Method Article

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית תרם תרומות גדול בניתוח במנגנונים של תהליכים ביולוגיים מורכבים ברמת מולקולה בודדת. מולקולה בודדת מבחני ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א, ישנם שני גורמים חשובים עבור שיקול: המצע DNA עם אורך מספיק עבור תיוג חלבון גשש פלורסנט מתאימים ופיקוח קל. 48.5 kb λ DNA הוא מועמד טוב המצע הדנ א. נקודות קוונטיות (Qdots), כמחלקה של הגששים פלורסנט, מאפשרים התבוננות ותיק (דקות עד שעות) ו ייבוא תמונות באיכות גבוהה. בנייר זה, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א ברמת מולקולה בודדת, הכוללת הכנת λ ששונה site-specifically DNA, תיוג חלבון המטרה עם מצופים streptavidin Qdots. עבור הוכחת הרעיון, נוכל לבחור אורק (זיהוי מקור מורכבים) בניצני שמרים כמו חלבון עניין והמחש ביחסיו עם ארס (רצף באופן עצמאי שכפול) באמצעות TIRFM. לעומת אחרים הגששים פלורסנט, Qdots יש יתרונות ברורים במחקרים מולקולה בודדת בשל עמידותו גבוהה נגד photobleaching, אך ראוי לציין כי מאפיין זה מגביל את היישום שלה במבחני כמותית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות בין חלבונים ודנ א חיוניים רבים תהליכים ביולוגיים מורכבים, כגון שכפול ה-DNA, DNA לתקן שעתוק. למרות גישות קונבנציונליות יש לשפוך אור על המאפיינים של תהליכים אלה, מנגנונים מרכזיים רבים עדיין אינם ברורים. לאחרונה, עם טכניקות מולקולה בודדת המתפתחת, חלקם של המנגנונים היו כשהיא ממוענת1,2,3.

היישום של מולקולה בודדת פלורסצנטיות מיקרוסקופ על להמחיש בעיקר אינטראקציות חלבון-DNA בזמן אמת תלויה ההתפתחות של זיהוי קרינה פלואורסצנטית וזונדים פלורסנט. עבור מחקר מולקולה בודדת, חשוב לה תווית החלבון עניין גשש פלורסנט מתאים מאחר ומערכות גילוי פלורסצנטיות הם ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת המצע DNA λ-ARS317

  1. ה-DNA המצע בנייה ואריזה
    1. לעכל λ יליד הדנ א באמצעות Xhoאני האנזים; להגביר את קטע DNA 543 בן שלוש bp כיוון ARS317 של ה-DNA גנומי של ניצני שמרים באמצעות תחל המכיל 20 bp הומולוגי רצף של במעלה הזרם, במורד הזרם של Xhoאני האנזים באתר למדא הדנ א. להוסיף 100 ננוגרם של Xhoעיכלתי λ DNA ו-10 נג ה-DNA קטע כדי 10 µL של מערכת התגובה רקומבינציה הומולוגית, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. כדי לארוז את ה-DNA λ רקומבינציה, להוסיף 25 µL של למדא תמציות אריזה לתוך המוצר רקומבינציה, דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר מכן, להוסיף µL 25 נוספים של למדא תמציות אריזה לתוך הצינור התגובה. לה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot אורק את ארס, ואנחנו נבנה לראשונה את המצע DNA λ-ARS317. קטע DNA המכיל ARS317 היה משולב לתוך Xhoאני אתר (33.5 kb) של ה-DNA λ מקורי על-ידי רקומבינציה הומולוגית (איור 1 א'). המוצר רקומבינציה נארזה באמצעות תמציות ותרבותית החלקיקים phage הארוז היו על צלחות ליברות (איור 1B). הפלקיו phage חיובי הוקרן על ידי ה-PCR ומאושר על-ידי קביעת רצף (איור 1C). Λ-A.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את האינטראקציה בין החלבון התווית על-ידי Qdot ה-DNA λ site-specifically ששונתה באמצעות TIRFM בתא-זרימה. הצעדים הנדרשים כוללים שינוי בייעודי לאתר של DNA המצע, דנ א biotinylation, coverslip ניקוי functionalization, זרימה-תא הכנה ואני הדמיה מולקולה בודדת. ישנן שתי נקודות מפתח יש לציין. ראשית, כל הצעדים הכרוכים עם ה-DNA λ צריך להיות מניפולציות בעדינות כדי להקטין נזק אפשרי, למשל, הימנעות ערבוב על-ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. שנית, חשוב מאוד להבטיח coverslip יהיה נקי מספיק. כדי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ד ר חסן Yardimci, Dr.Sevim Yardimci של פרנסיס קריק המכון סוג לעזור בניסויים מולקולה בודדת, ד ר דניאל Duzdevich מהמעבדה של ד ר אריק ג גרין של אוניברסיטת קולומביה, ד ר שמש Yujie באוניברסיטת פקין, ד ר צ'ן Chunlai של באוניברסיטת צינג לדיון שימושי. מחקר זה נתמך על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין 31371264, 31401059, צוות החדשנות הבינתחומי CAS ואחווה את ניוטון מתקדם (NA140085) של החברה המלכותית.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNAניו אינגלנד BiolabsN3011חנות 25 μ L aliquots ב-20 ºC.
XhoI אנזיםThermo Fisher ScientificFD0694
ערכת שיבוט היתוך מהירBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
תמציות אריזה		EpicentreMP5110זן חיידקים LE392MP
כלול בחבילה זו.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092כל מותג מקובל.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical WorksN/Aכל מותג מקובל.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical WorksN/Aכל מותג מקובל.
NZ-אמיןאמרסקוJ853-250G
חומצות קסמינוסיגמא-אולדריץ'22090-500 גרם
PEG8000 BeyotimeST483
מנגנון ערבוב מגנטיIKAKMO2 בסיסי
15 מ"ל צינור אפנדורףEppendorf3012215115 מ"ל, סטרילי, בתפזורת, 500 יחידות
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
פריימרים ביוטינייםתרמו פישר סיינטיפיקN/A
T4 DNA ליגאז, T4 DNA ליגאז, מאגר תגובה (10x)ניו אינגלנד BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
אתנולסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10009259
אשלגן הידרוקסיד (KOH)סיגמא-אולדריץ'306568-100G
אצטוןתרמו פישר מדעיA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80120891חומצה גופרתית
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001121830% מי חמצן
מתנולסיגמא-אולדריץ322415-2L
חומצה אצטיתסיגמא-אולדריץ'V900798
APTESסיגמא-אולדריץ'A3648
mPEG
(מתוקסי-פוליאתילן גליקול)		ליסאןmPEG-SVA-5000
ביוטין-PEG
(ביוטין-פוליאתילן גליקול)		ליסאןביוטין-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
מייבש ואקוםסניף טיאנג'ין מיליארד ריאות ציוד ניסיוני ושות', בע"מIPC250-1
אוטם ואקוםMAGIC SEALWP300
סופר זכוכית עם קצה יהלוםELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
שקופיות זכוכיתמפרש מותג7101
צינורות כניסהSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2קוטר פנימי 0.38 מ"מ; קוטר חיצוני 1.09 מ"מ.
צינורות יציאהSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4קוטר פנימי 0.76 מ"מ; קוטר חיצוני 1.22 מ"מ.
סרט דו צדדיסיגמא-אולדריץ'GBL620001-1EA
אפוקסיLEAFTOP9005חמש דקות אפוקסי
סטרפטווידיןסיגמא-אולדריץ'S4762
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסIX71
עירוי/נסיגה
משאבה ניתנת לתכנות		מכשיר הרווארד70-4504
532 ננומטר לייזרקוהרנטיSapphire-532-50
640 ננומטר לייזרקוהרנטיOBIS-640-100
EMCCD מצלמהAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
פיצול אופטיקה		Hamamatsu פוטוניקה K.K.A12801-01
מערכת תאורה TIRFאולימפוסIX2-RFAEVA2
60 פעמים; מטרת TIRFאולימפוסAPON60XOTIRF
לייזר מרובע קצה dichroic
מפצל קרן		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
מסנן פס פס מרובע פסSemrockFF01-446/510/
581/703-25
מפצל קרן דיכרואיSemrockFF649-Di01-25x36
מסנן פליטהטכנולוגיית Chroma CorpET585/65m
מסנן פליטהChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck פלואורסצנטי, שקופית בדיקת מיקרוסקופ #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX כתוםתרמו פישר סיינטיפיקS11368
Qdot705 Streptavidin מצומדתרמו פישר חנות Q10163MP מדעית ב-4 & ג, אין להקפיא.
ATPAmresco0220-25Gהכן תמיסת ATP של 200 מ"מ, באמצעות ddH2O, התאם את ה-pH ל-7.0 ואחסן 10 μ L aliquots ב-20 ºC.
DTTAmrescoM109-5Gהכן תמיסה של 1 M באמצעות ddH2O, ואחסן 10 μ l aliquots ב-20 ºC.
'

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

Related Articles