Method Article

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

DOI:

10.3791/57920

⸱

September 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-RNAs (miRNAs) הן תעתיקים RNA חד-גדילי לאגד RNAs שליח (mRNAs) ו לעכב את התרגום שלהם או לקדם את שפלותם. עד כה, miRNAs היו מעורבים מספר רב של תהליכים ביולוגיים ומחלות, אשר יש למסומן את הצורך בשיטות זיהוי אמין של תעתיקים miRNA. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לגילוי התווית על-ידי digoxigenin (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם) המבוסס על בדיקה miRNA, בשילוב עם חלבון immunostaining על העכבר לב חלקים. ראשית, אנו לבצע בחיי עיר הכלאה טכניקה באמצעות המכשיר לזיהוי miRNA-182 ביטוי בסעיפים הלב של שליטה ועכברים היפרטרופיה. הבא, נוכל לבצע immunostaining לב החלבונים טרופונין T (cTnT), על הסעיפים זהה, כדי להתאים לשפה משותפת miRNA-182 עם תאי cardiomyocyte. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לזהות miRNA-182 דרך phosphatase אלקליין המבוסס על ערכי צבע מוחלטים assay, cTnT דרך מכתים פלורסנט. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות את הביטוי של כל miRNA עניין באמצעות מגבר קדם התווית על-ידי החפירה הגששים, וביטוי חלבון הרלוונטיים במקטעי רקמת הלב העכבר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם קצרים (18 – 25 נוקלאוטידים), RNAs חד-גדילי, noncoding המתפקדים הרגולטורים שלילי של ביטוי גנים ברמת post-transcriptional על ידי עיכוב תרגום RNA שליח (mRNA) ו/או קידום mRNA השפלה 1. miRNAs הם עיבד אינטרונים או exons של קידוד או noncoding גנים והם ביקע בגרעין על-ידי DROSHA, כדי קודמן miRNAs (pre-miRNAs), אשר הם גזע-לולאת מבנים של נוקלאוטידים 702. בעקבות cytoplasmic לייצא, pre-miRNAs מעובדים נוספים על ידי לטעמים לתוך miRNAs בוגרת המתפרסים על פני 18 – 25 נוקלאוטידים3,4. לאחר מכן, המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) משלבת miRNAs האלה כמו RNAs חד-גדילי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העכבר דגימות רקמות הלב במחקר זה התקבלו בדרישות הרלוונטיות חוקים והנחיות מוסדיים ואושרו על-ידי ייל אוניברסיטת אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. פתרון הכנה

  1. הכנת RNase ddH חינם2O, על ידי טיפול 5 L של ddH2O עם 5 מ של 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) בין לילה (O/N), בטמפרטורת החדר (RT). אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס) כדי לבטל את DEPC. שימוש ddH שטופלו DEPC2O עבור ההכנה של פתרונות במורד הזרם כמו מצוינת.
    התראה: DEPC הוא חומר מסרטן ידוע, לטפל רק בשכונה fume.
  2. להכין 1 x פוספט Buffered מלוחים (PBS) פתרון על ידי המסת טבליות PBS 5 ב- 1 ליטר של ddH שטופלו DEPC2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA בחיי עיר הכלאה אופטימלי במקטעי הלב העכבר באמצעות לטרוף miRNA U6-snRNA, אשר שימש ואתאיזם הפקדים בהתאמה. צביעת חיובי מסומן בכחול, בעוד ההכתמה שלילי הוא הצביע על ידי חוסר צבע פיתוח (איור 1A-1B). Cardiomyocyte ביטוי מסוים של miRNA-182 הוערכה בסעיפים הלב של שליטה ועכברים overexpressing PlGF. העכברים נושאת את transgene PlGF תחת מקדם αMHC מפתחים היפרטרופיה, משני אנגיוגנזה מוגברת, בתוך 6 שבועות של הפעלת transgene26

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי תעתיק miRNA יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקות שונות המשתנות רגישות, ירידה לפרטים, כוח כמותית. . הנה, נדגים את צימוד miRNA בחיי עיר הכלאה עם immunostaining. ומתארות פרוטוקול המאפשר להערכת בו-זמניות של רמות הביטוי של מולקולות miRNA, חלבון, על הלב הנוכשה. אנו הראשונים מראים כיצד לבצע בחיי עיר הכלאה של התווית על-ידי החפירה מגבר קדם miRNA הגששים במקטעי הלב פרפין מוטבע. בשלב הבא, אנו נתאר כיצד לבצע immunostaining עבור cTnT על הסעיפים זהה. לבסוף, נדגים כיצד למזג את צבע שנוצר ואת התמונות פלורסנט. פרוטוקול.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות אנטאנאסיוס Papangelis, על תגובות ביקורתיות על כתב היד. FM נתמך על-ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC; BB/M009424/1). IP נתמך על ידי האמריקאי הלב האגודה מדען פיתוח המענק (17SDG33060002).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דיאתילפירוקרבונטסיגמא אולדריץ' D5758DEPC
פוספט חוצץ מלחסיגמא אולדריץ'P4417PBS
Tween-20פעילי שטח לא יוניAB02038ביואנליטי
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinase K, רקומביננטי, סיגמאאולדריץ'3115879001ProK
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148PFA
נתרן כלוריThermoFisherS271NaCl
מגנזיום כלוריד הקסהידראטThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
תמיסת חומצה הידרוכלורית, 1 NThermoFisherSA48HCl
תמיסת חומצה הידרוכלורית, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-MethylimidazoleSigma Aldrich336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma Aldrich39391EDC
תמיסת מי חמצן H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodium citrate dihydrateSigma AldrichS1804נתרן ציטראט
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450ערבול miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 בדיקה לזיהויQIagenYD006157015'-DIG ו-3'-DIG שכותרתו
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742
סרום בקר אלבומיןסיגמא AldrichA9647טבליות BSA
NBT/BCIPסיגמא אולדריץ'11697471001NBT-BCIP
אשלגן כלוריThermoFisherP217KCl
תמיסת DAPI (1 מ"ג/מ"ל)ThermoFisher62248
DAPI כיסוי זכוכיתThermoFisher12-545Eכיסוי זכוכית
כיסוי פלסטיקGrace Bio-LabsHS40 22 מ"מX40 מ"מX0.25 מ"מRNA-ase כיסוי פלסטיק
ללא אנטי-Digoxigenin-AP, שברי FabSigma Aldrich11093274910DIG נוגדן
מחסום הידרופובי VectorLaboratoriesH-4000עט פאפ
נוגדן אנטי לב טרופונין T נוגדןAbcamab92546cTnT נוגדן
עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011אנטי-ארנב-568 נוגדן
Dako פלואורסצנטי הרכבה בינוניDAKOS3023הרכבה בינונית
סרום כבשיםסיגמא אולדריץ'S3772
סרום עיזיםסיגמא אולדריץ'G9023
פורמיד אמריקאי נטול יונים
ThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer
חומר אמריקאי בדרגת PCR תנור היברידיזציה AB00600 ביואנליטי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationMicroRNA DetectionMouse Heart SectionsProtein ImmunostainingCardiac Troponin TDigoxigenin Labeled ProbeLocked Nucleic AcidAlkaline Phosphatase AssayFluorescent StainingTissue Section Preparation

Related Articles