פרוטאזות הם מוסדרים בחוזקה אנזימים המעורבים התהליכים הביולוגיים הבסיסיים, והתקדמות dysregulated פרוטאז פעילות כוננים של מחלות מורכבות כגון סרטן. בשיטה זו המטרה היא ליצור nanosensors המודדים פרוטאז פעילות ויוו על ידי ייצור לאות המחשוף שקיימים משתן מארח ומפלה המחלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Nanosensors כדי לאתר פרוטאז פעילות In Vivo אבחון לא פולשנית
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטאזות הם אנזימים תפקודי מתמחים הידרוליזה של חלבון שליטה ובקרה רחבה תהליכים ביולוגיים כולל הומאוסטזיס ו- allostasis. יתר על כן, dysregulated פרוטאז פעילות כוננים פתוגנזה ומהווה סמן פונקציונלי של מחלות כמו סרטן; לכן, היכולת לזהות פרוטאז פעילות ויוו עשויים לספק מידע הרלוונטית קלינית למחקר ביו-רפואי. המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור nanosensors זה מנצלים פרוטאז פעילות ויוו על ידי ייצור אות הניתנת לכימות בשתן. אלה nanosensors פרוטאז מורכב משני רכיבים: ננו-חלקיק בעלת המצע. הפונקציות nanoparticle כדי להגדיל את זרימת הדם half-life, המצע משלוח לאתרים המחלה היעד. המצע הוא רצף פפטיד קצר (6-8 AA), אשר נועד להיות ספציפי פרוטאז היעד או לקבוצה של פרוטאזות. המצע היא מצומדת השטח של ננו-חלקיק, על-ידי כתב, כגון סמן פלורסנט, לצורך זיהוי. כפי dysregulated פרוטאזות קליב המצע פפטיד, הכתב סוננו לתוך השתן על כימות כמו סמן של פעילות פרוטאז. במסמך זה אנו מתארים את בניית ננו-חיישן עבור מטריקס מטאלו-פרוטאינאז 9 (MMP9), אשר מזוהה עם התקדמות הגידול, גרורות, גילוי של סרטן המעי הגס במודל של עכברים.
מבוא
פרוטאזות הם אנזימים תפקודי מתמחים הידרוליזה של אג ח פפטיד, יש שליטה משמעותית על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל הומאוסטזיס, allostasis של המחלה1. יש כבר בקורלציה מצב פעילות פרוטאז למגוון רחב של מחלות, כולל סרטן ומחלות לב וכלי דם, שהופך מועמדים אטרקטיביים פרוטאזות פיתוח לתוך סמנים קליניים2,3. יתר על כן, פעילות פרוטאז היא פונקציונלית מקושר ברורים pathogeneses, תוצאות המטופל ואת הפרוגנוזה של המחלה4. באופן כללי, ביולוגיים פותחו כדי לזהות תופעות ביולוגיות שונות ומעבד מחלות, כגון סרטן, מחלות ניווניות, העברת-אלקטרונים5,-....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אישור מוסדי אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) במוסד של החוקר יש צורך לבצע את הניסויים בבעלי חיים הבאים. בנוסף, מתקני טיפול בבעלי חיים רגיל (למשל, דיור צ'יימברס, וקולטי בעלי חיים סטרילי, לשכות isofluorane ההרדמה ו CO2 לשכות euthanization קצה אתית) יש צורך לבצע כראוי את אלה ניסויים. ניתן לספק הכשרה מיוחדת וסיוע עם מתקנים אלה על-ידי פיזיולוגיים מחקר מעבדה (PRL) במוסד אחד. כל העבודה בעלי חיים אושרה על-ידי IACUC ג'ורג'יה טק (פרוטוקול: A14100).
1. תחמוצת ברזל סינתזה ננו-חלקיק (IONP)
הערה: בטיחות: הסינתזה תחמוצת ברזל Nanoparticle כולה צריכה להתבצע באמצעות ציוד מגן אישי, מתחת כימית מנדף.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הרוב המכריע של האוכלוסייה IONPs הוא סביב הקוטר ממוצעת, אשר נע בין 40-50 ננומטר. אחרי pegylation, הטווח בגודל זה יש מחזור זמן מחצית חיים של 6 שעות13 ויוו (ראה איור 2 א). אם אדם רוצה לבחור את טווח בגודל מסוים, אחד באפשרותך להשתמש בגודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה לבודד IONP שברים עם קטרים שונים. חלקיקים מאת TEM יופיע כ תפור חלקיקים בודדים תחמוצת ברזל כדורית יחד על ידי שכבה חיצונית לתוספי. 13
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטה זו מתארת את התפתחות nanosensors מבוססי פעילות בהיקף של סובסטרטים פרוטאז מצומדת אל ליבה של ננו-חלקיק. האירוע של פצילות הפרוטאוליטי שכונתה "הבורר פרמוקוקינטיים", כי פפטיד cleaved מוצרים קטנים יותר ממגבלת גודל הכליות סינון של 5 nm23 ו מסנן לתוך השתן כדי לייצר אות לא פולשנית. לכן, חשוב להשתמש חלקיקים או נשאים עם רדיוס hydrodynamic שגודלם 5 nm, כמו כל דבר קטן ינוקה במהירות על-ידי הכליות, וחיסול שתן אותות. אנו משתמשים pegylated IONPs כי הם שאושרו על-ידי ה-FDA, נסבל היטב, ויש להם מחצית חיים במחזור ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ד ר וואנג הנו מייסד, והוא משמש יועץ ביו Glympse, אשר מפתחת מוצרים הקשורים המחקר המתואר במאמר זה. מחקר זה עשוי להשפיע על מעמדם הכלכלי האישי שלו. תנאי ההסדר הזה יש כבר נבדקו ואושרו על-ידי ג'ורג'יה טק מדיניותה ניגוד אינטרסים
תודות
עבודה זו מומן על ידי פרס חדשן חדשה (פרס מס ' של מנהל NIH DP2HD091793). Q.D.M. נתמך על ידי ה-NSF מחקר מלגות לתוכנית לבוגרים (מענק מס ' DGE-1650044). B.A.H נתמך על ידי נבחרת מוסדות של בריאות GT BioMAT אימונים המענק תחת מספר פרס 5T32EB006343, כמו גם מלגת הנשיא ג'ורג'יה טק. G.A.K. מחזיק פרס הקריירה ב הממשק מדעי מהקרן ברוכים הבאים בורוז. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 ומיקרו; מסנני מזרק m | VWR | 4652 | |
| 18G מחט | VWR | 89134-024 | |
| 15 מ"ל חרוטים | VWR | 89039-670 | |
| 250 מ"ל בקבוק Erlenmeyer | VWR | 89000-362 | |
| מוט ערבוב | VWR | 58949-006 | |
| פלטה חמה/בוחש מגנטי | VWR | 97042-634 | |
| חומצה | אצטית קרחוניתVWR | 97064-482 | |
| אלבומין מסרום בקר (BSA) | Thermo Fisher | A13100 | |
| ברזל (III) כלוריד הקסהידראט | סיגמא | 236489 | |
| ברזל (II) כלוריד טטרהידרט | סיגמא | 44939 | |
| אפיכלורוהידרין | סיגמא | 45340-500ML-F | |
| DMF | סיגמא | D4551 | |
| אמוניום הידרוקסיד | סיגמא | 320145-500 מ"ל | |
| כדורי נתרן הידרוקסיד | סיגמא | 221465-500G | |
| EDTA | סיגמא | E9884 | |
| נתרן בוראט | סיגמא | B9876 | |
| L-ציסטאין | סיגמא | 168149-100G | |
| Tris-HCl | סיגמא | T5941 | |
| טריס בסיס | סיגמא | T6066 | |
| טבליות PBS | סיגמא | P4417 | |
| Dextran | Pharmacosmos | 5510 0020 9006 | |
| Amicon 15 מ"ל 10k מסננים, 24 pk | Millipore | UFC901024 | |
| Amicon 15 מ"ל 30k מסננים, 24 | pk Millipore | UFC903024 | |
| Amicon 15 מ"ל 100k מסננים, 24 | pk Millipore | UFC910024 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | NanoZS | |
| Slide-A-Lyzer קלטת דיאליזה | LifeTech | 66130 | |
| Dynabeads MyOne Tosylactivated | LifeTech | 65501 | |
| SIA | Life Tech | 22349 | |
| PEG 20k | Laysan Bio | MPEG-SH-20K-1g | |
| נוגדן פלואורסצאין [2A3] | GeneTex | GTX10257 | |
| Hiload 16/600 superdex 200 | GE Healthcare | 45-002-490 | |
| קורא צלחות | פישר | BTCYT5M | |
| מזרקי אינסולין BD | פישר | NC0872854 |
מקורות
- Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
- Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
