הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

סיכום

Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

תקציר

ניסויים באמצעות איים מבודדים הלבלב חשובים למחקר בסוכרת, אך איונים הם יקרים השפע מוגבל. איונים מכילים אוכלוסיה לתא מעורב באדריכלות מובנית אשר משפיעה על תפקוד, איונים אנושי נרחב משתנה בקומפוזיציה סוג התא. שיטות נפוצות ללמוד איונים בתרבית כוללים מולקולרית מחקרים שבוצעו על כל איונים, מכלילה איון ובתחזוקה סוגי תאים ביחד, או מיקרוסקופ או במחקרים מולקולריים בתאי איון התפזרו, שיבוש איון אדריכלות. ללימודים ויוו איון, הלבלב פרפין-מוטבע חלוקתה היא טכניקה חזקה כדי להעריך את תוצאות ספציפיות תא בסביבת הלבלב מקורית. לימוד פוסט-תרבות איים על ידי חלוקתה פרפין, הייתי מציע מספר יתרונות: זיהוי של תוצאות מרובים על אותו איים קטנים (שעשויות להיות אפילו אותו ליתר דיוק איונים, באמצעות סעיפים טורי), מדידות ייחודיים לסוג התא, יליד לשמירה על איון תא התא, התא-תשתית אינטראקציות במהלך החשיפה ניסיוני והן לצורך ניתוח. עם זאת, קיימות טכניקות הטבעה מבודדים איונים פוסט-תרבות הן לא יעיל, זמן רב, נוטה אובדן של חומר, בדרך כלל לייצר סעיפים במספרים איון לא מספיק כדי להיות שימושי עבור לכימות תוצאות. הפתולוגיה הקלינית מעבדה התא בלוק הכנה מתקני הינם נגישים ולא מעשי עבור מעבדות מחקר בסיסי. פיתחנו שיטת ספסל-העליון משופרת, ההופך את יוצרת מקטעים עם תשואה חזקים והפצה של איים קטנים. איונים קבוע resuspended ב agarose היסטולוגית חמים ג'ל, pipetted לתוך דיסק שטוח על משטח זכוכית רגילה, כך איים מפוזרים במטוס. לאחר התייבשות רגילה, הטבעה, ניתן לחתוך (10 +) 4-5 מיקרומטר מקטעים מרובים מהגוש איון אותו. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניתוחים היסטולוגית ו immunofluorescent על עכבר, חולדה, איונים אנושי. זו גישה אפקטיבית, זולה, לחיסכון בזמן כדי להעריך מן איונים בתרבית תאים ייחודיים לסוג, שלם-אדריכלות התוצאות.

מבוא

הלבלב לנגרהנס, המקור הבלעדי של מחזורי אינסולין, הם רקמה קריטי לחוקרים הלומדים סוכרת. מכל יצור נתונה, איים קטנים יש גודל המשתנה תדירות סוג התא, אדריכלות^1,2,3. האסטרטגיה קונבנציונאלי ללמוד ויוו מבנה והרכב האנדוקרינית תא לנגרהנס הוא על ידי חלוקתה^4,של רקמת הלבלב⁵. מאז איונים מהווים רק חלק קטן הכולל תכנים סלולריים הלבלב, במחקרים מולקולריים מבוצעות על איים מבודדים. Ex-vivo איון תרבות ניסויים בדיקות בתגובה חומרים מזינים, ג'ין אפנון (תרביות תאים, התמרה חושית), או טיפולים ניסיוניים לספק חשוב תובנות מנגנוני הכוח ויסות הישרדות cell האנדוקרינית, התפשטות, ופועלים ^{5 , 6}.

Ex-vivo איון ניסויים לעיתים קרובות הם ניתחו שימוש במחקרים מולקולריים של איים שלם או מחקרים היסטולוגית או מולקולרית של תאי איון התפזרו גדלו ב חד שכבתי^5,6. אנליזה מולקולרית של איים קטנים כל מציג אזהרה חמורה של סוגי תאים intermixing, אשר עשויה לייצר תוצאות שווא-שלילי או חיובי-false כאשר אומדן לכל סוג של תא בודד. תא פיזור על coverslips עבור פוסט-תרבות מיקרוסקופיה מאפשר מדידה תוצאה ייחודיים לסוג התא, אך משבש איון אדריכלות, אשר עשוי לשנות את התגובה להתערבות, מונע זיהוי של תוצאות הקשורות אדריכלות. בנוסף, בדרך כלל רק תוצאה אחת ניתן למדוד; לדוגמה, כדי למדוד את התפשטות תאי בטא ומוות תאי בטא תחת באותם התנאים, שני ניסויים נפרדים צריך להתבצע. גישות אלה הם גם עיוור הבין-איון השתנות, שטח של עניין גובר בתחום. מיון תאי איון מאת cytometry זרימה במחקרים מולקולריים ייחודיים לסוג התא, או מחקרים RNA בתא יחיד הינם אלגנטיים אך יקר, זמן רב, מוגבלת על ידי רקמת שפע, ולחסל-אדריכלות, לא מתאימה כדי תא שגרתית תרבות ניתוחים ^{5 , 7}. הדמיה קונאפוקלית של איים immunostained כולה-הר מספק נתונים שלם-אדריכלות באיכות גבוהה, אבל עמל רב, והנתונים שהתקבלו כל מדגם מוגבל לתוצאות לזיהוי יחיד immunostaining⁸.

היכולת לייצר באיכות גבוהה פרפין מקטעים של פוסט-תרבות איונים כל כתובת זו הרבה חששות אלה. עלות גבוהה, נמוך-שפע איון רקמות דגמים גנטיים ייחודיים או תורמי איברים אנושיים, או איים מצב פוסט vivo בתוך או במבחנה ניסיוני מניפולציה, יקרות. קבלת מספר מקטעים פרפין מ איונים באותו תאפשר ניתוחים ייחודיים לסוג התא, שלם-ארכיטקטורה מרובים מאותו הניסוי.

קיימות טכניקות ליצירת כדורי איון על חלוקתה מושלמים. Agarose הממוטבים היסטולוגיה היא ג'ל מימית נקודת התכה נמוכה נרחב המשמש לעיבוד היסטולוגית ו cytological דגימות כולל דגימות רקמה קטן או מפוצלים שקשה תהליך⁹. אחד איון הטמעת הגישה היא להשעות את איים קטנים ב- agarose בשפופרת microcentrifuge, צנטריפוגה הצניפה החומר, לאחזר את התקע אגר, ולאחר מכן לעבד, להטביע על חלוקתה^10,11. חילוץ המדגם הקרושה מהחלק התחתון של הצינור הוא זמן רב וקשה, שמוביל מפעם לפעם פיצול של המדגם, הסיכון לפציעה. איים מרוכזים בקצה של התקע, שמוביל איון לקוי הפצה בסעיפים המתקבל בשיטה זו. בתחתית התקע עגול מסבך הטבעה כזאת אזור איון-עניים שיוצבו על חלוקתה. בסך הכל, שיטה זו מובילה תשואה נמוכה והפצה איון גושית בסעיפים וכתוצאה מכך.

שיטה חדשה זו היא גישה מפושטת ומשופרות עבור הכנת איון מקטעים. איים מרוכזים אמצעי אחסון קטן, ואז להניח אותה על פני חלקה של שקופית מיקרוסקופ כדי ליצור דיסק קטן, עם איים מטוס יחיד. הדיסק Histogel-איון לאחר מכן מעובד עבור פרפין הטבעה התייבשות מקוצר, קסילן הסתננות פרוטוקול. הגישה הקודמת, אשר מרכזת את איונים בחלק התחתון של צינור microfuge, מבוצעת גם לשם השוואה. טכניקה חדשה זו משפרת את התשואה של איים קטנים לכל סעיף, ההתפלגות של איים קטנים בכל מקטע, ולוקח פחות זמן כדי להעביר בלוקים איון קלטות. טכניקה זו שימושית לביולוגים איון או מדענים אחרים הלומדים חתיכות קטנות של רקמות המעוניינים למקסם פורה לשימוש טישו נמוך-שפע על ידי מדידת תוצאות מרובות על דוגמה אחת בארכיטקטורה רקמה מקורי שלו.

פרוטוקול

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי במסצ'וסטס הספר מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה. איון האנושי מחקרים נקבעו על ידי מועצת המנהלים לסקור מוסדיים במסצ'וסטס אינן מצריכות סקירה IRB או פטור משום שהם אינם כרוכים השימוש של בני אדם.

1. איון בידוד ותרבות

1. לבודד איונים, נפרדות ובלחות אקסוקרינית ו ductal רקמות בשיטת הבחירה שלך.
   הערה: שיטה זו היה ממוטב באמצעות איים מבודדים collagenase ductal insufflation ו Ficoll ההפרדה¹² (מכרסם) או משלוח שלאחר איונים מתוכנית משולב איון הפצה (IIDP¹³; האדם). איים מוגנים עם micropipette P200.
2. כדי למטב את איון מורפולוגיה, לאפשר איונים להתאושש בין לילה ב 10 מ"ל איון מוחלט בינוני (RPMI עם 10% FBS פניצילין/סטרפטומיצין, גלוקוז 5.5 mmol/L) בתוך תא humidified המכילה 5% CO₂ ב 37 º C. למרות שלב זה לא נדרש להשיג חלקים, איים שלמים יותר לאחר תקופת התאוששות (ראה איור 2).

2. איון קיבוע

1. באמצעות טיפ P200 נמוך מחייב, לבחור. לאישתך כ 250 איון מקבילות (IEQ)¹³ באמצעות רשת מכוילת תחת stereomicroscope לתוך צינור microfuge 1.5 mL מחייב נמוכה. טיפים וצינורות נמוך מחייב להפחית את אובדן איון.
2. לאפשר איונים להתיישב לתחתית הצינור microfuge. הסר את תגובת שיקוע ברוב עם טיפ pipet P200, מטפל יש להסיר כל איונים.
3. להוסיף 1 מ"ל ל- PBS. צנטריפוגה צינור ומפרידה דלי מתנדנדים עד המהירות מגיע 200 גרם x, אז לעצור את העובדות. הסר את תגובת שיקוע. חזור על שטיפת PBS, עבור סכום כולל של שני שוטף.
4. להוסיף 500 µL של פתרון פורמלין 10% או 4% טריות paraformaldehyde. לתקן בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. התוצאות נבדק בשיטה זו, שיטות קיבוע אלה היו להבחין מגניחותיה. קיבוע קצר יותר ייתכן גם שתהיה אפשרות; מומלץ למטב את הקיבעון משך התוצאה הרצויה.
5. הסר את לשבועיים עם טיפ P200.
6. להוסיף 1 מ"ל ל- PBS. צנטריפוגה צינור עד המהירות מגיע 200 גרם x, אז לעצור את העובדות. הסר את תגובת שיקוע. חזור על שטיפת PBS, עבור סכום כולל של שני שוטף.
7. המשך מיד לשלב הבא.

3. הכנת דיסק איון (איור 1)

1. השימוש הראשון, להמיס את הג'ל (למשל, Histogel) ב 70 ° C ולעשות aliquots ב 1.5 mL microfuge צינורות לאחסון לטווח ארוך. נפח aliquot אינה קריטית, שכן aliquots יכול להיות שימוש חוזר.
2. לחמם את הג'ל (כ-100 µL עבור דגימה) ב 70 מעלות צלזיוס על ידי הצבת microfuge שפופרת המכילה את aliquot ג'ל בתוך גוש חום מוגדר כ- 70 מעלות צלזיוס.
3. העברת agarose כחול חרוזים (10 µL עבור כל דגימה) לתוך צינור נקי microfuge 1.5 mL. Resuspend ביסודיות את החרוזים לפני pipetting.
   הערה: חרוזים כחול מעורבבים עם איונים כדי לסייע בזיהוי חזותי של החומר מוטמע לחצן agarose ואת הרחוב פרפין. מספר חרוזים כחול המשמש אינה קריטית לתוצאות, אך להימנע חרוזים מוגזמת (> 5 x מספר איים קטנים) כדי לאפשר הפצה אופטימלית של איים קטנים בסעיפים.
4. לשטוף את החרוזים הכחולים עם 1 מ"ל PBS, פעמיים. עבור כל כביסה, לסובב את החרוזים 1 דקות ב- g 800 x. לאחר לשטוף את השני, resuspend את החרוזים ב (n+2) x 10 הציבורית µL, כאשר n הוא המספר של צינורות מדגם; לדוגמה, עבור 2 צינורות מדגם, האחסון PBS כדי להוסיף החרוזים יהיה 40 µL.
5. Centrifuge את הצינור microfuge המכיל איים קטנים (קצר spin כדי 200 גרם x) ולהסיר את רוב תגובת שיקוע. לחתוך את הקצה של טיפ micropipette 10 µL בעזרת מספריים או סכין ולהוסיף 10 µL של חרוזים כל שפופרת איון, באמצעות טיפ נקי עבור כל דגימה. לא מערבבים (כדי להימנע מאובדן איים קטנים).
6. צנטריפוגה איים קטנים, חרוזים (קצר spin כדי 200 גרם x). להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר עם טיפ micropipette נימולים 10 µL.
7. תווית של שקופיות מיקרוסקופ לזיהוי הדגימה. 2-3 דוגמאות ניתן להכין בכל שקופית. מקם את השקופית על הספסל ליד הרחוב חום עם ג'ל ומחוממת. חותכים הטיפים של שלוש עד חמש 20 טיפים micropipette µL קשירה נמוכה עבור דגימה עם גילוח או מספריים. לטעון micropipettes P20 שני עם טיפים לחתוך כדי לאפשר מהירה מתמיכת אחד לשני.
8. באמצעות את micropipette הראשונה, להוסיף µL 15-20 של ג'ל חם הצינור microfuge איים קטנים/חרוזים; מיד לערבב, הימנעות בועות; חלות נוזל התערובת אגר/איים קטנים/חרוזים השקופית לטופס < דיסק בקוטר 1 ס מ. מקם את הדיסק סמוך לקצה השקופית, משאיר מקום הטבעת החיצונית ג'ל (השלב הבא). הקש על השקופית בעדינות מספר פעמים כדי ליישב את איים קטנים, חרוזים.
9. באמצעות micropipette של השני, להוסיף 20 µL של ג'ל חם הצינור הדגימה. באמצעות את micropipette הראשונה, לערבב ג'ל חדש עם כל שאר איונים/חרוזים, מחדש ההתחממות בבלוק חום אם הוא מתחיל לגבש, לאחר מכן להחיל תערובת זו אל השקופית, המקיפים את הדיסק המקורי. חזור על הצורך, באמצעות טיפים נוספים חתוכות מראש, עד הדיסק הוא הגודל הרצוי ואת עובי.
   הערה: טיפול הדיסק וג'ל קל אם הטבעת מבחוץ היא מעט עבה יותר. בדרך כלל, 3 x 20 µL של ג'ל מספיקה. שלב זה ממזער אובדן איים על ידי צינור שוטף ומוסיפה מסכן איון agarose החיצוני של הדיסק כדי להקל על הטיפול דיסק.
10. להכין כל דיסק בנפרד ולשמור בזהירות אחר סדר דגימה אם הצבת מרובות דיסקים בכל שקופית.
11. במקום השקופיות על משטח שטוח של קרח רטוב, עם כיסוי, במשך 10 דקות או עד עפור הג'ל. . זה קשה יותר להחליק את הדיסק את הזכוכית אם זה מתייבש.
12. תווית ביופסיה עיבוד/הטבעה רקמות קלטות עם עיפרון, אחד לכל דגימה. יבש האחורי של השקופית כדי להימנע להרטיב את נייר כחול.
13. משתמש הקצה הקהה של סכין גילוח, דחף בעדינות את הדיסק לכל כיוון כדי לשחרר אותו מהזכוכית. כאשר הוא מחליק בקלות, לאט לדחוף את הדיסק מתוך השקופית מיקרוסקופ על הנייר טישו כחול. הנח את התקליטור, צידה השטוח, ישירות על הנייר.
14. שמירה על הדיסק שטוח, מקפלים את הנייר סביב התקליטור כדי למנוע תנועה, הכנס את הדיסק נייר מקופל בקלטת, ולסגור את הקלטת. אם הדיסק לא לגלוש נקיה הזכוכית, להוסיף ג'ל נוסף ו/או להחזיר את השקופית לקרח במשך עוד כמה דקות.
15. להטביע את הקלטת ב- PBS ב גביע. תהליך פרפין הטבעה באותו היום על מורפולוגיה של האופטימלית.

4. פרפין הטבעה

הערה: תהליך הג'ל איון דיסקים פרפין בלוקים באמצעות סדרות התייבשות מקוצרת כפי שמתואר להלן. טכניקה זו אופטימלי באמצעות מעבד אוטומטית, אך עיבוד ידני צריך לייצר תוצאות דומות.

1. לטבול קלטות 85% אתנול במשך 15 דקות.
2. לטבול קלטות אתנול 95% במשך 15 דקות.
3. לטבול קלטות 100% אתנול במשך 15 דקות. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
4. לטבול קלטות של קסילן במשך 15 דקות. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
5. לטבול קלטות של פרפין מותכת במשך 10 דקות.
6. העברת קלטות פרפין מותכת טריים למשך 10-30 דקות.
7. בזהירות פתח את הקלטת, עטיפה בעיתון כחול. הסר את התקליטור ג'ל, שמירה על מסלול של משטח שטוח שהופעל על הנייר. להטביע את הדיסק בתבנית קטנה, עם משטח שטוח (המכילות איון) למטה, במקביל למשטח חיתוך. עבור התקע, בזהירות להסיר אותו בקלטת, להטביע אותו תבנית קטנה עם קצה והצביע לעבר משטח חיתוך.

5. פרפין חלוקתה ולא מכתים

1. תווית שקופיות ברצף אם מקטעים טורי נדרשות.
2. יש 5 מיקרומטר פרפין מקטעים קיצוץ של histotechnologist מנוסה. כדי למקסם את התשואה, שמור כל המקטעים המכילים חומר. באופן כללי, איסוף מקטעים 20 מאפשר לכידה של רוב החומר.
3. חנות מקטעים בטמפרטורת החדר. סעיפים נתונות שגרתית היסטולוגית כתמים (למשל, H & E) ו immunofluorescence (למשל, אינסולין, גלוקגון, דאפי). למטב את הקיבעון של אנטיגנים אחרים, אם יש צורך בכך.

תוצאות

מפרטים טכניים מאויר של צעדים כדי להכין את הדיסק ג'ל מוצג באיור1. זה ג'ל דיסק בשיטה התוצאות בסעיפים פרפין המכילים מספר מספיק של איים מופץ במטוס בודד כדי לאפשר כימות משמעות של תוצאות. איור 2 מציג תמונות נמוך-הגדלה של הסעיפים שנוצר כדי להמחיש את מספר איונים שנתפסו לפי סעיף. באופן כללי, > איונים 35 היו גלויים בכל מקטע 250 IEQ שימשו את ההליך, ו > סעיפים 10 (4-5 מיקרומטר) המכיל איונים, התקבלו כל דגימה. הגדלת מספר איים קטנים המשמש...

דיון

ששונה ג'ל-דיסק מבוסס ההטבעה שיטה זו מספקת פשוטה, זולה, דרך יעילה ליצירת תשואה גבוהה של איים קטנים לכל סעיף. בניית הדיסק ג'ל על משטח זכוכית שטוחה מקלה על איונים מתפשטת בריפודי כתופיים מעל אזור מוגדר היטב. להפיץ את איים בדיסק שטוח מציעה את היתרון של הצבת איים רבים במישור של מקטע, אופטימיזציה של התשואה ומאפשר איונים פחות לשמש. ניתן להתאים את עובי דיסק כדי לענות על הצרכים של החוקרים. מאז ניתן להשיג מספר מקטעים, טורי חלקים איים באותו יכול להיות מנותח, הגדלת מספר תוצאות נפרדות שניתן למדידה על הדגימה ניסיוני באותו. למרות המותאם...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור אפנדורף 1.5 מ"ל	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic	Starter Kit ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
קצה כריכה נמוך (1000 μ L)	Genesee Scientific	24-430
קצה קשירה נמוך (200 μ L)	Genesee Scientific	24-412
קצה קשירה נמוך (20 μ L)	Genesee Scientific	24-404
קצה כריכה נמוך (10 μ L)	Genesee Scientific	24-401
10% תמיסת פורמלין	סיגמא	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
חרוזים כחולים אגרוז- אפי-ג'ל	ביו-ראד	153-7301
Life טכנולוגיות	14190-144		של Dulbecco
קלטת עיבוד רקמות	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 מעבד רקמות	Thermo-Shandon LLC
אתנול 200 הוכחה	Decon Laboratories, INC	2701
קסילן	Fisher Chemical	X5SK-4
פרפין	מקורמיק Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
נוגדן אינסולין	DAKO	A0564
נוגדן גלוקגון	Sigma	G2654
Fluoroshield עם DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 נוגדנים משניים	טכנולוגיות חיים	A11076
אלכס פלואור 488 נוגדנים משניים	טכנולוגיות חיים	A11001