מאמר שיטה

האף הפרש הפוטנציאלים לכמת תחבורה טרנס-אפיתל יון בעכברים

DOI:

10.3791/57934

⸱

4 ביולי 2018

 , 
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Université Catholique de Louvain

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את הפרש הפוטנציאלים האף בעכברים. הבדיקה מכמת את הפונקציה של יון transmembrane מובילים כגון המתקן מוליכות transmembrane סיסטיק פיברוזיס, תעלת נתרן אפיתל. זה חשוב כדי להעריך את היעילות של טיפולים חדשניים סיסטיק פיברוזיס.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבדיקה הפרש פוטנציאל האף שימש כמעט שלושה עשורים כדי לסייע באבחון של סיסטיק פיברוזיס (CF). זה הוכיח להיות מועיל במקרים של הקלוש, oligo - או מונו-צורות סימפטומטי של CF מאובחן בדרך כלל בשלב מאוחר בחיים ועל הפרעות הקשורות CF כגון היעדרות הדו-צדדיים מולדות של צינור הזרע, אידיופטית דלקת לבלב כרונית, אלרגיות bronchopulmonary aspergillosis, ברונכיאקטזיס. הגדרות קלינית והן פרה, המבחן שימש סמן כדי לכמת את התגובות יישוב אסטרטגיות טיפוליות עבור עדכון טווח CF. הבדיקה כדי עכבר הוא מאתגר, יכולה להצריך של התמותה המשויך. מאמר זה מתאר את העומק נאותה של הרדמה נדרש לשמור עם קטטר האף בחיי עיר עבור זלוף רציפה. זה פירוט צעדים כדי למנוע broncho-השאיפה של פתרונות perfused באף. הוא גם מתאר את הטיפול בבעלי חיים בסוף הבדיקה, כולל ניהול של שילוב של נוגדנים תרופות הרדמה, מובילים במהירות להחזרתם ההרדמה עם שחזור מלא של בעלי החיים. נציג נתונים שהושגו CF, עכבר פראי-סוג מראים כי המבחן מפלה בין CF ו- CF. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר מדידות אמין למעמד הפונקציונאלי של מובילי הנתרן הכלוריד הטרנס-אפיתל בעכברים נושם באופן ספונטני, כמו גם בדיקות מרובות של אותה חיה תוך צמצום הקשורות מבחן התמותה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמעט שלושה עשורים, מדידות הפרש (PD) פוטנציאל חשמלי שימשו כדי להעריך את המצב פונקציונלי של מובילי יון transmembrane באים לביטוי עם רירית האף, כנציג של דרכי הנשימה דיסטלי1. מאחר דינמי רב-שלבי בוחן2,3, אפי PD מאפשר ניתוח תפקודי של סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR) ופעילות ערוץ (ENaC) נתרן אפיתל, שניהם מקומי על הממברנות הפסגה של תאים אפיתל, מתאמצת לקבל תפקידים חיוניים בהידרציה פני דרכי הנשימה. היישום הקליני העיקריים של הבדיקה PD האף היא לסייע באבחון של CF, הפרעה גנטית קטלנית הנפוץ ביותר באוכלוסיות לבנה עם שכיחות ממוצע של 1 מתוך 2500 לידות חי בארצות אירופה. המבחן הוכיח זמן לעזור באבחון של הקלוש, oligo - או מונו-צורות סימפטומטי של CF מאובחן בדרך כלל בשלב מאוחר בחיים ועל הפרעות הקשורות CF כגון היעדרות הדו-צדדיים מולדות של צינור הזרע, אידיופטית דלקת לבלב כרונית, אלרגיות bronchopulmonary aspergillosis, ברונכיאקטזיס4. לאחרונה, הערכת clinometric אפנון טיפולית של CFTR בסיסי פגם5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 עשה שימוש המשטרה באף בניסויים קליניים של טיפולים חדשים CF. בהגדרה פרה, הותאם במבחן העכבר17 כדי לאפשר חקירה של bioactivity של חדש CF היעד טיפולים18,19,20,21. בעכברים, הטכניקה היא עדינה, בהתבסס על הבדלים אנטומיים הקשורות מינים בגודל של אזור האף, בין מכרסמים ובני אדם, בעיקר את התפקיד החיוני של תשומות חושים אזור nasofacial מכרסמים. זה דורש מפעילי מאומנים ומיומנים, אספקה וציוד ייעודי.

CF היא הפרעה רב מערכתי של בלוטות אקסוקרינית, במחלת נשימה כרונית אשר חולש על תמונה קלינית. המחלה נגרמת על ידי מוטציות בגן קידוד מחזורית של אדנוזין monophosphate (מחנה)-מוסדר CFTR כלוריד ערוץ22. עד כה, כבר יותר מ-2,000 CFTR מוטציות מזוהה23. הנפוץ ביותר מוטציה24,25, שנמצאו כמעט 90% של אללים CF, מקביל מחיקה של פנילאלנין מיקום 508 של פוליפפטיד של החלבון (F508del-CFTR). החלבון CFTR הוא ערוץ כלוריד מוליכות קטן ohmic גרידא. יש גם ראיות רבות CFTR מווסת את התחבורה מנגנונים אחרים, בפרט, ENaC26,27. התחבורה פגומה אלקטרוליט, כולל מופחתת תלויי-CFTR כלוריד מוליכות ומוליכות מוגברת של נתרן תלויי-ENaC, מהווה סימן היכר של CF epithelia. הפגם לשעבר בא לידי ביטוי על ידי רה-מופחתת או ביטל פולריזציה בתגובה אלקטרוכימי בזרימת כלוריד הדרגתיות העדפה וגם תוספת של isoprenaline (אגוניסט β adrenergic המגבירה מחנה תאיים) או forskolin (אדנילאט cyclase אגוניסט, לא אושרה לשימוש קליני). הפגם השני משתקפת של hyperpolarization הבסיס של רירית האף (PD שליליים יותר) והתגובה מוגברת של amiloride, תרופה משתן חוסם ENaC28.

CF העכבר שימשו לעיתים קרובות במחקר CF ומודלים לא תסולא בפז בניתוח CF פתולוגיה. כיום, לפחות 15 דגמים כבר מתואר29, שלושה מהם נמצאים homozygous עבור הרלוונטיות ביותר קלינית F508del מוטציה30,31,32. אחד אלה זנים שלוש30, שפותחה ב אוניברסיטת ארסמוס ברוטרדם, שימש במשך כמעט 20 שנה במעבדות אוניברסיטת catholique דה בלוביין (UCL). Cftrtm1Eur דגם30 הוכיחה להיות שימושי מאוד ללמוד פתופיזיולוגיה multiorgan של מחלות CF, כדי לבדוק את היעילות של אסטרטגיות טיפוליות18,19,החדש20, 21. עלולות להתרחש בעיות רבות במהלך או מוקדם לאחר (< 24 שעות ביממה) הבדיקה PD האף בעכברים. בנייר זה, מתוארים העומק נאותה של הרדמה הדרושה של קטטר האף בחיי עיר זלוף רציפה, אמצעים כדי להימנע broncho-השאיפה של פתרונות perfused באף. הטיפול בבעלי חיים בסוף המבחן הוא גם כמתואר לעיל, כולל ניהול של שילוב של נוגדנים של הרדמה, מובילים במהירות להחזרתם ההרדמה עם התאוששות מלאה של בעלי החיים. בסך הכל, הליכים אלה מאפשרים מדידות אמין באופן ספונטני נשימה עכברים, התמותה הקשורות מבחן מופחתת, חוזרים לבדוק את אותה חיה. נציג נתונים המתקבלים במבחן PD האף ב- CF וב -עכבר פראי-סוג שמוצג ודן.

פרוטוקול מאתר משטרת באף מבחן הוא דיווח בהפעלות 3: הערכת וניהול לפני, במהלך, ואחרי הבדיקה. Pre-test הערכה וניהול, הפרוטוקול של הכנה של הקטטר האף לומן כפול ושל פתרונות לשימוש רציף זלוף האף מתואר בפירוט. במהלך ההערכה ואת ניהול חלקים של הבדיקה, את הגדרת הניסוי והטיפול של העכבר הוא מסוגל גזור. לבסוף, ניהול של בעל, בסוף הבדיקה מתואר לשיפור התאוששות מלאה בבעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לימודיו ואת הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים של הכיול (2017/UCL MD 015), מסכים עם תקנות הקהילה האירופית לשימוש בבעלי חיים במחקר (CEE n ° 86/609). החוקרים כשירים אליה בבע ח בעקבות הוראה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי ושל המועצה של 22 ספטמבר 2010 בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות.

1. מראש מבחן הערכת וניהול

  1. הכינו את הצנתר האף לומן כפול.
    הערה: קטטר האף עשוי כמו צינור קפילרי לומן כפול, לומן אחד שמשמש את זלוף רציפה של פתרונות, והשני אחד כמו המדידה ערוץ.
    1. מחממים את החלק המרכזי של חתיכה, בערך 20 ס מ באורך, צינור פוליאתילן (2.0 מ מ קוטר פנימי; הקוטר החיצוני 3.0 מ מ; איור 1 ) בלהבת מבער גז עד שהכל רך מספיק כדי למשוך (s 10-15).
    2. להפריד את שני הקצוות כדי לקבל צינור קפילרי דק מאוד של אורך המתאים (~ 15 ס מ), הקוטר החיצוני (~0.1 מ מ) עבור המכשיר האף (איור 1b).
    3. נקי degrease שני הנימים כזה עם אתנול טהור, להצטרף אליהם עם קלטת (איור 1c) והדבק אותם יחד באמצעות דבק דבק מגע.
    4. חתך אורך עודף הגששים עם סכין גילוח או איזמל להשיג של אורך אופטימלי של הקטטר לומן כפול של כ- 8 ס מ (איור 1d).
    5. להזריק מים דרך שני לומן. לאמת כי הם חדיר.
    6. להחיל סימן במרחק 5 מ מ מהקצה.
      הערה: החללית מוכנס עד כדי לסמן לתוך הנחיר, כך כל המדידות נעשים באותו אתר בתוך חלל האף.
    7. לאחסן את הצנתר לומן זוגי בתוך קופסה יבש.
      הערה: זה יכול להיות בשימוש 6 - 10 פעמים אם ניקו כראוי מיד לאחר הבדיקה.
  2. מכינים את תערובת קרם.
    1. מערבבים בעדינות אלקטרוליט קרם והפתרון רווי 3 מ' אשלגן כלורי ביחס 1:1 (עוצמה/נפח), הימנעות היווצרות בועות אוויר זעירים.
      הערה: לערבב קרם משמש לבניית גשרים אלקטרודה עבור מדידת ואת ההפניה Ag/AgCl אלקטרודות, כמופיע באיור1.

figure-protocol-1
איור 1 : רגשים עם אלקטרודות וגשרים. האיור מדגים את צינור פוליאתילן לפני (א) ואחרי חימום ומושך (b), הקלטת מצטרפים שני נימי חלקי (ג) את לומן זוגי קטטר (d), המחברים צינור סיליקון (ה) ושל אלקטרודות (f). לקבלת תמונה ברורה, המחברים לא היו מלאים עם תערובת קרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פתרון תוויתתיאור פתרון
Aהתאים הבזליים buffered תמיסת מלח
Bללא כלוריד buffered תמיסת מלח
C10-2 מ' amiloride פתרון מניות
D10-3 מ' forskolin פתרון מניות

טבלה 1: מניות פתרון המבחן PD האף בעכברים.

מלחמ ממשקל מולקולריg/L
נתרן כלורי (NaCl)13558.447,889
סידן כלורי וגופרית והרכבו (CaCl2.2H2O)2.251470.331
מגנזיום כלוריד hexahydrate (MgCl2.6H2O)1.2203.30.244
Dipotassium פוספט (K2HPO4)2.4174.20.418
Monopotassium פוספט (2פו ח'4)0.4136.10.054

טבלה 2: הרכב של הבסיס buffered תמיסת מלח (מניות פתרון A).

  1. הכינו את הפתרונות.
    1. להכין ארבעה מניות הפתרונות הנדרשים עבור פרוטוקול נסיוני (טבלה 1).
      1. להכין את הפתרון במאגר הבסיס (פתרון מניות A; בטבלה 2) והפתרון ללא כלוריד במאגר (פתרון מניות ב'; טבלה 3) על ידי ערבוב המלחים במים טהורים בטמפרטורת החדר. התאם pH ל 7.4 (טווח 7.0-7.6) באמצעות 1 N NaOH להעלות את ה-pH, 1 N ב- HCl pH נמוך יותר. בדוק osmolarity של הפתרון (275 mOsm/L).
      2. לאחסן בקבוקי זכוכית שכותרתו ב 4 ° C עד 3 חודשים או בקבוקי פלסטיק קפואים עד 6 חודשים.
      3. להכין את הפתרון amiloride 10-2 מ' (מניות פתרון C) על-ידי הוספת 26.6 מ ג של amiloride הידרוכלוריד 10 מ"ל של מים טהורים. מחממים את התערובת למשך 5-10 דקות ב- 70 מעלות צלזיוס. כמו amiloride הוא רגיש לאור, לשמור על פתרון C במיכל חשוך. תווית המיכל ולאחסן ב 4 ° C עד 3 חודשים.
      4. להכין את הפתרון forskolin M 10-3 (מניות פתרון D) על-ידי הוספת 10 מ ג של forskolin 24.36 מיליליטר מים טהורים. תווית aliquots 0.1 מ"ל של הפתרון מניות forskolin ולאחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים.
  2. להכין טרי פתרונות A1, B1 ו- B2 (טבלה 4).
    1. להכין טרי פתרון A1 (תמיסת מלח במאגר הבסיס בתוספת 10-4 מ' amiloride) על-ידי קבלת 10 מ"ל של תמיסת מלח הבזליים (מניות פתרון A) והוספת מ 0.1 ל-2 מ' 10 amiloride פתרון (מניות פתרון C). תווית המיכל ולהשתמש בתוך 24 שעות של הכנה.
    2. להכין טרי פתרון B1 (כלוריד נאגר פתרון פלוס 10-4 מ' amiloride) על-ידי קבלת 10 מ"ל של ללא כלוריד במאגר תמיסת מלח (פתרון מניות B) והוספת מ 0.1 ל-2 מ' 10 amiloride פתרון (מניות פתרון C). תווית המיכל ולהשתמש תוך 24 שעות מרגע ההכנה.
    3. להכין טרי פתרון B2 (ללא כלוריד תמיסת מלח במאגר פלוס 10 amiloride-4 מ' ו- 10-5 מ' forskolin) על-ידי קבלת 10 מ"ל של ללא כלוריד במאגר תמיסת מלח (פתרון מניות B) והוספת 0.1 מ"ל של 10-2 מ' amiloride פתרון (מניות פתרון C) ו- 0.1 מ ל-3 מ' 10 forskolin פתרון (מניות פתרון D). תווית המיכל ולהשתמש תוך שעתיים של הכנה.
מלחמ ממשקל מולקולריg/L
Gluconate נתרן (מלח מונוסודיום)135218.129,444
אדל (אבקת נטול מים)2.2430.40.947
Heptahydrate מגנזיום גופרתי (MgCl2.6H2O)1.2246.50.296
Dipotassium פוספט (K2HPO4)2.4174.20.418
Monopotassium פוספט (2פו ח'4)0.4136.10.054

טבלה 3: הרכב ללא כלוריד buffered פתרון (פתרון מניות B).

figure-protocol-2
איור 2 : המיקום של העכבר במהלך זלוף של רירית האף. האיור מדגים את כרית החימום (א), את מד מתח (b), האלקטרודה הפניה מוכנס בחלל תת עורית של הגפיים האחוריות (ג), על צינתור (ד) ו דיסטלי (e) השקעים של משאבת סחרור, הכרית (f), ואת המיטה גיליון (ז). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. הערכת וניהול במהלך הבדיקה

  1. הכינו את הגדרת הניסוי.
    1. כדי למנוע היפותרמיה במהלך ואחרי הבדיקה, השתמש בשתי כריות חימום ומתוחזק על טמפרטורות פיזיולוגית, אחד עבור ההתקנה מדידה (18.8 x 37.5 ס מ; איור 2 ), והשני (15.5 x 15.5 ס מ) עבור התיבה שבה ימוקמו החיה להתאוששות בסוף המבחן.
    2. להדליק את המחשב נטען עם התוכנה עבור לכידת נתונים מחובר נתונים זיכרון גבוהה עכבת קלט (> 1012Ω) ברזולוציה גבוהה (0.1 mV) מד מתח (איור 2b).
    3. להתחבר האלקטרודות מד מתח. לחבר את האלקטרודה החיובית מדידה הקטטר האף, האלקטרודה התייחסות שלילית על הצנתר הוכנס החלל התת עורית איבר הינד, כפי שמוצג באיור 2c.
    4. לטבול את קצות האלקטרודות ביחד בתערובת קרם. בדוק את ערך ההיסט ההתחלתי אלקטרודה. לדחות את האלקטרודות אם הערך גדול מ mV (±) 2 (0 אידיאלי mV).
    5. . הפעילי את משאבת סחרור והכנס את צינור משאבת למקומן, כמופיע באיור2.
    6. להתחבר לשקע הפרוקסימלית של הצינור משאבת המבחנה המכילה את הפתרון הנבחר עבור האף זלוף (איור 2d). להתחבר לשקע דיסטלי של הצינור משאבת לומן זלוף של הקטטר האף (איור 2e).
    7. למלא את לומן אחד של הקטטר האף עם תערובת קרם אלקטרוליט באמצעות טיפ פיפטה 10 µL. להתאים את הצנתר עד מחבר צינור סיליקון (איור 1e), למלא את המחבר עם תערובת שמנת ולהוסיף את האלקטרודה החיובית למחבר (איור 1f). בדוק אלקטרודה מדידה גשר ערך ההיסט. לדחות את הגשרים אם הערך גדול מ mV (±) 2 (0 אידיאלי mV).
    8. למלא לומן השני של הקטטר האף עם הפתרון טריים A1. טובלים את קצה הקטטר האף בתוך המבחנה המכילה פתרון א להפוך את כיוון משאבת סחרור למלא באורך של הקטטר האף המתאים 10 s של זלוף.
      הערה: פעולה זו מאפשרת הקלטת הבזליים PD ערכים עבור 10 s לפני החלת amiloride. טובלים את קצה הקטטר האף בתערובת קרם בפנים המחבר של האלקטרודה הפניה (איור 1).
  2. להתחיל טיפול העכבר.
    1. להקליט את משקל העכבר כדי לחשב את המינון המדויק של חומרי הרדמה כדי להיות מוזרק על ידי תוואי בקרום הבטן (ip)17.
    2. באמצעות מחט 26G (0.45 x 10 מ מ), להזריק premedication intraperitoneally כדי לקדם את תנאי הגיוס של הרדמה: מנה קבועה של 50 µL של 5 מ"ג/מ"ל midazolam. המתן 5 דקות.
    3. מכינים את תערובת הרדמה (פנטניל, medetomidine, דרופרידול בריכוזים הסופי של 0.05, 0.40 20 מ ג/ק ג למשקל הגוף בהתאמה, ו קלונידין במינון קבוע של 0.375 µg) המאפשר עומק אופטימלי ויציב של הרדמה (שלב III, המטוס 2)17 . להזריק את עוצמת הקול של מיקס הרדמה intraperitoneally, ולאחר מכן הוסף את עוצמת הקול של קלונידין.
      הערה: לאחר 15 דקות, העכבר צריך להיות ישן, ההרדמה יכולים להימשך לפחות 30 דקות.
    4. לקפל סדין של קליטת רקמות כדי להפוך 3 ס רחב "הכרית" (איור 2f) המכסה את החלק העליון של כרית החימום (איור 2) כמו תמיכה עבור הראש העכבר.
    5. כיסוי כרית החימום עם גיליון של קליטת רקמות ('המיטה גיליון'; איור 2 g)-להניח את העכבר על גבו על כרית חימום. קלטת את הגפיים ואת הזנב (איור 2).
    6. הכנס את הצנתר תוך ורידי הפניה (איור 1g) בחלל תת עורית של איבר האחוריות. הסר את המחט ולהתאים במחבר צינור סיליקון (איור 1e, 2 c).
    7. למלא את הקטטר, המחבר עם שמנת לערבב ולהוסיף את האלקטרודה השלילית המחבר (איור 1f).
    8. לתקן את הצנתר האלקטרודה עם קלטת ככל הנדרש כדי למנוע כל תזוזה. לאחר הצבת הפניה אלקטרודה וגשרים, לאמת אלקטרודה מדידה גשר ערך ההיסט שוב על ידי טובלים את קצה הקטטר האף בתערובת אלקטרודה קרם בפנים המחבר של הקטטר הרביעי. שיא יציבה הסופי ערך ההיסט (אידיאלי פחות (±) 2 mV).
    9. לתקן את העכבר האוזניים עם "עדין" סרט על כרית חימום בחלל חינם בין שתי חתיכות של קליטת רקמות ("הכרית" (איור 2f) וגליון ' מיטה '; (איור 2g)). לתקן את vibrissae (השערות נוקשות גדל ליד הנחיריים) מבלי לגעת בעיניים.
    10. כדי לספוג את הנוזלים בין חלל הפה, העבר את הלשון לצדדים (איור 3) והוסף הפתיל המחודד של נייר סינון ('הצינור'; איור 3 b) כ-1 ס מ לתוך הפה. כדי לספוג את הנוזלים ואוזל של הנחיר perfused, המקום לגוש נייר סינון ('מהמטפחת'; איור 3 c) החזיק בקצה האף.
    11. בדוק ערך בקרה חיובית של הפוטנציאל האפיתל על ידי הצבת את קצה הקטטר האף בקשר עם החלק הפנימי של הפה.
      הערה: הקריאה צריך להיות יציב ומגוון בין-10 mV ו-20 mV.
    12. מחזיק את זה עם מלקחיים בסדר, תחת תאורה ישירה טוב, בעדינות להציג את הצנתר האף לתוך נחיר אחד עד 4 - 6 מ מ מתוך האף עצה.
      הערה: הצנתר PD האף ממוקם את קונצ'ה האף האמצעי במיקום זה נותן בסיס יציב מקסימלי PD-ערך-17,-20.
    13. 5 דקות לאחר הזרקת תרופות הרדמה, להטות בעדינות את כרית החימום על ידי כ-30 מעלות עם בעלי חיים הראש כלפי מטה. לפקח על הערך PD הבזליים מקסימלי.
    14. מתי זה יציב על פני תקופה של 30 s, התחל פרפוזיה רירית האף, בקצב קבוע של 10 µL / min, עם 4 במאגר הפתרונות (A, A1, B1, B2) ברצף. Perfuse הפתרון הראשון (שלב 1.3.1.1) עבור 10 s וכל הפתרון הבא (שלב 1.4) במשך 5 דקות או עד הגיעה ערך יציב. תפסיק פרפוזיה forskolin (B2), כאשר התגובה forskolin ארעי מתחילה לרדת.
    15. בחר מרווח s 1 עבור נתונים הקלטה. . תתחיל להקליט נתונים בזמן ב"קדושים זלוף להציג נתונים כפונקציה של זמן על מסך המחשב.
    16. הנתונים תפסיק ללכוד בסוף זלוף עם פתרון B2. לשמור את הנתונים בתור קובץ הגיליון האלקטרוני.
    17. הנתונים הנכונים על ידי הפחתה של ערך היסט הסופי.

figure-protocol-3
איור 3 : המיקום של העכבר על משטח חימום עם הצנתר האף וגם מסנן במקום. האיור מדגים את הלשון לשים לצדדים (א) את הצינור (ב), את המטפחת (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. פוסט-מבחן הערכת וניהול

  1. שחרר את העכבר של כרית החימום.
  2. לקנח את האף עכבר עם הסדין למיטה (איור 2g).
  3. מזריקים intraperitoneally את המיקס אנטגוניסט הרדמה המורכב מנה קבועה (4 µg) של נרקאן, אנטגוניסט תחרותי מורפיום, atipamezole, נוגדן ספציפי medetomidine (2 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
  4. להניח את העכבר על כרית חימום קטן יותר בתיבת שחזור עד החלמה מלאה, זה בדרך כלל נצפית לאחר 1-2 h.
    הערה: במעבדה UCL, כ 10% תמותה, הקשורים בעיקר bronchoaspiration של פתרונות perfused בחלל האף במהלך הבדיקה, נצפית ללא התחשבות מגדר או גן # מושגים בסיסיים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש את העיוותים תחבורה יון אופיינית ב- CF, בוצעו מדידות PD באף בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל על העכבר F508del-CF, פקד פראי-סוג של FVB/129 רקע גנטי מהמושבה בריסל של Cftrtm1Eur עכברים30. מודל זה הרלוונטית קלינית, מחסה השכיחה ביותר ואחד חמור ביותר F508del-CFTR מוטציה23,24,25, הוא הטוב ביותר זמין כעת CF העכבר דגם30,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת המאמר היא לתאר את פרוטוקול נאותה למדידת PD באף תחת זלוף רציפה של פתרונות בעכברים באופן ספונטני נשימה עבור משך הזמן הדרוש לבדיקת השלמות של יון מובילים, בעיקר CFTR, ENaC. כל השלבים של הפרוטוקול מוטבו בקפידה כדי להבטיח התאוששות מלאה בבעלי חיים, איכות טובה, לשחזור נתונים. בשלבים מסוים, קריטיים הרדמה הערכת ניהול ואת עמדת בעלי חיים נאותה, אכפת לי במהלך ואחרי הבדיקה.

מחקרים קודמים הראו כי המטוס 2 בשלב השלישי של חשיפה הרדמה, אשר יכולה להיות מושגת על-ידי החלת את התערובת קוקטייל להשתמש כאן

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים תודה פרופסור ג'יי Lebacq לעריכה באופן ביקורתי את כתב היד. Cftrtm1Eur (homozygous F508del-CFTR (FVB/129) עכברים פותחו על-ידי MC ארסמוס, רוטרדם, הולנד, עם התמיכה של הקהילה הכלכלית האירופית פעולה תיאום האירופית לחקר FP6 האיחוד האירופי סיסטיק פיברוזיס LHHM-CT-2005-018932.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור פוליאתילן פורטקס סמיתס מדיקל, היית', קנט, אנגליה CT21 6JLפורטקס 800/100/500; 2.0 מ"מ ID, 3.0 מ"מ ODלהכנת צינורות נימיים לבדיקת
קרם אלקטרודותפרקר, פיירפילד, ניו ג'רזי, ארה"בקרם Reduxלבניית גשרי אלקטרודות
Ag / AgCl אלקטרודותביומדיק, קלינטון טאונשיפ, מישיגן, ארה"בJNS BNT131-1,0אלקטרודות מדידה וייחוס
אמילוריד הידרוכלורידסיגמה, סנט לואיס, מישיגן, ארה"בA7410להכנת תמיסות
פורסקוליןסיגמה, סנט לואיס, מישיגן, ארה"בF6886להכנת פתרונות זלוף
מד מתח Knick PortamessElektronisch Meβ gerä te, ברלין, גרמניהPortavo 904 pHלמדידת הפרש פוטנציאל
Paraly SW 112 תוכנה Elektronisch Meβ gerä te, ברלין, גרמניהתוכנת Paraly SW112ללכידת נתוני הפרש פוטנציאליים
midazolam מיילן, הוילארט, בלגיהדורמיקום 15 מ"ג/3 מ"ללשמש כתרופה מרדימה
פנטנילJanssen Cilag, Berchem, בלגיהפנטניל-יאנסן 0.05 מ"ג/מ"ללשמש כתרופת הרדמה
medetomidineOrion Pharma, אספו, פינלנדדומיטור 1 מ"ג/מ"ללשמש כתרופת הרדמה
דרופרידול יאנסן  סילאג, ברכם, בלגיהדהידרובנזפרידול 2.5 מ"ג/מ"ללשמש כתרופת הרדמה
קלונידין Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, גרמניהCatapressan 0.15 מ"ג/מ"ל,לשמש כמפנה לתרופות הרדמה
צנתר IVBecton Dickinson, Sandy, UT, ארה"ב24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-Wלבניית גשרי אלקטרודות
מלקחיים כלים מדעיים יפים, היידלברג, גרמניהDumont #5, כלים מדעיים עדיניםלהצבת קטטר האף
נלוקסון Braun Medical, בריסל, בלגיהנרקן, 0.4 מ"ג/מ"ללשמש כנוגד הרדמה
אטיפמזול Zoetis, בלומברג, אנטיסדאן בלגי, 5 מ"ג/מ"ללשמש כתרופה ספציפית לרפואה
כריות חימום Harvard Apparatus, Holliston, MA, ארה"18,8x37,5 ס"מ; 15,5x15,5 ס"מלמניעת היפותרמיה במהלך ואחרי הבדיקה
משאבה פריסטלטית P1GE Life Sciences, אופסלה, שוודיה18111091להחדרת תמיסות באף העכבר
דבק ציאנואקרילטLoctite, Henkel, Dü סלדורף, גרמניה דבק סופר 3להדבקת שני צינורות נימיים  לבדיקת אף
NaClSigma, סנט לואיס, מישיגן, ארה"בRES0926S-A7Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2OSigma, סנט לואיס, מישיגן, ארה"בM7304Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2OSigma, סנט לואיס, מישיגן, ארה"ב1551128Pharma-Grade, USP
K2HPO4Sigma, סנט לואיס, מישיגן, ארה"ב1551139בדרגת פארמה, USP
Na גלוקונאטסיגמא, סנט לואיס, מישיגן, ארה"בS2054בדרגת פארמה, USP
Ca גלוקונאטסיגמא, סנט לואיס, מישיגן, ארה"בC8231בדרגת פארמה, USP
MgSO4.7H2Oסיגמא, סנט לואיס, מישיגן, ארה"בRES0089M-A7בדרגת פארמה, מחט BD USP
 בקטון דיקינסון, פרנקלין לייקס, ארה"בBD 26G (0.45x10 מ"מ)הזרקה תוך צפקית
אף זלוףב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5(2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984(2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72(2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים