וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.

תקציר

בעלי חיים רבים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מסוגלים מפלה דקה ההבדלים בטמפרטורה הסביבה, המאפשרת להם לחפש את נוף תרמי המועדפת שלהם. כדי להגדיר את העדפות טמפרטורה של הזחלים מעל טווח מוגדר ליניארי, פיתחנו וזמינותו של שימוש הדרגתי בטמפרטורה. כדי ליצור מעבר הדרגתי חד כיווני, שני רחובות אלומיניום מחובר אמבטיות מים עצמאית, שכל אחד מהם שולט הטמפרטורה של בלוקים בודדים. שני רחובות להגדיר את הגבולות העליון והתחתון של מעבר הצבע. מעבר הצבע החום היא הוקמה על ידי הצבת צלחת אלומיניום מצופה agarose מעל שני רחובות שבשליטת מים כך הצלחת משתרע על המרחק ביניהם. הקצוות של צלחת אלומיניום המוגדר על אבני מים מגדיר את טמפרטורת מינימום ומקסימום, ויוצרים האזורים שביניהם שני רחובות הדרגתי טמפרטורה לינארי. הדרגתיות וזמינותו שניתן להחיל על רימות בגילאים שונים, ניתן להשתמש כדי לזהות מוטנטים כי התערוכה הפנוטיפים, כגון אלה בעלי מוטציות המשפיעות על גנים קידוד TRP ערוצים ו opsins, אשר נדרשים עבור טמפרטורה אפליה.

מבוא

Thermotaxis הוא מועסק על ידי חיות ניידים לבחירת סביבה עם מצוינות והומלץ תנאים^1,2,3. אם האקלים בצורה מוגזמת חם או קר, התנהגות זו חיונית להישרדותו. בנוסף, בעלי חיים רבים רגישים מאוד קטן הבדלי טמפרטורה בטווח נוח ונחפש את הסביבה עם טמפרטורה אידיאלית. זה חשיבות מיוחדת עבור אורגניזמים poikilothermic כמו זבובי פירות, אשר equilibrate טמפרטורת גופם עם הסביבה. מבחני לעקוב אחר thermotaxis הזחל סייעו בזיהוי, ולהבהיר את התפקידים של חיישנים מולקולריים כגון דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים (TRP) ערוצים^4,5,6, rhodopsins^7,8, ionotropic קולטן קולטנים (IRs)⁹, ואשר היצוקים החיות האלה עם רגישויות הטמפרטורה מעל טמפרטורה שונות טווחים.

בדיקת הבחירה דו כיוונית מספקת גישה אחת ללמוד העדפות תרמי ב הזחלים^6,7. וזמינותו כרוך בהקמת שני אזורי טמפרטורה שונות ומאפשרת החיות לבחור צד אחד על השני. התוצאות של מבחנים דו כיוונית הבחירה יכול להיות חזקים, במיוחד אם ההבדלים בטמפרטורה בין שתי האפשרויות הן גדולות. בנוסף, מאז כל assay כרוך ליווח רק לשתי קבוצות, הנתונים ניתן לבטא מאינדקס העדפה פשוטה. הקלות והפשטות של מבחני בחירה דו-כיווני נתונות גם למסכים גנטי. אולם, מגבלה עיקרית היא כי ניסויים רבים נדרשים לקבוע את הטמפרטורה המועדף של חיות פראי-סוג או מוטציה.

Assay הדרגתיות מציעה הזדמנות להקים את הטמפרטורה המועדף assay יחידה⁸. יתר על כן, בניגוד הבדיקה הבחירה דו-כיווני, הוא מאפשר את ההערכה של ההתפלגות של קבוצה של בעלי חיים, כאשר התעמת עם טווח רציף של טמפרטורות. Assay מעבר צבע אחד משתמש צלחת פטרי וחיות יחיד והוא מתאים היטב אפיון ההתנהגות מפורט של חיות בודדות¹⁰. אולם, מאז פטרי עגול, הגודל של אזורי טמפרטורה משתנים, קטנים בהדרגה בהתאם למרחק מן המרכז. לכן, תוכנית התקנה זו אינה אידיאלית לניטור הבחירות טמפרטורה של אוכלוסיות בעלי חיים.

מנגנון הדרגתיות תרמי רציפה, כי הוא מתאים היטב כדי להעריך את העדפות טמפרטורה של קבוצות של הזחלים מעסיקה של ארנה מלבני, מתואר כאן. המנגנון הוא פשוט לבנות ולהרכיב. בנוסף, מעבר הצבע הוא ליניארי, הוא גמיש, כמו זה יכול לשמש כדי להעריך את thermotaxis מעל טמפרטורה גדול נע בין 10 ° C ל 42 º C. וזמינותו היא מהירה וישירה לביצוע ותשואות לשחזור נתונים. בנוסף דיווח הטמפרטורה המועדף של הזחלים, היא מגלה את ההעדפות של אוכלוסיית חיות מעל וההתדיינות ליניארי בניסוי יחיד. בשל יתרונות אלו, זה הוא בחירה מצוינת עבור זיהוי גנים הדרושים עבור thermotaxis.

פרוטוקול

1. ציוד ייצור, וההספק מכשירי מבחני הדרגה

1. לפברק את הצלחות assay אלומיניום עבור וזמינותו מעבר חד כיווני.
   1. לקצץ, לטחון כל צלחת assay אלומיניום (איור 1 א'). חתיכה אחת של אלומיניום באמצעות חבל מאד, מסור, חדים אנכי מיל בעל הממדים הבאים: הגודל החיצוני הוא 140 x 100 x 9 מ מ, הגודל הפנימי הוא 130 x 90 x 8 מ מ (איור 1B). אילגון (אנודייז) הפנימי של כל צלחת assay בצבע שחור כדי שיהיה קל יותר לדמיין את הזחלים, מונע חלודה.
      הערה: ייצור של הלוחות assay אלומיניום למעבר הצבע חד כיווני נעשית על ידי חנות מכונות. Anodization מתבצע על ידי ספק מסחרי.
   2. סמן חישוקים העליון והתחתון של כל צלחת assay עם מטוס 13, מופרדים על-ידי 10 מ מ בעזרת סמן קבוע. מקם את הראשונה והאחרונה מטוס 5 מ מ מהקצה הפנימי של הלוחות assay (איור 1 א', ב').
2. כדי לפברק את הצלחת assay אלומיניום למעבר הצבע דו-כיווני, לגזור צלחת אלומיניום עם הממדים הבאים באמצעות המזמרה מתכת: 250 x 220 x 2 מ"מ. אילגון (אנודייז) צלחות assay עם צבע שחור.
   הערה: ייצור של הלוחות assay אלומיניום עבור מעברי הצבע דו-כיווני מתבצע על ידי חנות מכונות. Anodization נעשית על ידי ספק מסחרי.
3. לפברק את קוביות אלומיניום.
   הערה: שני רחובות יש צורך במעבר חד כיווני, שלושה גושי בניינים יש צורך במעבר הצבע דו-כיווניים.
   1. לגזור את קוביות אלומיניום (איור 1C) חתיכה אחת של אלומיניום באמצעות מסור הלהקה (מידות של 50 x 255 x 14 מ מ) (איור 1C, יח).
   2. התרגיל תעלת המים בתוך הבלוק (7 מ מ מ) באמצעות מפעל אנכי, חריצים חוט הקצוות פתוחים בצד אחד (איור 1D). לסגור את החורים מחורץ עם בריחים, קלטת חותם להקים תעלת מים בצורת U (איור 1C, יח).
      הערה: הזיוף של אבני assay אלומיניום מתבצע על ידי חנות מכונות.
   3. לתקן את המחבר בבלוק האלומיניום (איור 1D) עם תבריג, חוט חותם קלטת בקצה אחד. להכניס את הקצה השני עם ווים מרובים סיליקון אבובים (1/4 פלייר מזהה x 3/8 פלייר OD x "1/16" קיר).
4. להשיג שתי אמבטיות במחזור קירור/חימום.
5. להרכיב מבוקרי טמפרטורה רחובות עבור מערכת assay הדרגתיות.
   1. למעבר הצבע חד כיווני, להתחבר לכל אחד שני רחובות אלומיניום באמבט מים נפרד כך הטמפרטורה של כל בלוק נשלטת על ידי מים עצמאית מחזורי מערכת (איור 2 א). השתמש סיליקון אבובים (1/4 פלייר מזהה x 3/8 פלייר OD x "1/16" קיר) כדי להתחבר לשקע של האמבטיה מים המחבר בצד הפנימי של בלוק אלומיניום (איור 2 א). בנוסף, להשתמש אבובים להתחבר המחבר הצד החיצוני בבלוק האלומיניום לים ביסוד אמבט מים.
   2. למעבר הצבע דו-כיווני, במקום שניים שלושה רחובות תחת בצד שמאל ובצד הימני של הצלחת ולחבר אותם לאמבטיה מים אותו עם הצנרת (איור 2B). להתחבר הרחוב אלומיניום השלישי תנורים והמקום השני מתחת למרכז של הצלחת (איור 2B).
      הערה: זה המנגנון ואת וזמינותו הם הצורך רק אם הזחלים להצטבר באזור קצה אחד או אחר של המילוי ההדרגתי חד כיווני. אם כך, חשוב להעריך אם יש אפקט קצה או לא. כדי לבדוק אפשרות זו, ליצור מעבר הדרגתי דו-כיווני שבו הטמפרטורה באזור קצה המועדף על הזחלים שימוש במעבר חד כיווני (למשל 18 ° C) היא הטמפרטורה במרכז הצלחת של המילוי ההדרגתי דו-כיווני (איור 3E , F).

2. זחל סינכרון

1. לטפח זבובים כדי לשמש להטלת ביצים.
   1. לערבב גרגרי שמרים, מים מזוקקים עם כבעלי כדי להפוך שמרים להדביק. ביסודיות לטחון ומערבבים עד מרקם של הדבק דומה חמאת בוטנים. למנוע הדבקה יבש בצורה מוגזמת, אשר אגיע בעת העברת הזבובים בקבוקונים טריים, או רטובה הדבק, אשר יכול ללכוד את הזבובים.
   2. בעזרת כבעלי, להוסיף את העיסה שמרים קרוב הקירות הפנימיים של בקבוקונים דרוזופילה רגילה, מעל פני השטח של המזון.
   3. ספירת 12-35 נקבות ו עד חצי זכרים רבים (אך לא יותר מ 10) על משטח₂ CO, ולהוסיף את נקבות וזכרים בקבוקון המכיל הדבק כל שמרים.
   4. כדי לשמור את הזבוב מזון עם השמרים-הדבק לח, בזמן ניזונים הזבובים, משלבים את שתי המבחנות מגש המכיל עד 100 צלוחיות עם 20 בקבוקונים פתוח המכיל רק מים מזוקקים. מניחים את המגש בשקית פלסטיק שקוף, אטום.
   5. דגירה המגש ב חממה 25 ° C במשך 48 שעות כך הנקבות מוזנים כראוי, ובעקבותיו אותם להניח מספר רב של ביצים.
2. להגדיר את הבקבוקונים להטלת ביצים.
   1. העברת הזבובים ניזונים לתוך צלוחיות אוכל חדש לאיסוף ביצים על ידי הקשה אותם מעל. אל תשתמש CO_2, מה שעשוי לגרום הזבובים להטיל ביצים פחות מעל חלון זמן קצר הבאים.
      הערה: בקבוקונים מזון רגיל דרוזופילה משמשים ללא שמרים הדבק לאוסף ביצה.
   2. לאפשר את הזבובים להטיל ביצים במשך 3 שעות 25 ° c כך כל הביצים נאספים מעל חלון זמן קצר יחסית.
      הערה: זה יאפשר את הזחלים לסינכרון בשלב התפתחותי זהה.
   3. מקם את הבקבוקונים המכיל את הביצים במגש המכיל את הבקבוקונים מים והדק את התיק. דגירה 25 ° c תחת אור 12 h: 12 מחזורים כהה h.
   4. גיל הזחלים עבור מספר נתון של שעות אחרי ביצה הנחת (AEL) בהתאם הזחל הרצוי.
      הערה: בטבלה 1 הוא הערכה של היחס בין השעות AEL, הזחל, אשר עשויות להשתנות בהתאם למלאי לטוס המזון נעשה שימוש, לגידול טמפרטורה וכו היחס המדויק בין AEL, שלב התפתחותי צריך להיות אומת על-ידי כל חוקר באמצעות קריטריונים פיזי, כגון המורפולוגיה של הפה ווים, spiracles¹¹.

3. שינוי טמפרטורה ההתקנה

1. להכין מעבר חד כיווני
   1. כדי ליצור סביבה אמביינט לח במהלך מבחני, למקם את שני רחובות אלומיניום מחובר שתי אמבטיות מים על מגבות נייר רטוב, מופרדים על-ידי 10 ס מ (איור 2 א).
   2. הפעל את שתי אמבטיות מים ~ 2 h לפני ייזום וזמינותו כדי לאפשר מספיק זמן הטמפרטורה של הבלוקים אלומיניום כדי equilibrate.
      הערה: מומלץ לבצע ניסוי מדומה כדי לקבוע את הטמפרטורה של כל המים הרותחים הדרוש כדי להשיג את מעבר הצבע הרצוי טמפרטורה לינארי. כמה טמפרטורה אופיינית זוגות להגדרת המרחצאות מים מפורטים בטבלה 2. עם זאת, שים לב כי הטמפרטורות המשטח הושפעו טמפרטורת הסביבה. אורך צינורות גם משפיעה על הטמפרטורות כמו שיש היא לקרר את החצוצרות שלה. אורך הצנרת בהגדרת שלנו הוא 1.5 m.
   3. מיקרוגל 100 מ של 1% agarose-ההגדרה ובעוצמת ב- 500 מ ל סביב הבקבוק. הפה רחב, יוצקים 25 מ ל/assay לוחית הזיהוי רמת benchtop. להכין שתי צלחות assay, שבו ניתן להציב על בלוקים אלומיניום בו זמנית (איור 2 א).
   4. לאחר agarose פני השטח הפך למוצק (10-20 דקות), יש לשפשף בעדינות כל משטח agarose עם ספוג מטבח סטנדרטי או ספוג מלמין כדי להפוך את השטח agarose מעט גסה, כך כאשר התזת מים על הג'ל agarose, ייווצר קרום המים דק וחלק, טיפות מים לא יהוו.
   5. מלא להטביע את הצלחות במיכל עם מים מזוקקים עד וזמינותו יהיה מוכן שיש לבצע כדי למנוע הגעה desiccated הלוחות.
2. להכין הדרגתי דו-כיווני (אופציונלי)
   1. כדי ליצור סביבה אמביינט לח במהלך מבחני, במקום אלומיניום שלושה רחובות 8 ס"מ אחד מהשני (איור 2B) על מגבות נייר רטוב.
   2. הפעל את שתי אמבטיות מים ~ 2 h לפני ייזום וזמינותו כדי לאפשר מספיק זמן הטמפרטורה של הבלוקים אלומיניום כדי equilibrate.
      הערה: מומלץ לבצע ניסוי מדומה כדי לקבוע את הטמפרטורה של כל המים הרותחים למעבר הצבע דו-כיווניים. כמה טמפרטורה אופיינית זוגות להגדרת המרחצאות מים מפורטים בטבלה3. עם זאת, שים לב כי הטמפרטורות המשטח הושפעו טמפרטורת הסביבה. אורך צינורות גם משפיעה על הטמפרטורות כמו שיש היא לקרר את החצוצרות שלה. אורך הצנרת בהגדרת שלנו הוא 1.5 m.
   3. כדי למנוע את agarose לשפוך הצלחת, לעטוף את הקצוות של צלחת אלומיניום עם תיוג הקלטת כדי ליצור קיר 10 מ מגבוהה (איור 2B).
   4. באמצעות הגדרת ובעוצמת, מיקרוגל 200 מ של 1% agarose ב 500 מ"ל סביב הבקבוק. הפה רחב ויוצקים 120 מ ל צלחת וזמינותו.
   5. לאחר agarose פני השטח הפך למוצק (~ 30 דקות), יש לשפשף בעדינות כל משטח agarose עם ספוג מטבח סטנדרטי או ספוג מלמין לעשות את השטח agarose מעט גסה, כך כאשר התזת מים על הג'ל agarose, נוצר קרום המים דקים חלקה ולא טופס טיפות מים.
   6. מלא להטביע את הצלחות assay במיכל עם מים מזוקקים עד וזמינותו יהיה מוכן שיש לבצע כדי למנוע ייבוש.
3. הגדרת צבע חד כיווני
   1. להכין ריאגנטים ופריטים על ספסל ליד המנגנון assay הדרגתי (ראה את הטבלה של חומרים).
   2. כדי לקדם את העברת החום יעיל, למלא פערים בין הבלוקים אלומיניום הלוחות assay על ידי התזת מים על הממשק בין רחובות צלחת.
   3. באמצעות כפפות, הסר את הצלחות assay מיכל המים. אם המים פולש בין הג'ל agarose את הצלחת וגורם בליטות לטופס על פני השטח, להסיר את המים עם micropipette P1000.
   4. המקום הלוחות assay על בלוקים אלומיניום כך מטוס כי הם 2 ס מ מקצה אחד בדיוק תואם את הקצוות של הבלוקים אלומיניום (איור 2 א, ג).
   5. להתיז מים על גבי המשטח של הצלחת (קרום דק מים המשתרע על פני agarose מספיקה) כדי למנוע את הג'ל agarose ממנו להתייבש. ודא כי קרום המים היא רציפה וללא טיפות מים מאז הזחלים יכולים להילכד בתוך טיפות מים.
   6. לכסות את המערכת מעבר צבע עם קופסת קרטון כדי להקטין התאדות המים ולסייע לייצב את הטמפרטורה של פני השטח ג'ל. ממתינים 5-10 דקות לאפשר לטמפרטורה equilibrate.
   7. בדוק את טמפרטורת פני השטח בנקודות 12 בצלחת (איור 2C). קחו שתי מדידות בתוך כל אזור כדי לקבוע אם יש השתנות בתוך אזור. ודא כי הטמפרטורה בשני היא בטווח של ± 0.2 ° C של הטמפרטורה הרצויה.
      הערה: השתנות בתוך אזור מתרחשת בדרך כלל מאחר מרחקים מדויקים שתי נקודות על הקצה של הבלוקים אלומיניום אינם זהים. להתאים את המיקום של הצלחת על בלוקים אלומיניום כדי לוודא מטוס כי הם 2 ס מ מקצה אחד בדיוק תואם את הקצוות של הבלוקים אלומיניום.
   8. אם המילוי ההדרגתי הטמפרטורה שנמדדה חורגת מעבר הצבע הרצוי, להגדיל או להקטין את setting(s) טמפרטורה של אמבט מים, בדוק את טמפרטורת פני השטח לאחר הטמפרטורה של bath(s) המים stabilize(s).
   9. מכסים את המערכת מעבר צבע עם קופסת קרטון עד לתחילת וזמינותו.
4. הגדרת צבע דו-כיווני (אופציונלי)
   1. להכין ריאגנטים ופריטים על ספסל ליד המנגנון assay הדרגתי (ראה את הטבלה של חומרים).
   2. תרסיס מים על פני השטח של שלושה רחובות אלומיניום כדי לקדם את העברת החום יעיל של הבלוקים אלומיניום אל צלחות assay באמצעות מילוי פערים בין המשטחים.
   3. הסר את הצלחות assay בקפידה מיכל המים ומניחים על הבלוקים אלומיניום. אם המים פולש בין הג'ל agarose את הצלחת, אשר עלול לגרום בליטות לטופס על פני השטח, להסיר את המים עם micropipette P1000.
   4. המקום לצלחת assay על בלוקים אלומיניום כך midlines של האזורים הראשונים והאחרונים מקצה גם להתאים במדויק את הקצוות של הבלוקים אלומיניום דו צדדי (איור 2B, יח).
   5. להתיז מים על גבי המשטח של הצלחת (קרום דק מים המשתרע על פני agarose מספיקה) כדי למנוע את הג'ל agarose ממנו להתייבש. ודא כי קרום המים היא רציפה וללא טיפות מים, מאז הזחלים יכולים להילכד בתוך טיפות מים.
   6. לכסות את המערכת מעבר צבע עם קופסת קרטון כדי להקטין התאדות המים ולסייע לייצב את הטמפרטורה של פני השטח ג'ל. המתן 5-10 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה equilibrate.
   7. בדוק את טמפרטורת פני השטח-שתי נקודות לאורך הקו האמצעי של כל אחד מהאזורים 10 (איור דו-ממדי). קחו שתי מדידות בתוך כל אזור כדי לקבוע אם יש השתנות בתוך אזור. ודא כי הטמפרטורה בשני היא בטווח של ± 0.2 ° C של הטמפרטורה הרצויה.
      הערה: השתנות בתוך אזור מתרחשת בדרך כלל מאחר מרחקים מדויקים שתי נקודות על הקצה של הבלוקים אלומיניום אינם זהים. להתאים את המיקום של הצלחת על בלוקים אלומיניום כדי לוודא כי midlines של האזורים הראשונים והאחרונים הקרוב מקצה אחד להתאים במדויק את הקצוות של הבלוקים אלומיניום דו צדדי.
   8. אם המילוי ההדרגתי הטמפרטורה שנמדדה חורגת מעבר הצבע הרצוי, להתאים את setting(s) טמפרטורה של אמבט מים, בדוק את טמפרטורת פני השטח לאחר הטמפרטורה של bath(s) המים stabilize(s).
   9. מכסים את הבלוקים עם קופסת קרטון עד תחילת וזמינותו.

4. אוסף זחל, כביסה

1. לבודד את הזחלים נקי (אפשרות 1)
   1. להוסיף ~ 40 מ ל 18% סוכרוז פתרון מבחנה 50 מ. סקופ כל, הזחלים vial(s) מזון עם scoopula, העברת הפיתרון 18% סוכרוז.
   2. מערבבים ביסודיות אבל בעדינות באמצעות scoopula להפריד פסולת המזון הזחלים. המתן 30-60 s עד לבמה הזחלים לשכבה העליונה של הצינור. יוצקים בשכבה העליונה הכוללת את הזחלים (~ 10 מ"ל) עוד 50 מ ל צניעותו ולמלא את הצינור עם טרי 18% סוכרוז פתרון. המתן 30-60 s עד לבמה הזחלים לשכבה העליונה שוב.
      הערה: חלקיקי מזון גדולים לפעמים להעביר יחד עם הזחלים, עשוי להשפיע על זחל thermotaxis אם הם לא יוסרו. אם חלקיקי מזון גדול נשארים בשכבה העליונה, חזור על השלבים 4.1.1-4.1.2 או להסיר אותם באמצעות scoopula באופן ידני.
   3. להעביר את השכבה העליונה של הזחלים (~ 10 מ"ל) שני צינורות אחרים 50 מ ל, למלא את שני צינורות מים מזוקקים כדי להפחית את ריכוז סוכרוז, כך הזחלים במהירות טובע במים. חכו 30-60 s עד הזחלים שקעו. מבצע זה, השלבים הבאים במהירות האפשרית כדי למנוע את הזחלים מטביעה.
   4. להתעלם כל כך הרבה של המים ככל האפשר בהטיית בעדינות את הצינורות. לשלב הזחלים לתוך שפופרת אחת על-ידי שמוציא את הזחלים עם המים שנותרו ולמלא את הצינור מים מזוקקים.
   5. חכו 30-60 s עד כל הזחלים יישאבו ולהסיר כמה שיותר מים ככל האפשר בהטיית בעדינות את הצינורות. חזור על שלב זה כביסה 2 - 4 פעמים כדי לחלוטין להסיר סוכרוז ומזון לעין כל.
   6. למחוק את כמות המים ככל האפשר ולהעביר את הזחלים ריקה 35 מ"מ פטרי מאת decanting. לרסס את הצינור עם מים ולהשתמש מכחול קטנות כדי לעזור להעביר את הזחלים.
   7. הסר את המים העודפים הפטרי באמצעות micropipette של P1000. יוצאים ~0.5 מ ל מים כדי למנוע התייבשות של הזחלים.
   8. מניחים את המכסה על המנה כדי למנוע את הזחלים של בריחה. הפעל את המכסה הפוך כדי להפחית את היכולת של הזחלים לברוח דרך פער קטן בין המכסה המנה. לאפשר את הזחלים להתאושש במשך 10-20 דקות.
2. לבודד את הזחלים נקי (אפשרות 2)
   הערה: זו שיטה חלופית לניקוי הזחלים מפחית את הסיכון של האפשרות חונק את הזחלים במהלך ההליך כביסה. כדי להשתמש בשיטה זו, להמשיך עם השלבים הבאים לאחר ביצוע של 4.1.1-4.1.2 השלבים לעיל.
   1. מניחים מסננת תא (300 מיקרומטר, שומר על הזחלים 72 h AEL ומעלה) על גבי צינור 50 מ ל.
   2. לאחר שנוכח כי אין הגופות בוגרת או פסולת מזון צפים על פני הפתרון סוכרוז, יוצקים בשכבה העליונה הכוללת את הזחלים דרך מסננת מלכודת כל הזוחלים על המסך רשת. לשטוף את הזחלים ביסודיות עם מים מזוקקים עד הצינור 50 מ ל מלא.
   3. הסר את מסננת תא עם הזחלים, השלך המים מהצינור. מניחים על מסננת המכילה את הזחלים על גבי הצינור ריק ולשטוף את הזחלים שוב עם מים מזוקקים עד הצינור 50 מ ל מלא.
   4. להפוך את מסננת הפוכה ריקה 35 מ"מ פטרי, לרסס מים מחלקו העליון של מסננת התא כדי להעביר את הזחלים הפטרי. להעביר את הזחלים הנותרים בעזרת מברשת צבע קטנים.
   5. ממשיכים לצעוד 4.1.7 מעל לפני שתמשיך לשלב 5.

5. assay וחישוב

1. הסר את תיבת הקרטון, בדוק את טמפרטורת פני השטח של ג'ל מיד לפני העברת הזחלים לצלחת. למזער את הזמן תיבת קרטון פתוחה כדי למנוע שיבוש equilibration את הטמפרטורה. אם המשטח יבש, לרסס כמות קטנה של מים על פני השטח.
2. להפיץ את הזחלים 150 ± 50 במרכזה של כל צלחת (בין אזורי 3 ו- 4 מתוך האזורים 6) למעבר הצבע חד כיווני (אזור שחרור; איור 2C).
   הערה: עבור מעבר הצבע דו-כיווני, להפיץ 200-400 הזחלים לאורך האזור האמצעי של כל חצי (איור דו-ממדי).
3. הצב מכסה microplate מעל כל צלחת assay כדי למנוע את הזחלים של זוחלים החוצה. מכסים את ההתקנה עם קופסת קרטון כדי למנוע חשיפה קלה, דבר שעשוי להשפיע על הבחירה זחל על הג'ל agarose.
   הערה: עבור מעבר הצבע דו-כיווני, זה צריך שלא יהיה צורך לכסות את הצלחת עם מכסה, כי הצלחת הוא גדול יותר, הטמפרטורה המועדף של הזחלים היא באזור האמצעי. כתוצאה מכך, כמה הזחלים לצבור בקצוות, יש הזדמנות לזחול החוצה.
4. לאפשר וזמינותו להמשיך למשך 10-30 דקות במעבר חד כיווני, ולכל 15-35 דקות של מעבר הצבע דו-כיווני, תלוי בגילו של הזחלים (טבלה 4).
5. הסר את תיבת הקרטון המכסה microplate. לצלם את הצלחות מלמעלה באמצעות מצלמה דיגיטלית. קח שתי תמונות של כל צלחת assay החוקר יכול לבחור עם ניגודיות ובהירות יותר לניתוח.
6. להסיר את כל הזחלים של הלוחות assay ובכל מקום בחוץ את הצלחות על-ידי שאיפה.
7. נקו את הצלחות assay, הצינורות, את מסננת תא ביסודיות עם מים מזוקקים. שימוש חוזר הלוחות assay מוכן באותו היום אלא אם השטח של agarose פגומה.
8. לחשב את ההתפלגות באחוזים של זחלים. בתוך כל אזור.
   1. פתחו את התמונה הצילום של התוצאות assay באמצעות תוכנה המאפשרת הוספת סימונים על התמונה. כדי לציין את אזורי assay, צייר קווים אנכיים כל 2 ס מ בהתאם מטוס על הצלחת וזמינותו.
   2. לספור את מספר זחלים. בתוך כל אזור ולהקליט את המספרים. לא נחשבות הזחלים באזורים 0.5 ס מ כל אחד הקירות. הג'ל הוא עבה יותר ליד החומות, הטמפרטורות המשטח אינם ליניאריים באזורים אלה.
   3. למעבר הצבע חד כיווני, לחשב את ההתפלגות באחוזים באזור כל כדלקמן:
      (מספר של הזחלים בתוך אזור נתון 2-ס מ) / (מספר כולל של הזחלים באזורי 6) x 100.
   4. למעבר הצבע דו-כיווני, לחשב את ההתפלגות באחוזים באזור כל כדלקמן:
      (מספר של הזחלים בתוך אזור נתון 2-ס מ) / (מספר כולל של הזחלים ב 5 אזורי בכל צד של מעבר הצבע) x 100.

תוצאות

להקים 18 ° C - 28 מעלות צלזיוס חד כיווני ההדרגתי, נוכל להגדיר הטמפרטורות של שתי אמבטיות מים 16.8 ° C ו- 31 מעלות צלזיוס. אנו משיגים את הטמפרטורות ב 13 נקודות על ידי מדידת הטמפרטורה ב 26 תנוחות בתוך החלק העליון והחלק התחתון של כל האזורים 6, קווי הגבול בין אזורי, ולא בקצוות הקיצוניים של המשטח ג'ל agarose (איור 2C, 2E). התפלגות טמפרטורה לאורך מעבר הצבע היה כמעט ליניארי (Y = 0.9672 * X + 16.19, R² = 0.9961) (2E איו...

דיון

כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה, חשוב לנקוט צעדים כדי להשיג נאותה מספרים של הזחלים לביצוע הניסויים. אלה כוללים מראש האכלה של זבובים בקבוקונים המכילים הדבק שמרים במשך 2-3 d כדי לשפר את הנחת הביצה. הבקבוקונים צריך להיות מניחים במגש המכיל מים בקבוקונים בתוך שקית פלסטיק שקוף, אשר שומרת על הלחות של המזון ומקדם האכלה יעיל על ידי הזחלים בזמן המתיר חשיפה מחזורים בהירה-כהה נורמליים. עם זאת, הדבק שמרים לא צריך להיות כל כך רך הזבובים הופכים לכוד. מספר נקבות לכל מבחנה תלויה גנוטיפ. במקרה של w¹¹¹⁸, זה בדרך כלל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<מכשיר בדיקת שיפוע חזק>
PolyScience 9106, אמבט במחזור מקורר/מחומם 6 ליטר	תומס סיינטיפיק	9106	דגם זה הופסק. דגמים חלופיים מעודכנים כוללים: 1186R00 ו-1197U04 עבור 120 וולט, 60 הרץ, או 1184L08 ו-1197U04 עבור 240 וולט, 50 הרץ.
לוחית בדיקת אלומיניום (לשיפוע חד כיווני)			גודל חיצוני: 14 x 10.1 x 0.9 ס"מ, גודל פנימי: 12.9 x 8.7 x 0.8 ס"מ, אנודייז שחור.
לוח אלומיניום (לשיפוע דו-כיווני)			25 x 22 x 0.2 ס"מ, אנודייז שחור.
בלוק			גודל חיצוני: 25.5 x 5 x 1.4 ס"מ, פרמטרים של תעלות פנימיות מוצגים באיור 1D.
מחבר לבלוקים וצינורות אלומיניום	McMaster-Carr	91355K82
Tygon צינורות סיליקון סניטריים	Tygon	57296	1/4 אינץ' ID x 3/8 אינץ' OD x 1/16 אינץ' קיר
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>פריטים ו ריאגנטים לבדיקה
עלי	ארה"ב מדעי	17361	עלי לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל
מדחום	Fluke	51II
צמד תרמי	Fluke	K סוג
מכסה מיקרופלייט אוניברסלי	קורנינג	6980A77
צלחת 35 מ"מ	קורנינג	9380D40
סרט תיוג (לשיפוע דו-כיווני)	Fisher Scientific	15-951	סרט תיוג Fisherbrand 2 אינץ' x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	הכן תמיסה של 1%
סוכרוז	סיגמא	S0389-5KG	הכן תמיסה של 18% ממש לפני תחילת הבדיקה
מברשת צבע	Fisher Scientific	11860
צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל	דנוויל	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 מ"ל בקבוק עגול רחב פה	פיירקס	1395-500
מסננת תאים (נקבוביות 300 מ"מ	PluriSelect	43-50300	פריט אופציונלי לשטיפת זחלים
קופסת קרטון (מגש בקבוקון)	Genesee Scientific	FS32-124
שם	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila food
מים מזוקקים			22,400 מ"ל
קמח תירס, צהוב (רשת עדינה במיוחד, להקה) 20 ק"ג	LabScientific Inc.	NC0535320	1,609 גרם
שמרי בירה 100 ק"ג	MP ביומדיקל	ICN90331280	379 גרם
NutriSoy® קמח סויה (10 ק"ג/יחידה)	Genesee Scientific	62-115	221 גרם
Drosophila אגר, סוג II (5 ק"ג)	Genesee Scientific	66-103	190 גרם
		תירס קל קארו	1,700 מ"ל
מתיל 4-הידרוקסיבנזואט (מושהה באתנול 200 הוכחה)	סיגמא אולדריץ'	H5501-5KG	72 גרם/240 מ"ל
טוהר חומצה פרופיונית. p.a.,>99.5% (GC)	סיגמא אולדריץ'	81910-1 ליטר	108 מ"ל
חומצה זרחתית  מגיב ACS, ≥ 85 משקל % ב-H2	O סיגמא אולדריץ'	438081-500 מ"ל	8.5 מ"ל