megaterium נולד ב- Protoplasts

  1. בבקבוקון 250 מ ל, לדלל את 1:1,000 תרבות לילה ב- 100 מ של 3% w/v TSB, דגירה הפתרון חיידקי ב 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול עבור 4.5 h עד הפתרון הגיע של צפיפות אופטית של 0.9–1.0 ב 600 ננומטר. למדוד הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטרים.
  2. שופכים את התרבות נוזלי לתוך שני צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 2,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. שימוש של פיפטה סרולוגית, למחוק את תגובת שיקוע של שני צינורות חרוט. Resuspend כל גלולה במדיום פרוטופלאסט 2.5 מ ל ולשלב את הפתרונות resuspended לתוך צינור חרוטי בודד. Pipette הפתרון resuspended משולב בבקבוקון 125 מ.
  4. להוסיף 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול.
  5. לפקח על הגידול של protoplasts תחת 1,000 x הגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור, וציין חריגות, כגון חיידקים המופיעים כמצייני מוטות נפוחות במקום הספירות (איור 2). שימוש של פיפטה סרולוגית, להעביר את הפתרון צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 2,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. Decant את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה בתקשורת פרוטופלאסט מ. חנות protoplasts ב-20 מעלות צלזיוס במשך שבוע, או עד שהם עברו 3 מחזורים ההקפאה-הפשרה.

5. הכנת פפטיד פתרון וצבע קרום עבור הדמיה

  1. פתרון פפטיד
    1. צינור microfuge עטוף בנייר אלומיניום, לפזר 2 מ ג של FITC הנקרא BF2 P11A 800 µL dH2O. שימוש פפטיד המכיל משקע טריפטופן אחד לפחות כדי לאפשר לבצע מדידות ריכוז חלבון.
    2. . Spectrophotometrically, למדוד את ספיגת של הפתרון פפטיד ב 280 ננומטר דולר. חשב את ריכוז פפטיד באמצעות המקדם הכחדה טוחנת טריפטופן (5700/מלמ ק).
    3. לדלל את ריכוז פפטיד ב- dH2O כדי ריכוז סופי של 200-100 מיקרומטר. חנות צינור microfuge ב-20 ° C עטופות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.
  2. ממברנה לצבוע
    1. צינור microfuge, להכין מלאי 10 מ מ של די-8-ANEPPS (592.9 g/mol) על ידי המסת 5 מ"ג של די-8-ANEPPS ב µL 843.3 של דימתיל סולפוקסיד. לאחסן ב 4 ° C עטופות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.
    2. צינור microfuge, להכין 1 מ"ל של 0.03 נקודות מ מ di-8-ANEPPS על-ידי הוספת 3 µL של 10 מ מ di-8-ANEPPS 997 דימתיל סולפוקסיד µL. לאחסן צינור microfuge ב 4 ° C עטופות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.

6. ויזואליזציה של e. coli Spheroplasts, נולד ב- megaterium Protoplasts באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. פיפטה 5 µL של spheroplasts או protoplasts לשקופית פולי-L-ליזין מצופה זכוכית. להוסיף 2 µL של FITC עם התווית המגבר (100-200 מיקרומטר) לשקופית ולאחר תקופת דגירה של 3 דקות מוגן מפני אור.
  2. להוסיף 1 µL של קרום לצבוע di-8-ANEPPS (0.03 נקודות מ מ) לשקופית ולאחר תקופת דגירה של 3 דקות מוגן מפני אור. מכסה עם coverslip זכוכית, חותם עם הלק.
  3. הפעל את לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ וארגון. התאם ללייזר פלט חשמל 20% ולא 20% שידור.
  4. הגדר פליטה טווחים אורך הגל של 499-532 ננומטר, 670 – 745 nm כדי להפוך את התווית על-ידי FITC פפטיד פליטה ערוץ di-8-ANEPPS-הנקרא קרום לצבוע פליטה ערוץ, בהתאמה.
  5. תמונה protoplasts או spheroplasts (איור 1 ו- 2 איור) עם יעד X 63. בתוכנת הדמיה כדי להשיג 8 סיביות, תמונות 512 x 512 מרוכבים z-בערימה המורכב 0.5 מיקרומטר פרוסות של מכלול של spheroplast או פרוטופלאסט.
    הערה: לקחת שיקול דעת זהיר כדי להפחית את הפליטה בליד-דרך בעוד דימות spheroplasts ו protoplasts. ראה דיון לפרטים.

7. אפיון של המגבר לוקליזציה

  1. פתחו את התמונה ללא הפרדות צבע z-מחסנית ב תוכנות ליצירת תמונות. לאתר הפרוסה מרכז ביותר של spheroplast או פרוטופלאסט ומניחים אחד מעגלי באזור של הריבית (ROI) (0.3 מיקרומטר בקוטר) על הקרום (רועי 1), אחד במרכז של spheroplast או פרוטופלאסט (רועי 2), ואחד spheroplast או פרוטופלאסט למדוד קרינה פלואורסצנטית הרקע (רועי 3) (איור 5). הימנע ההכללה של פיקסלים רוויים. ניתן לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב- ROI כל על ידי הדמיה בתוכנה.
    הערה: במקרים כאשר פפטיד בתרגום לא כדי מכלול של הקרום, ציירו רועי 1 על שטח של הקרום איפה פפטיד הוא מקומי.
  2. להשתמש במשוואה הבאה כדי לקבוע את היחס בין פפטיד תאיים עוצמת קרינה פלואורסצנטית כדי עוצמת קרינה פלואורסצנטית פפטיד ממברנה:
    figure-protocol-1
    הערה: עוצמת קרינה פלואורסצנטית רועי 3 זה הוחסרו מ עוצמות קרינה פלואורסצנטית 2 רועי, רועי 1 כהתאמה רקע זריחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי הגדלת חיידקים ולגרום להם כדורית, אנו יכולים להבחין בקלות בין אם פפטידים בתרגום קרום החיידק או translocate בקלות על פני קרום חיידקי. הגבולות ברזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי שיהיה מאתגר כדי להבחין אם אותות פפטיד מתעוררות ממברנה או שטח תאיים בחיידקים נורמלי כי אותות מקומית את הקרום יופיע כדי חפיפה עם שטח תאיים (איור 3 א). לעומת זאת, מוגדל לגודל spheroplasts (2-5 מיקרומטר) ו- protoplasts (2-3 מיקרומטר) לעומת חיידקים נורמלי, אשר בדרך כלל רק 1 מיקרומט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים המובאת כאן לעשות את זה אפשרי לחוקרים במהירות רבה יותר לקבל גודל מדגם גדול יותר של תמונות חיידקי כי החיידק מוגדלת, כדורית הם הרבה יותר קל לאתר, אוריינט של התמונה. היכולת המשופרת לאיסוף נתונים יקר במספר אופנים. ראשית, הוא מאפשר ניתוח כמותי שיטתית יותר דפוסי לוקליזציה פפטיד. בעוד מגמות איכותי ניתן להדגים מערכות קטנות יותר של תמונות, רק ערכה מדגם גדול של תמונות באיכות גבוהה לחשוף יותר דקויות מגמות דפוסי לשפות אחרות, כגון אחוז תאים איפה פפטיד translocates נגד. רגישה ממברנה. בנוסף, היכולת לפתור יותר זריחה פנימי מן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי עניינים מוצהרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ופרס מחלות זיהומיות (NIH-NIAID) R15AI079685.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טריזמה הידרוקלוריד (Tris HCl)סיגמאT3253
בסיס טריזמה (Tris OH)סיגמאT1503
מגנזיום כלורידסיגמאM8266
סוכרוזסיגמאS7903
ליזוזיםסיגמאL6876
דאוקסיריבונוקלאז IסיגמאD4527
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתSigma106361השתמשו ב-Sigma 106361 בפיתוח הפרוטוקול המקורי; 106361 הופסק עם ED2SS כתחליף
Cephalexin hydrateSigmaC4895
AmpicillinScientific Fisher ScientificBP1760
BBL מרק סויה TrypticaseFisher ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificבהזמנה
di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869השתמש ב-Sigma D8779 בפיתוח פרוטוקול מקורי; D8779 הופסק עם 34869 כתחליף
חומצה מאליתSigmaM0375
Acrodisc מסנן מזרק 25 מ"מ עם 0.2 μ m HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזרLeica MicrosystemsTCS SP5 IIלרכישת תמונות
Leica Application Suite, פלואורסצנטי מתקדםLeica Microsystemsלעיבוד תמונה
מותאמת אישית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571(2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

E coliB megaterium

מאמרים קשורים