הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

8.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57926

⸱

30 ביולי 2018

 ,  ,  , 
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.

תקציר

שינוי צורה של גורם גדילה איתות β (TGF-β) מסדיר תפקידים חשובים רבים הדרושים עבור הסלולר הומאוסטזיס, נפוץ overexpressed במחלות רבות, כולל סרטן. TGF-β הוא בחריפות בהפרות גרורות במהלך התקדמות סרטן בשלב מאוחר, הפעלת קבוצת משנה של תאים סרטניים נודדות ופולשני. השיטות הקיימות עבור ניתוח מסלול איתות להתמקד על הקצה של דגמים, אשר לעיתים קרובות מנסים למדוד איתות פוסט-הוק של אירוע ביולוגי, ואינם משקפים את אופי המחלה מתקדמת. . הנה, נדגים מסוים מערכת הכתב הרומן אדנו עבור מסלול איתות TGF-β/Smad3 שיכול לזהות הפעלת גנים ברמת השעתוק בתאים חיים. ניצול של הכתב Ad-CAGA12-Td-טום , ניתן להשיג שיעור זיהום 100% של מד א-MB-231 תאים בתוך 24 שעות בתוך חוץ גופית. השימוש של עיתונאי פלורסנט מאפשר הדמיה של תאים בודדים בשידור חי ב בזמן אמת עם זיהוי ישיר של תאים transcriptionally פעיל. גירוי של תאים נגועים עם TGF-β מציג רק תת-ערכה של תאים transcriptionally פעיל ומעורב תפקודים ביולוגיים ספציפיים. גישה זו מאפשרת ירידה לפרטים גבוהה ורגישות ברמה תא בודד כדי לשפר את ההבנה של תפקודים ביולוגיים הקשורים TGF-β איתות במבחנה. Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק ניתן גם דיווח ויוו ב בזמן אמת באמצעות היישום של Ad-CAGA12- לוק כתב. לספירה-CAGA12- לוק ניתן למדוד באופן זהה כקווים תא לוציפראז stably transfected המסורתי. יכול להיות מנותח באמצעות הדמיה IVIS המקובלת ונשאר להשגחה חי במהלך התקדמות הגידול, לספק תובנה ייחודית הדינמיקה של מסלול איתות TGF-β Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק של תאים מושתלים ויוו . פרוטוקול שלנו מתאר מערכת משלוח כתב יתרון המאפשר הדמיה תפוקה גבוהה מהירה של תא חי מסלולי איתות גם במבחנה וגם בתוך vivo. בשיטה זו ניתן להרחיב מגוון של התמונה לפי מבחני במתנה בגישה לשחזור והרגיש יסוד ביולוגיה ופיתוח טיפולית.

מבוא

שינוי צורה של גורם גדילה β (TGF-β) הוא ציטוקין חיוני מעורבים בהתפתחות האדם כי אותות דרך heterodimeric קומפלקס המורכב מסוג II ו סוג אני קולטנים1. איגוד לסוג קולטן II תוצאות הגיוס, זרחון של סוג אני קולטן, אשר בתורו phosphorylates במורד הזרם Smad2/3 חלבונים2,3. אלה מופעלות Smad2/3 חלבונים לאגד Smad4, יוצרים קומפלקס translocates לתוך הגרעין ומסדיר שעתוק גנים4. בתנאים homeostatic TGF-β/Smad איתות בחוזקה מוסדר; עם זאת, מחלות רבות, מסלול איתות הוא deregulated, לעיתים קרובות overexpressed המוביל התקדמות של המחלה5,6,7. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תגובת תאי TGF-β heterogenous, subpopulations של תאים פעילים TGF-β/Smad אחראים על תפקוד ביולוגי ב8,באופן תלוי-זמן9. ניתוח הסלולר הנפוצות של TGF-β/Smad איתות כרוך השימוש של מבחני קבוע נקודת הקצה לספק רק תמונה של פעילות תאית, לעיתים קרובות quantitate של אפקט ממוצע TGF-β/Smad10. שיטות אלו, עם זאת, לא במדויק ייצגו ההתנהגויות מולקולרית של TGF-β/Smad איתות במצב פיזיולוגי במהלך התקדמות המחלה. תמונה מבוססי ניתוח של תאים חיים ללכוד את הדינמיקה של הסלולר תהליכים ביולוגיים עם הבנה הן יכולות.

המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה תפוקה גבוהה רגיש של תא חי הדמיה של TGF-β/Smad איתות באמצעות ריאגנטים המבוסס על אדנו. כאן, אנחנו נגועים הקו התא סרטן השד אנושי מד א-MB-231 עם אדנו המבטאת את רצף מחייב מוטיב Smad3 CAGA, לוציפראז (לוק) או Td-עגבניות (Td-טום) מדווח. מערכות כתב adenoviral מספקות שיטה מהירה וזולה מבוא פלסמיד שיכול לגרום שיעור זיהום 100% של שורות תאים סרטן. מערכות כתב adenoviral גם הוחלו בהצלחה על שורות תאים שקשה transfect עם פלסמיד קונבנציונאלי11. ב פרוטוקול זה נתאר תהליך לא פולשנית הדירים להשגת תא חי הדמיה של מסלול איתות TGFβ/Smad הן vivo והן בתוך חוץ גופית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת מלבורן חיה ועדת האתיקה.

הערה: פרוטוקול רצף, בנייה, דור עבור adenoviral המומנט pCMV-Td-עד תום, pAd-CMV-GFP ו p-לוק12לספירה-CAGA/Td-טום כבר שתואר לעיל11,12, 13. כל כיווני זמינים מסחרית.

1. וירוס כייל נוגדנים נחישות שימוש במינון 50%-ראגנטים זיהומיות (TCID50)

  1. להכין 1 x 106 תאים HEK293A 10 מ"ל של DMEM + 10% FBS מדיה.
  2. זרע µL 100 של השעיה תא לתוך כל טוב של צלחת תרבות תא 96-ובכן שטוח התחתונה.
  3. להכין 1 מ"ל של בטחונות לדילול המניות וירוס שלם בינוני. להוסיף µL 11 של וירוס מדולל כל טוב של עמודה 1.
  4. ביצוע דילולים 10-fold טורי ישירות בצלחת טוב 96 על-ידי ערבוב µL 11 של וירוס מדולל עם 100 µL תא השעיה עד לדילול הסופי של 1 x1012 מתמלאת. למרות תאים שאינם מחסידי בשלב זה, מספר התאים מועברים בין בארות נשאר קבוע.
  5. פיפטה 11 µL של כל דילול לתוך כל עמודה החל הדילול הגבוהה של 104. להחליף טיפים פיפטה כל דילול להגבלת צולבות על נגיפים.
  6. הוסף µL 11 של מדיה מווירוסים מלאה כדי עמודה 12 כפקד שלילי.
  7. תקופת דגירה צלחת של 7-10 ימים ב 37 ° C עם 10% CO2.
  8. באמצעות מיקרוסקופ, ציון מספר בארות בכל עמודה מציג סימנים של אפקטים cytopathic או ציטוטוקסיות. שקול חיובי טוב אם יש סימן לזיהום קיים.
  9. לחשב את השבר של בארות חיובי עבור כל דילול באמצעות את ריד, Muench השיטה הסטטיסטית (1938)14.
  10. לחשב את המרחק פרופורציונלית (PD) באמצעות: (A-50)/(A-B), כאשר A הוא אחוז התגובה לעיל או שווה ל- 50% ו- B הוא התגובה אחוז מתחת ל 50%.
  11. לחשב באמצעות TCID50 : 10X-PD, כאשר X הוא הדילול נותן מענה גדול מ-50%.
  12. לחשב כייל ויראלי מלהשתמש הבאות: (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. אדנו MOI נחישות

  1. זרע 1.0-1.5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 עם 500 μL DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 12 טוב צלחת (35% תא confluency, וולס 6 סה כ).
  2. לחשב את נפחי Ad-CMV-Td-טום המניות הדרושות 0, 250, 500, 2500, 5000 MOI באמצעות בעקבות הנוסחה: MOI = (נפח [μL] x PFU/μL) / מספר של תאים. Ad-CMV-Td-טום עם כייל עונה 1 פרק 1010 (PFU/mL), אמצעי האחסון להידבקות בווירוס MOIs הנדרשים הם 0, 3.75, 7.5, 37.5 ו- 75 μL בהתאמה.
  3. להדביק את התאים עם נפחי Ad-CMV-Td-טום סעיף 2.2 מחושב על ידי ישירות pipetting מניות ויראלי לתוך הבארות עם ערבוב יסודי.
  4. מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
  5. מסיר את המדיה מן הבארות, לתקן מיד את התאים עם 500 μL של 10% פורמלין במשך 5 דקות.
  6. האחות של פורמלין מבארות ולשטוף וולס עם μL 500 ל- PBS פעם אחת.
  7. כתם גרעין התא עם 500 μL של פתרון Hoechst במשך 5 דקות.
  8. הסר את הפתרון Hoechst ולשטוף הבארות עם 500 μL PBS 3 פעמים.
  9. התמונה החלבון Td-עגבניה, גרעין התא אות באמצעות 200 X הגדלה על מיקרוסקופ זריחה. לרגש חלבון Td-עגבניות-554 nm ו לצבוע Hoechst-352 ננומטר.
  10. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ כדי לקבוע את העבודה ש-MOI הדרושים עבור 100% זיהום של עגבניות Td-15.

3. התמרה חושית כפול-אדנו בתאים יחיד בשידור חי

  1. זרע 1.0-1.5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 עם 500 μL DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 12 טוב צלחת (35% תא confluency, וולס 2 סה כ).
  2. להדביק תאים עם 75 μL של Ad-CMV-GFP (כייל נוגדנים = 5 x 109 PFU/mL) ו- 7.5 μL של Ad-CAGA12-Td-טום (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL) כדי להשיג 2,500 למשרד הפנים, אשר ניתן להשיג 100% זיהום חיוביות.
  3. יטפל בתאים עם או בלי μL 0.25 של TGF-β לכל טוב (10 mg/mL במלאי, 5 ng/μL כמו הריכוז הסופי) מיד לאחר אדנו זיהום.
  4. מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
  5. התמונה תאים חיים עם שלב ניגודיות פלורסצנטיות מיקרוסקופ. לרגש GFP-470 nm וחלבון Td-עגבניות-554 ננומטר.
  6. לתקן תאים, כתם גרעין התא כפי שמתואר צעדים 1.6 - 1.9.
  7. התמונה החלבון Td-עגבניות ואת Hoechst כתם באמצעות מיקרוסקופ זריחה. לרגש את צבען Hoechst-352 ננומטר.
  8. שימוש ImageJ, לחשב שאחוז חיובי GFP ו- Td-עגבניות תאים15.

4. איתות התא יחידה בשידור חי, ריפוי פצעים Assay

  1. זרע 4-5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 1 מ ל DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 6 טוב צלחת (50% תא confluency, וולס 2 סה כ).
  2. להדביק את התאים עם 22.5 μL של Ad-CAGA12-Td-טום (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).
  3. מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
  4. לגרד שני קווים מצטלבים על השכבה תא של מכל קידוח באמצעות טיפ פיפטה P200.
  5. מסיר את המדיה הישנה מבארות והחלף 2 מ"ל של טרי 5% FBS מדיה עם או בלי μL 0.5 של TGF-β לכל טוב (10 mg/mL במלאי, 5 ng/μL כמו ריכוז סופי).
  6. מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 5 דקות, תמונות של אזורים שנבחרו הפצע באמצעות 100 X הגדלה במיקרוסקופ ניגוד שלב.
  7. מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
  8. קח תמונות של סגירת הפצע על האזורים כמו בעבר.
  9. לתקן את התאים, כתם גרעין התא, כפי שמתואר צעדים 1.6 - 1.9 והמחש Td-עגבניות אות אזור הפצע ואזור ללא פציעה באמצעות 200 X הגדלה על מיקרוסקופ זריחה.
  10. לכמת את אחוז תאים חיוביים Td-עגבניות הפצע ואזור ללא פציעה באמצעות תוכנת ImageJ15.

5. במבחנה לוציפראז Assay

  1. להכין השעיה תא של 3-5 x 10 תאים4 מד א-MB-231 1 מ"ל של המדיה DMEM המכילה 5% FBS.
  2. להדביק תאים הבולם עם 2.5 μL של Ad-CAGA12- לוק (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).
  3. זרע התאים הנגועים 96. ובכן צלחת-µL תאים/100 3000/טוב....
  4. מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
  5. להסיר את המדיה הישנה מבארות ולהחליף עם 100 µL של 5% טרי FBS מדיה עם או בלי μL 0.1 של TGF-β לכל טוב (1 mg/mL במלאי, 1 ng/μL כמו הריכוז הסופי), נוכחות או היעדרות של 0.17 μL של TGF-β מעכב לכל טוב (7 mg/mL במלאי 12 ng/μL כמו ריכוז סופי) (לא פורסם הרומן TGF-β ליגנד מלכודת חלבון, צ'ן. et al., עבודה).
  6. מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
  7. להפשיר את המצע מערכת assay לוציפראז והכן 1 x תא תרבות פירוק ריאגנט במים מזוקקים כפול (DDW).
  8. להסיר מדיה מן הבארות 96 ואת lyse וולס עם μL 50 1 x תא תרבות פירוק מאגר על קרח באמצעות של תפקודי לב / נשימה עם עצבנות עדין למשך 30 דקות.
  9. להעביר 30 μL של lysate מכל קידוח לתוך צלחת לוציפראז אטום ולאפשר את הצלחת לחמם לטמפרטורת החדר.
  10. על תוכנת luminometer, ליצור פרוטוקול חדש. בחרו ' מזרק 1 עם מדידות לפני ואחרי הזרקת. לקבוע מידות לפני הזרקת-1 s עבור אינטגרציה בזמןוהן עיכוב במדידה . עבור לאחר הזרקת המדידה, מוגדר נפח הזרקה µL 40 לעיכוב מדידה של 1 s לאחר הזרקת ו- 5 s זמן אינטגרציה. לאשר את ההגדרות על-ידי בחירת אישור.
  11. למקם את צינור מזרק DDW ולחץ על לחצן מזרק 1 תחת ההגדרות ראש הממשלה כדי לנקות את הצינור מזרק לפני השימוש. הבא להסיר את הצינור מזרק DDW והמקום באוויר ואחריו עוד שני מספרים ראשוניים של מזרק 1 ריקון כל פתרון באמצעות הרכבת התחתית. מקם את הצינור מזרק לתוך המצע גחלילית, שוב ראש הממשלה פעמיים כדי להכין את המצע.
  12. למקם את הצלחת לוציפראז אטום עם הדוגמיות luminometer ולבחור אפשרויות על התוכנה. לסמן את הבארות עניין ' ולחץ על ' החל'. הקש התחל למדוד לוציפראז אות.
  13. לאחר מדידות מלאה, להסיר ולשטוף את הצלחת עם מים. לשחזר את כל המצע הנותרים לתוך הצינור מזרק על ידי הנחת הצינור לתוך אוויר ואת ראש הממשלה מזרק 1 בחזרה לתוך צינור המצע גחלילית. למקם את צינור מזרק DDW ולבצע עוד שני מספרים ראשוניים לנקות את הצינור מזרק של כל מצע הנותרים.

6. תא לקראת חיים איתות דימות In Vivo

  1. 48 h לפני ההשתלה הגידול, זרע 2-3 x 10 תאים6 מד א-MB-231 לתוך 175 ס' ' מ2 מבחנות (10 מבחנות סה כ). התרבות התאים ב- 20 מ של המדיה DMEM המכילה 5% FBS ב 37 מעלות צלזיוס, 10% CO2.
  2. 24 שעות לאחר מכן, להוסיף 300 μL של Ad-CAGA12- לוק (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500) לתוך כל הבקבוק. לשמור תאים תרבות אחרת במשך 24 שעות ביממה.
  3. ביום של ההשתלה, מסיר את המדיה הישנה ולשטוף את התאים אדנו נגוע פעם אחת עם 20 מ של PBS, pH 7.4. להוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק, לנער את הבקבוק מעט כדי לאפשר טריפסין לכסות את כל השטח את הבקבוק. הניחו את הבקבוק ב כדי החממה 37 ° C, 10% CO2 למשך 3 דקות.
  4. להרוות את טריפסין על-ידי הוספת 8 מ של DMEM המכילים FBS מדיה לתוך מבחנות. העברת כל המתלים תא לתוך בקבוק ריאגנט זכוכית.
  5. לספור את מספר הנייד באמצעות hemocytometer והעבר 4.8 x 107 תאים שני צינורות צנטריפוגה 50 מ.
  6. Centrifuge התאים ב 400 g x עבור 5 דקות ב RT כדי להסיר טריפסין resuspend בתאים 720 מ"ל של מדיה FBS-DMEM טריים.
  7. להעביר את המתלים תא לתוך צינור סטרילי 5 מ"ל ולהוסיף 160 μL Matrigel (matrigel סה כ 10% השעיה).
  8. לשמור תאים על הקרח עד ההשרשה.

7. Orthotopic-השרשה

  1. שוקל 12 SCID עכברים ולהקצות באופן אקראי עכברים קבוצות בקרה וטיפול (6 עכברים/קבוצה).
  2. ביצוע ההשתלה ביו-ארון סטרילי כדי לשמור על סביבה נקייה. להרדים את העכבר באמצעות איזופלוריין 2.5-4.5% שיעור זרימת החמצן של המקום L לדקה 1 העכבר על משטח חום, לוותר על טיפה של שימון העין משחה על שתי העיניים כדי למנוע נזק הקרנית. לתקן את העכבר על משטח חום במצב פרקדן בעת שמירה על הרדמה על ידי הצבת את החוטם לתוך קונוס האף מחובר לאיזופלוריין.
  3. לאשר את ההצלחה של הרדמה על ידי חוסר התגובה שאורך קמצוץ. להפחית איזופלוריין ל מנה תחזוקה של 1.5-2.5% חמצן 1 ליטר/דקה על התזכורת של השרשה.
  4. לנקות את העור מהפטמה הרביעי משני הצדדים עד האמצע באמצעות את ניקוי אוזניים? הטבלתי 80% אתנול.
  5. למצוא 4th החלב השמן משטח באמצעות מישוש וסוחטים כרית השומן לחשוף עוד יותר את הרקמה.
  6. מערבבים התליה תא היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. בעדינות תשאף 50 µL תערובת תא לתוך מזרק אינסולין 27G, מזריקים לתוך משטח שומן החלב משני הצדדים של העכבר.
  7. לאשר זריקה מוצלחת על ידי תחושת נפיחות של כרית השומן. לשחרר את הפנקס השמן בעדינות ומניחים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב.
  8. השאר את הכלובים על משטח חום במשך לפחות 30 דקות לאפשר העכברים לקבל הכרה ולאחר מכן מקם את הכלובים בחזרה בחדר המעצר למשך 3 ימים.

8. IVIS הדמיה

  1. פתח את התוכנה תמונה חיה .
  2. לאתחל את המערכת IVIS באמצעות לחיצה על הלחצן לאתחל IVIS מערכת בלוח הבקרה. המתן עד השלט החום הופך לירוק.
  3. בחר מצב הדמיה Luminescent בלוח הבקרה.
  4. הפעל הרדמה איזופלוריין קאמרית ומערכת IVIS.
  5. להרדים את העכברים באמצעות איזופלוריין 2.5-4.5% חמצן 1 ליטר/דקה. ברגע מרדימים, לקבוע איזופלוריין 1.5-2.5% לצורך תחזוקה. להזריק 150 מ"ג/ק"ג משקל גוף של D-luciferin לתוך עכברים בזריקה בקרום הבטן (i.p.).
  6. מיד להעביר עכברים לתוך המערכת IVIS, למקם אותם על הפלטפורמה הדמיה מבוקרי טמפרטורה ולמקם את האף שלהם לתוך קונוס האף.
  7. לחץ על כפתור ההתקנה רצף בלוח הבקרה ובחר Binning בינונית.
  8. להגדיר את זמן החשיפה הדמיה כדלקמן: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, ו- 120 ס' התחלה הדמיה כ 3 דקות אחרי הזריקה luciferin והמשך אל התמונה עד האות מתחיל לרדת (בדרך כלל זה לוקח בערך 20 דקות).
  9. להסיר את העכברים IVIS תוך שמירה על איזופלוריין באלחוש דרך קונוס האף, להתייחס העכברים עם 50 µL PBS או 50 µL TGF-β איתות מעכב (50 μg/גידול) באמצעות הזרקת אינטרה-הגידול.
  10. לשים העכברים בכלוב ולהשאיר אותן על משטח חום במשך לפחות 30 דקות. ואז למקם את הכלוב חזרה לחדר המעצר.
  11. חזור על IVIS הדמיה ההליך כמתואר לעיל ביום שלאחר הטיפול.

9. ניתוח נתונים

  1. פתח לשמור קבצי תמונה חיה תוכנה.
  2. למצוא המידע על התמונה באמצעות תצוגה | נתוני תמונה.
  3. בחר תמונות שצולמו בנקודת זמן דומה עם חשיפה זמנית. לטעון תמונות כקבוצה.
  4. בטל את סימון התיבה בודדים בתוך התמונה להתאים לנרמל את העוצמה.
  5. בחרו מצב הפוטון לנתח את העוצמה. לכמת את עוצמת האות על-ידי בחירת לחצן אזור של הריבית (ROI) רועי כלים.
  6. גררו את העיגול רועי האזור המכיל את האות ביולומנאסן ולחץ על לחצן אמצעי כדי לרכוש את עוצמת האות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חיים תא בודד דימות in vitro

כדי להעריך באופן מדויק את ההפעלה של TGF-β/Smad איתות של תאים בודדים באמצעות אדנו מבוסס ריאגנטים, חשוב לברר קודם של האופטימלית הריבוי של זיהום (MOI) עבור כל קו תא. למשרד הפנים אופטימלית נקבע 100% של תאים הן חיוביות על זיהום adenoviral ללא תופעות cytopathic או ציטוטוקסיות הנוכחי. כדי לקבוע את זה, השתמשנו כתב Ad-CMV-Td-טום צורונים פעילים כי פעלו כסמן לזיהום חיובי. אחוז תאים אדנו נגוע היה ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פיתחנו שיטה כדי לאפשר הדמיה בזמן אמת של TGF-β/Smad3 איתות בתאים חיים יחיד. הרומן בשיטה זו בעבר זיהינו אוכלוסיה המשנה של תאים עם דינמי TGF-β/Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק שהיה משויך הפלישה משופר והעברה8. שיטה זו משפרת על מבחני המסורתי של TGF-β איתות, כגון שהכלים המערבי של זרחון Smad3 ו- TGF-β ממוקד ביטוי גנים, על-ידי לכידתו של הטרוגניות של TGF-β/Smad3 איתות בתוך האוכלוסייה הגידול וסימון החשיבות של ביולוגיה של התא יחיד. בנוסף, בשיטות חלופיות לתא בודד הדמיה כגון רוברטסונית גרעיני יכול להיות זמן רב וי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מדווחים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) H-JZ. TMBW הוא הנמען של פרס לתארים מתקדמים אוסטרליה מן הממשלה האוסטרלית ו אן הנדרסון הטען את המלגה הבריאות רוטרי אוסטרלי בשותף עם סיבובי של Templestowe, דיין לריפוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMThermoFisher1881024חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש
סרום בקר עובריScientifix LifeFBS500-Sמופעל בחום לפני השימוש
רקומביננטי אנושי TGF ובטא; 1PEPROTECH100-21Aliquot ב-DDW כדי ליצור ריכוז סופי ב-10 מ"ג/מ"ל
Hoechst-33258Tocris Bioscience5117לדלל ל-PBS כדי להגיע לריכוז סופי ב-1 μ L/mL
Luciferase Reporter Assay KitPromega197897לדלל 5x ב-PBS לפני השימוש
LuminometerPromega9100-002
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ניגודיות פאזהOLYMPUSIX50
צנטריפוגהeppendorf5810 R
VivoGl LuciferinPromegaP1041
IVIS Lumina III In Vivo מערכת הדמיהPerkinElmerCLS136334
0.5% טריפסין-EDTA (10x)ThermoFisher15400-054דילטו ל-0.05% (1x) ב-PBS
תרבית תאים ליזה 5x ריאגנטPromegaE153Aמדולל ל-1x ב-DDW
10% פורמליןסיגמא-אולדריץ'F5554-4L
HEK 293AThermoFisherR70507
MDA-MB-231ATCCCRM-HTB-26
PRKDC-SCIDמרכז משאבי בעלי חייםSCIDF6
מטריגלקורנינג354234
איזופלורןZoetis26675-46-7
אתנולChem-supplyEA043-10L-P
רענון לילהאלרגן1750Dמשחת עיניים סיכה
<חזק>תמיסה<חזק>הרכב
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)NaH<תת>2PO<תת>4.2H<תת>2O (4 מ"מ); NaHPO<תת>4 (16 מ"מ); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM 5% FBS מומת בחום; 10 μ גרם/מ"ל פניצילין; 100 μ גרם/מ"ל סטרפטומיצין

מקורות

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50(2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שסוואיג' של TGF-beta Smad3דימות במערכת In Vitroדימות במערכת In Vivoתאי MDA-MB-231רפורטר CAGA12-Td-Tomatoרפורטר CAGA12-Luciferaseמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתדימות IVIS
חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.