כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בעלי חיים רבים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מסוגלים מפלה דקה ההבדלים בטמפרטורה הסביבה, המאפשרת להם לחפש את נוף תרמי המועדפת שלהם. כדי להגדיר את העדפות טמפרטורה של הזחלים מעל טווח מוגדר ליניארי, פיתחנו וזמינותו של שימוש הדרגתי בטמפרטורה. כדי ליצור מעבר הדרגתי חד כיווני, שני רחובות אלומיניום מחובר אמבטיות מים עצמאית, שכל אחד מהם שולט הטמפרטורה של בלוקים בודדים. שני רחובות להגדיר את הגבולות העליון והתחתון של מעבר הצבע. מעבר הצבע החום היא הוקמה על ידי הצבת צלחת אלומיניום מצופה agarose מעל שני רחובות שבשליטת מים כך הצלחת משתרע על המרחק ביניהם. הקצוות של צלחת אלומיניום המוגדר על אבני מים מגדיר את טמפרטורת מינימום ומקסימום, ויוצרים האזורים שביניהם שני רחובות הדרגתי טמפרטורה לינארי. הדרגתיות וזמינותו שניתן להחיל על רימות בגילאים שונים, ניתן להשתמש כדי לזהות מוטנטים כי התערוכה הפנוטיפים, כגון אלה בעלי מוטציות המשפיעות על גנים קידוד TRP ערוצים ו opsins, אשר נדרשים עבור טמפרטורה אפליה.
מבוא
Thermotaxis הוא מועסק על ידי חיות ניידים לבחירת סביבה עם מצוינות והומלץ תנאים1,2,3. אם האקלים בצורה מוגזמת חם או קר, התנהגות זו חיונית להישרדותו. בנוסף, בעלי חיים רבים רגישים מאוד קטן הבדלי טמפרטורה בטווח נוח ונחפש את הסביבה עם טמפרטורה אידיאלית. זה חשיבות מיוחדת עבור אורגניזמים poikilothermic כמו זבובי פירות, אשר equilibrate טמפרטורת גופם עם הסביבה. מבחני לעקוב אחר thermotaxis הזחל סייעו בזיהוי, ולהבהיר את התפקידים של חיישנים מולקולריים כגון דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים (TRP) ערוצים4,5,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ציוד ייצור, וההספק מכשירי מבחני הדרגה
- לפברק את הצלחות assay אלומיניום עבור וזמינותו מעבר חד כיווני.
- לקצץ, לטחון כל צלחת assay אלומיניום (איור 1 א'). חתיכה אחת של אלומיניום באמצעות חבל מאד, מסור, חדים אנכי מיל בעל הממדים הבאים: הגודל החיצוני הוא 140 x 100 x 9 מ מ, הגודל הפנימי הוא 130 x 90 x 8 מ מ (איור 1B). אילגון (אנודייז) הפנימי של כל צלחת assay בצבע שחור כדי שיהיה קל יותר לדמיין את הזחלים, מונע חלודה.
הערה: ייצור של הלוחות assay אלומיניום למעבר הצבע חד כיווני נעשית על ידי חנות מכונות. Anodization מתבצע על ידי ספק מסחרי. - סמן חישוקים העליון והתחתון של כל צלחת assay עם מטוס ....
- לקצץ, לטחון כל צלחת assay אלומיניום (איור 1 א'). חתיכה אחת של אלומיניום באמצעות חבל מאד, מסור, חדים אנכי מיל בעל הממדים הבאים: הגודל החיצוני הוא 140 x 100 x 9 מ מ, הגודל הפנימי הוא 130 x 90 x 8 מ מ (איור 1B). אילגון (אנודייז) הפנימי של כל צלחת assay בצבע שחור כדי שיהיה קל יותר לדמיין את הזחלים, מונע חלודה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
להקים 18 ° C - 28 מעלות צלזיוס חד כיווני ההדרגתי, נוכל להגדיר הטמפרטורות של שתי אמבטיות מים 16.8 ° C ו- 31 מעלות צלזיוס. אנו משיגים את הטמפרטורות ב 13 נקודות על ידי מדידת הטמפרטורה ב 26 תנוחות בתוך החלק העליון והחלק התחתון של כל האזורים 6, קווי הגבול בין אזורי, ולא בקצוות הקיצוניים של המשטח ג'ל agarose (איור 2C, 2E). התפלגות טמפרטורה לאורך מעבר הצבע היה כמעט ליניארי (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (2E איו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה, חשוב לנקוט צעדים כדי להשיג נאותה מספרים של הזחלים לביצוע הניסויים. אלה כוללים מראש האכלה של זבובים בקבוקונים המכילים הדבק שמרים במשך 2-3 d כדי לשפר את הנחת הביצה. הבקבוקונים צריך להיות מניחים במגש המכיל מים בקבוקונים בתוך שקית פלסטיק שקוף, אשר שומרת על הלחות של המזון ומקדם האכלה יעיל על ידי הזחלים בזמן המתיר חשיפה מחזורים בהירה-כהה נורמליים. עם זאת, הדבק שמרים לא צריך להיות כל כך רך הזבובים הופכים לכוד. מספר נקבות לכל מבחנה תלויה גנוטיפ. במקרה של w1118, זה בדרך כלל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
C.M. נתמך על ידי מימון NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278), של NIAID (1DP1AI124453).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <מכשיר בדיקת שיפוע חזק> | |||
| PolyScience 9106, אמבט במחזור מקורר/מחומם 6 ליטר | תומס סיינטיפיק | 9106 | דגם זה הופסק. דגמים חלופיים מעודכנים כוללים: 1186R00 ו-1197U04 עבור 120 וולט, 60 הרץ, או 1184L08 ו-1197U04 עבור 240 וולט, 50 הרץ. |
| לוחית בדיקת אלומיניום (לשיפוע חד כיווני) | גודל חיצוני: 14 x 10.1 x 0.9 ס"מ, גודל פנימי: 12.9 x 8.7 x 0.8 ס"מ, אנודייז שחור. | ||
| לוח אלומיניום (לשיפוע דו-כיווני) | 25 x 22 x 0.2 ס"מ, אנודייז שחור. | ||
| בלוק | גודל חיצוני: 25.5 x 5 x 1.4 ס"מ, פרמטרים של תעלות פנימיות מוצגים באיור 1D. | ||
| מחבר לבלוקים וצינורות אלומיניום | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon צינורות סיליקון סניטריים | Tygon | 57296 | 1/4 אינץ' ID x 3/8 אינץ' OD x 1/16 אינץ' קיר |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>פריטים ו ריאגנטים לבדיקה | |||
| עלי | ארה"ב מדעי | 17361 | עלי לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל |
| מדחום | Fluke | 51II | |
| צמד תרמי | Fluke | K סוג | |
| מכסה מיקרופלייט אוניברסלי | קורנינג | 6980A77 | |
| צלחת 35 מ"מ | קורנינג | 9380D40 | |
| סרט תיוג (לשיפוע דו-כיווני) | Fisher Scientific | 15-951 | סרט תיוג Fisherbrand 2 אינץ' x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | הכן תמיסה של 1% |
| סוכרוז | סיגמא | S0389-5KG | הכן תמיסה של 18% ממש לפני תחילת הבדיקה |
| מברשת צבע | Fisher Scientific | 11860 | |
| צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל | דנוויל | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 מ"ל בקבוק עגול רחב פה | פיירקס | 1395-500 | |
| מסננת תאים (נקבוביות 300 מ"מ | PluriSelect | 43-50300 | פריט אופציונלי לשטיפת זחלים |
| קופסת קרטון (מגש בקבוקון) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| שם | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| מים מזוקקים | 22,400 מ"ל | ||
| קמח תירס, צהוב (רשת עדינה במיוחד, להקה) 20 ק"ג | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 גרם |
| שמרי בירה 100 ק"ג | MP ביומדיקל | ICN90331280 | 379 גרם |
| NutriSoy® קמח סויה (10 ק"ג/יחידה) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 גרם |
| Drosophila אגר, סוג II (5 ק"ג) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 גרם |
| תירס קל קארו | 1,700 מ"ל | ||
| מתיל 4-הידרוקסיבנזואט (מושהה באתנול 200 הוכחה) | סיגמא אולדריץ' | H5501-5KG | 72 גרם/240 מ"ל |
| טוהר חומצה פרופיונית. p.a.,>99.5% (GC) | סיגמא אולדריץ' | 81910-1 ליטר | 108 מ"ל |
| חומצה זרחתית מגיב ACS, ≥ 85 משקל % ב-H2 | O סיגמא אולדריץ' | 438081-500 מ"ל | 8.5 מ"ל |
מקורות
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
