מזרק-להזרקה רשת אלקטרוניקה עבור יציב אלקטרופיזיולוגיה מכרסמים כרונית

סיכום

רשת האלקטרוניקה הגששים להשתלב בצורה חלקה ולספק רמה יציבה, לטווח ארוך, חד-נוירון הקלטה בתוך המוח. פרוטוקול זה משתמש רשת האלקטרוניקה לניסויים ויוו , מעורבים הזיוף של רשת האלקטרוניקה, loading מחטים הזרקת stereotaxic, ממשק קלט/פלט, הקלטה ניסויים, היסטולוגיה של רקמות המכיל רשת הגששים.

תקציר

מוח מושתלת אלקטרופיזיולוגיה הגששים הם כלי רב ערך במדעי המוח עקב יכולתם לפעילות עצבית רשומה עם רזולוציה גבוהה ייתכן מאזורים במוח רדודים ועמוקים. יש כבר הפריע השימוש שלהם, אולם, מאת מכני ומבניים אי-התאמות בין המחקרים וכל במוח רקמות זה נפוץ להוביל micromotion, gliosis עם וכתוצאה מכך אות יציבות בניסויים הקלטה כרונית. לעומת זאת, בעקבות ההשתלה של רשת גמיש במיוחד אלקטרוניקה באמצעות הזרקת מזרק, רשת השינוי רגשים טופס ממשק חלקה, נטולת gliosis עם הרקמה שמסביב המוח המאפשרת מעקב יציב של נוירונים בודדים לפחות שנה ציר הזמן. זה פרטי פרוטוקול השלבים המפתח בניסוי הקלטה עצבית עכבר אופייני באמצעות מזרק-להזרקה רשת האלקטרוניקה, לרבות הזיוף של רשת האלקטרוניקה בתהליך רגיל מבוסס פוטוליתוגרפיה אפשרי באוניברסיטאות רבות, טעינה רשת האלקטרוניקה מחטים נימי רגיל, הזרקת stereotaxic vivo בתוך, חיבור של רשת השינוי קלט/פלט כדי מכשור סטנדרטיים ממשקי, מרוסן או בחופשיות הזזת מאולפן ההקלטות, ושל היסטולוגית חלוקתה של המוח רקמות המכיל רשת האלקטרוניקה. נציג הקלטות עצבית ונתונים היסטולוגיה מוצגים. החוקרים מוכר עם פרוטוקול זה יהיה את הידע הדרוש כדי לשלב רשת האלקטרוניקה הניסויים שלהם ולנצל ההזדמנויות הייחודית המוענקת על ידי ממשק עצבי יציב לטווח ארוך, כגון מחקרים ההזדקנות תהליכי התפתחות המוח, בפתוגנזה של מחלת מוח.

מבוא

ההתפתחות בכלים מסוגל מיפוי המוח עם רזולוציה יחיד-נוירון הוא בעלות חשיבות מרכזית neuroscience ונוירולוגיה. טכנולוגיות לא פולשנית ללימודי עצביים כגון אלקטרואנצפלוגרם (EEG), מגנטואנצפלוגרפיה (מג), הדמיית תהודה מגנטית תפקודית (fMRI) הוכיחו יקר עבור מתאם פעילות מוחית עם התנהגות בני אדם^{1, 2}, אבל הם חסרי ייתכן ברזולוציה הדרושה עבור הלומדים את המבנה ואת הדינמיקה של רשתות עצביות מיקרומטר היסוד שלהם, אלפית קשקשים, בהתאמה^3,4. רגשים מסוימים electrocorticography (ECoG) ואת שיטות הדמיה אופטית באמצעות צבעי מתח רגיש הצליחו הקלטה יחיד-יחידה spiking פעילות ויוו^5,6, אבל הם בדרך כלל יעיל רק ליד משטח המוח, הגבלת תחולת מחקרים של אזורים במוח רדוד. לעומת זאת, מושתלת הגששים חשמל יכול למדוד יחיד-נוירון אלקטרופיזיולוגיה ב נע בחופשיות חיות כמעט בכל אזור המוח ללא צורך תיוג פלורסנט, הפיכתם הכרחית עבור מערכות ברמת neuroscience, במיוחד כמו מיקרו-מלאכותית טכניקות של תעשיית מוליך למחצה דחפו ערוץ סופרת לתוך מאות ואלפי^3,7,8,9. בזכות יכולות אלו, מושתלת הגששים חשמליים הפכו תרומות חשובות רבות במדעי המוח, נוירולוגיה, כולל לימודי יסוד בעיבוד ב מערכת הראייה¹⁰, הטיפול של נוירולוגית מידע הפרעות כגון מחלת פרקינסון¹¹וההדגמה של המוח-ממשקי (BMIs) עבור תותבות מתקדם^12,13.

ובכל זאת, אי יציבות לטווח ארוך בא לידי ביטוי בכינויו הפחתת ספייק amplitudes ואת אותות לא יציב על צירי זמן של שבועות עד חודשים^14,15 הגביל את הישימות של הגששים מושתלת בחקר יחסית לטווח קצר תופעות, להשאיר שאלות כגון הזדקנות המוח ופיתוח בעיקר לא נענו. מגבלות יציבות לטווח ארוך הם תוצאה של חוסר התאמה בין הגששים קונבנציונלי לבין רקמת המוח, מכניקה, ובגודל טופולוגיה^{14,15,16,17,18}. מבחינת גודל, הסינפסות עצביים somata עומדים כ עשרות ננומטר ועד עשרות מיקרון קוטר¹⁹, בהתאמה, הגששים מסורתי לעיתים משמעותי יותר, במקרה של מערכים microelectrode סיליקון > 4 פעמים הגודל של נוירון בודד התא^7,הגוף⁸. הגודל הגדול יחסית של רגשים אלו עלולות לשבש את המבנה הטבעי ואת קישוריות של רקמה עצבית צפופה, ובכך לתרום התגובה החיסונית כרונית, perturbing את המעגלים העצביים נחקר. מבחינת תכונות מכניות, הגששים המסורתית הן באופן דרסטי נוקשה מאשר הרקמה העצבית רך מאוד שבו הם מושתלים; אפילו "גמיש" הגששים זני 10 – 20 מיקרומטר עבה גיליונות פוליאימיד הם לפחות 100,000 פעמים נוקשה מאשר^20,של רקמת המוח²¹. חוסר ההתאמה הזה במצב כפיפה נוקשות גורמת תנועה הטיה יחסית בין רקמת החללית ואת המוח, המוביל אל יחיד לא אמין-יחידת מעקב במהלך הקלטות המורחבת וגרימת gliosis כרונית באתר ההשתלה. לבסוף, מבנה טופולוגי של הגששים המוח קונבנציונלי אינו כולל בהכרח נפח מוצק של הרקמה. אי-התאמה כזו של טופולוגיה משבש הקישוריות של המעגלים העצביים, מונע את תלת-מימדי (3D) interpenetrated חלוקה טבעית של נוירונים, תאי גליה כלי דם בתוך רקמת המוח²²ו מעכבת תחבורה 3D של מולקולות איתות²³. יחד, חסרונות אלה של הגששים קונבנציונאלי עשו להם להשיג התאימות לטווח ארוך לחפש יישומים קליניים ומחקרים neuroscience האורך ברמת יחיד-נוירון.

כדי להתגבר על חסרונות אלה, חיפשנו טשטוש הקו בין מערכות עצביות ואלקטרוניקה באמצעות פיתוח פרדיגמה חדשה של הגששים עצבית "רקמות כמו" כינה רשת האלקטרוניקה^16,21,24. רשת האלקטרוניקה מטפל בבעיות תואמות לעיל בגודלם, מכניקה, טופולוגיה על-ידי שילוב תכונות מבניות (1) של ננומטר אותו כדי מיקרומטר גודל קנה מידה של רקמה עצבית, תכונות מכניות (2) דומים לאלה של רקמת המוח, ותלת מימד (3) טופולוגיה macroporous זה > 90% לפתוח מרחב, ובכך יכול להכיל interpenetration על ידי נוירונים דיפוזיה של מולקולות דרך הסביבה חוץ-תאית. רשת האלקטרוניקה רגשים יכול להיות בדיוק מועברת אזורים ספציפיים במוח באמצעות מזרק, מחט, גרימת נזק מינימלי אקוטי בזמן השתלת אפילו בתוך מוחי עמוק אזורים^21,25. עצביים וראשה אקסונים הוכחו ביוצא המבנה בדיקה אלקטרוניקה פתוחים תלת-ממדית בתוך שבועות שלאחר ההזרקה, ובכך יוצר ממשק חלקה, נטולת gliosis בין הקלטה אלקטרוניקה סביב רקמת המוח^{21 , 26 , 27}. תכונות ייחודיות אלה אפשרו רשת הגששים אלקטרוניקה stably לעקוב אחר פעילות עולה מן הנוירונים בודדים אותו על פני ציר הזמן לפחות בן²⁷. יתר על כן, הזיוף של האלקטרוניקה רשת המבוססת על פוטוליתוגרפיה (PL) מספקת מדרגיות גבוהה של מספר אלקטרודות אשר ניתן לשלב, עם ערוץ והפגינו נחשב עד 128 אלקטרודות לכל בדיקה באמצעות המסכה פשוט קשר לליטוגרפיה ²⁸ ועיצוב של plug-and-play קלט/פלט (i/O) המאפשר חיבור מהיר חשמל אלקטרוניקה היקפיים ללא ציוד מיוחד²⁹.

מגוון רחב של מחקרים עשויה להועיל שילוב רשת האלקטרוניקה מדידה פרוטוקולים. רוב הניסויים הקלטה intracortical יכול להפיק תועלת הליך של רשת האלקטרוניקה ההשתלה פולשנית באמצעות הזרקת מזרק, התגובה החיסונית מופחת באופן דרסטי בעקבות ההשתלה, ואת היכולת להשאיר רשת החשמליות רקמות במהלך היסטולוגיה עוקבות, immunostaining לניתוח מדויק של הסביבה הביולוגית סביב כל אתר הקלטה. הקלטה כרונית ניסויים בפרט תפיק ערך מתוך היכולת הייחודית של רשת האלקטרוניקה כדי לעקוב אחר מספר גדול של נוירונים בודדים במשך חודשים עד שנים. יכולת זו יוצרת הזדמנויות ללימודים עם רזולוציה יחיד-נוירון שהיו בעבר מעשית, כגון מחקרים ההזדקנות האורך של המעגלים העצביים, חקירות של המוח המתפתח, ושל חקירות בפתוגנזה של encephalopathies¹⁶.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים כל המפתח צעדים בניסוי הקלטה עצבית עכבר אופייני באמצעות מזרק-להזרקה רשת האלקטרוניקה (ראה איור 1). השלבים המתוארים לכלול הזיוף של רשת האלקטרוניקה אפשרי תהליך מבוסס-PL סטנדרטי באוניברסיטאות רבות, loading רשת האלקטרוניקה מחטים הזרקת stereotaxic של רשת האלקטרוניקה ויוו, החיבור של נימי סטנדרטי רשת שינוי של קלט/פלט מכשור סטנדרטיים ממשקי, מאולפן ההקלטות מאופק או נעה בחופשיות ולאחר חלוקתה היסטולוגית של רקמת המוח, המכיל רשת האלקטרוניקה. יש חוקרים באמצעות רשת האלקטרוניקה רק ללימודי היסטולוגיה שאינם מחייבים חשמל התממשקות והקלטה, ובמקרה הם יכולים לדלג על הצעדים הללו. לאחר להיכרות עצמם עם פרוטוקול זה, החוקרים צריך את כל הידע צורך להשתמש רשת האלקטרוניקה בניסויים שלהם.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות המבוצעות על נושאים בעלי חוליות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת הרווארד.

1. ייצור של רשת האלקטרוניקה

הערה: ההליך המתואר בסעיף זה מיועד לשימוש בתוך מתקן חדר נקי אוניברסיטת סטנדרטיים, כגון המרכז עבור ננו מערכות (CNS) באוניברסיטת הרווארד. המתקן הזה, כמו גם מתקנים דומים נגישים למשתמשים מחוץ ברחבי ארצות הברית, לדוגמה, כחלק של נבחרת ננוטכנולוגיה תשתית רשת (NNIN) הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF). במתקנים אלה, רבים של כלים, ציוד, חומרים המתואר בסעיף זה הינם מסופקים יחד עם גישה למתקן חדר נקי, לא מצריך רכישה נפרדת.

התראה: רבים מן הכימיקלים בשימוש פבריקציה נוספת של רשת האלקטרוניקה הם מסוכנים, לרבות מתנגד, CD-26, מסיר PG, סו-8 מפתחים ני תצריב פתרון. להתייעץ עם גליונות נתונים בטיחות (MSDS) של חומרים כימיקלים אלה לפני השימוש, ליישם ופעל אמצעי בטיחות המתאים בכל עת.

1. תרמית להתאדות 100 ננומטר של ני אל רקיק סי נקי.
   הערה: פרמטרים התצהיר טיפוסי הם הבסיס לחץ של 5 x 10^-7 T וקצב של 1 – 2 Å/s. שכבה דקה של ני משמש שכבה ההקרבה מאוחר יותר יתפרק לשחרר רשת האלקטרוניקה מ כשהפחד.
2. השתמש המסיכה הראשונה PL (מסכת PL-1) להגדרת התחתון passivating שכבה של רשת חשמל עם סו-8 photoresist שלילי (איור 2 א).
   הערה: PL היא טכניקה מיקרו-מלאכותית רגיל שבו האור האולטרה סגול (UV) היא האירה מסכה שנערך על מצע פוטוסנסיטיבית. אור גם גורם לא מסיס (מתנגד שלילי) או מסיסים (מתנגד חיובי) האזורים החשופים על המצע. המסכות שצוירו בתוכנת עיצוב (CAD) באמצעות מחשב, אז בדרך כלל הורה מיצרן. Aligner המסכה משמש כדי להתיישר מסכות על דפוסים קיימים על מצע וכדי לחשוף אותם לאור UV. ייצור של רשת האלקטרוניקה דורשת ארבע מסכות שונות (PL מסכת-1 דרך המסכה PL-4). עיצובים המסכה שלנו זמינים לפי בקשה או מאתר משאבים, meshelectronics.org.
   1. ספין-קואט SU-8 2000.5 photoresist שלילי על גבי כשהפחד ב- 4,000 סל ד עבור עובי SU-8 משוער 400 – 500 ננומטר.
   2. רכות אופים לחם הקודש על גזייה עבור 1 דקות ב- 65 ° C ואחריו 1 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס.
   3. טען את לחם הקודש aligner מסיכת לחשוף את סו-8 עם מסיכת PL-המקביל השכבה התחתונה רשת SU-8 1. לחשוף במינון i-line (גל nm 365) של mJ/ס מ 100².
   4. פוסט לאפות את לחם הקודש על גזייה עבור 1 דקות ב- 65 ° C ואחריו 1 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס.
   5. לטבול את פרוסות מגש של סו-8 מפתחים. בעדינות להתסיס את הפתרון למשך 2 דקות עד דפוס רשת של סו-8 פותחה באופן מלא. לשטוף מגש של אלכוהול איזופרופיל 1 דקות, מכה יבשה.
   6. קשה לאפות את לחם הקודש על גזייה ב 180 מעלות לשעה.
      הערה: SU-8 הוא בדרך כלל קשה אפוי בין 150 ° C ל- 250 מעלות צלזיוס בעקבות פיתוח. העוגות קשה anneals כל הסדקים שעלול להיווצר במהלך הפיתוח, crosslinks עוד יותר את סו-8 על מנת להבטיח יציבות מכנית. קשה אפיה ב 180 מעלות צלזיוס לשכבה התחתונה SU-8 ו- 190 ° C עבור החלק העליון שכבה SU-8 מניבה תוצאות טובות עבור רשת אלקטרוניקה.
3. המסיכה שימוש PL-2 להגדרת מתכת מהירים, רפידות קלט/פלט (איור 2B).
   1. ספין-מעיל LOR3A על גבי כשהפחד ב 4000 סל ד עבור עובי משוער 300 ננומטר.
      הערה: LOR3A הוא מבוסס-polydimethylglutarimide להתנגד באיזה מהירויות ומורידה במהלך ההליך metallization הבאים.
   2. אופים את לחם הקודש על גזייה ב 180 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
   3. ספין-מעיל S1805 photoresist חיובי ב- 4000 סל"ד עבור עובי משוער של 500 ננומטר.
   4. אופים את לחם הקודש על גזייה ב 115 ° C עבור 1 דקות.
   5. טען את לחם הקודש aligner מסיכה כדי לחשוף S1805 עם מסיכת PL-התואמים המתכת 2 חיבורי קלט/פלט רפידות. לחשוף במינון h-קו (405 ננומטר אורך גל) של mJ/ס מ 40².
   6. לטבול את פרוסות מגש של מפתחים photoresist CD-26. בעדינות להתסיס את הפתרון עבור 1 דקות עד המתכת חיבורי דפוס כבר מפותחת. לשטוף מגש של מים יונים (DI) 1 דקות, מכה יבשה.
   7. תרמית להתאדות 3 nm של Cr ואחריו 80 nm של Au.
      הערה: הבסיס הלחץ של לכל היותר 5 10x^-7 T וקצב התצהיר של Å 1/s בדרך כלל תשואה באיכות הטובה ביותר בסרט.
   8. לטבול את לחם הקודש לתוך גביע שטוח אקולוגי PG במשך כ-3 שעות עד המתכת מלא יש לערער, עוזב את המתכת רק ב interconnect הרצוי ואת אזורי לוח קלט/פלט של רשת האלקטרוניקה. לשטוף איזופרופיל אלכוהול ועוד מכה יבשה.
4. להשתמש מסכה PL-3 להגדרת Pt אלקטרודות (איור 2C).
   1. חזור על שלבים 1.3.1 דרך 1.3.4.
   2. לטעון כשהפחד לתוך aligner מסיכת לחשוף את S1805 עם מסיכת PL-המקביל האלקטרודות Pt 3. לחשוף במינון h שורה של mJ/ס מ 40².
   3. לטבול את פרוסות מגש של מפתחים photoresist CD-26. בעדינות להתסיס את הפתרון 1 דקות עד התבנית אלקטרודות Pt פותחה באופן מלא. לשטוף מגש של DI 1 דקות, מכה יבשה.
   4. השתמש המאייד קרן של אלקטרונים על ההפקדה 3 nm של Cr ואחריו 50 ננומטר של Pt.
      הערה: פרמטרים התצהיר טיפוסי הם בלחץ הבסיס של 5 x 10^-7 T ואת קצב של 2 Å / s.
   5. לטבול את לחם הקודש לתוך גביע שטוח אקולוגי PG במשך כ-3 שעות עד המתכת מלא יש לערער, עוזב Pt רק באתרים אלקטרודה הרצוי של רשת האלקטרוניקה. לשטוף איזופרופיל אלכוהול ועוד מכה יבשה.
5. השתמש PL מסכת-4 כדי להגדיר העליון passivating שכבה של רשת חשמל עם סו-8 photoresist שלילי (איור דו-ממדי).
   1. חזור על שלבים 1.2.1 דרך 1.2.5, מלבד חשיפת עם מסיכת PL-המקביל השכבה העליונה רשת passivating של סו-8 4.
   2. קשה לאפות את לחם הקודש על גזייה ב 190 ° C עבור 1 h.
      הערה: טמפרטורה זו הוא 10 ° C גבוהה יותר עבור אופים קשה של התחתון SU-8 (שלב 1.2.6). זו הטמפרטורה מוגבה מעט מוזרם מחדש התחתון SU-8, גורם לו להתמזג עם השכבה העליונה SU-8, ובכך יוצרים מבנה SU-8 יחיד, רציף.
6. רשת האלקטרוניקה הם עכשיו להשלים (2E איור , איור 3); שחרר אותם מן כשהפחד סי על ידי המסת השכבה ההקרבה ני.
   1. פנקו את וופל עם חמצן פלזמה 50 W עבור 1 דקות. זה מתחמצן השטח SU-8, שהופך אותו הידרופילית ומאפשר את רשת השינוי ברצון להיות מושעים בתמיסה המימית.
   2. בגביע, שטוח לשלב חומצת מימן כלורי הברזל ותחמוצת, DI ביחס נפח של 1:1:20, בהתאמה, כדי להפוך את פתרון של ני etchant.
   3. לטבול את לחם הקודש לתוך גביע שטוח הפתרון etchant ני כ-3 שעות עד רשת האלקטרוניקה לחלוטין שישוחררו כשהפחד סי.
   4. השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר את רשת השינוי שפורסמו אלקטרוניקה רגשים Ni etchant גביע 100 מ של די. העברה רשת האלקטרוניקה גביע טריים DI לפחות 3 פעמים כדי להבטיח שטיפה.
   5. להשתמש על פיפטה פסטר להעביר רשת האלקטרוניקה פתרון 70/30% אתנול/מים חיטוי ולאחר מכן השתמש על פיפטה להעביר רשת האלקטרוניקה במים סטריליים עבור שטיפה.
      הערה: לאחר עיקור, רשת האלקטרוניקה ניתן להעביר לפתרונות אחרים עבור functionalization. לדוגמה, כדי לקדם אדהזיה הסלולר, רשת האלקטרוניקה ניתנת להעברה של תמיסה מימית של פולי-D-ליזין (1 מ"ג/מ"ל) במשך 24 שעות ביממה.
   6. שימוש פיפטה פסטר להעביר רשת האלקטרוניקה רגשים כדי גביע 100 מ ל x 1 סטרילי פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) לפני הזרקת בתוך vivo.

2. טעינה של רשת האלקטרוניקה אל מחטים

1. המחזיק פיפטה כמו נרכש פתוח לזרום בשני קצותיו. חותם הסוף מול תופסן בורג מעגלית עם אפוקסי, כך שאין זליגת במהלך ההזרקה (איור 4A). תן את אפוקסי להקשיח לפני שתמשיך.
2. מכניס מחט נימי זכוכית בעל פיפטה. להדק את זה במקום באמצעות בורג הידוק מעגלית חרוט מכונת כביסה (איור 4B). 400 מיקרומטר הקוטר הפנימי (650 הקוטר החיצוני מיקרומטר) זכוכית נימי מחט שימש עבור פרוטוקול זה. חומרים המחט נימי אחרים (למשל. מתכת), קטרים עשוי לשמש אבל עשויים לדרוש שינויים בעיצוב של רשת אלקטרוניקה כדי להבטיח injectability.
   הערה: מחטים נימי ועד מיקרומטר 150 מ"מ 1.17 הקוטר הפנימי (250 מיקרומטר עם הקוטר החיצוני 1.5 מ מ) שימשו במעבדה שלנו. הזרקת באמצעות מחטים קטנות ניתן לפתח שהופך את זווית החיתוך בין רוחביים האורך והרוחב SU-8 רשת שינוי הרכיבים חריפה יותר, הפחתת הרוחב של האלמנטים רשת SU-8, באמצעות SU-8 דק ולאחר שימוש של מזו (כלומר., תא יחידה גדולה יותר) רשת שינוי מבנה. Photomasks עבור רשתות המיועדות קטן נימי מחטים הינם זמינים לפי בקשה, או מאתר משאבים, meshelectronics.org. מחטים נימי זכוכית עם הקוטר הפנימי של 400 מיקרומטר, הקוטר החיצוני של מיקרומטר 550 הינם גם זמינים מסחרית. אלה לצמצם את הנזק רקמות חריפה הנגרמת על ידי הזרקה תוך שמירה על תאימות עם רשתות שינוי המחייב הקוטר הפנימי של 400-מיקרומטר, אבל הם לא היו רגילים עבור המחקרים שתוארו כאן.
3. צרף מזרק 1 מ"ל שקע בצד של בעל פיפטה באמצעות 2 – 4 ס מ אורך צינורות קפילר.
4. הכנס את המחט נימי זכוכית כשהספל 100-מל ל- PBS המכיל רשת האלקטרוניקה. מקם את הסוף של המחט ליד הידיות קלט/פלט של רשת האלקטרוניקה בדיקה ומשכו באופן ידני את המזרק למשוך רשת האלקטרוניקה החללית לתוך המחט (איור 5 , 1 וידאו משלימים).
   הערה: רפידות קלט/פלט, גזע חברור אזור, אזור התקן רשת הניתנות לזיהוי בקלות על ידי בעין כאשר הגששים אלקטרוניקה רשת מושעים בפתרון. דבר זה מאפשר טעינה ברורה וחד משמעית של רשת האלקטרוניקה אל המחטים לכיוון הנכון.
5. הדחיפה/משיכה הבוכנה מזרק בזמן עדיין שקוע בתוך תמיסת מלח כדי לכוונן את המיקום של רשת האלקטרוניקה בתוך המחט.
   הערה: מיקום אידיאלי הוא עם האזור התקן רשת גמיש במיוחד כמו קרוב לסוף של המחט ככל האפשר. תצורה זו ממזערת את עוצמת הקול של נוזל זה יוזרקו המוח תוך המבטיח שאזור ההתקן מוזרק קודם את רפידות קלט/פלט אחרונה.
6. ניתוק בקפידה לאורך צינור קפילרי מהשפך בצד של המחזיק פיפטה. ניתוק זה לאט כדי להימנע מיצירת כוח יניקה שעלולים לשנות את המיקום של רשת האלקטרוניקה בתוך המחט.

3. stereotaxic הזרקה של רשת האלקטרוניקה לתוך מוח העכבר בשידור חי

הערה: עכברים היו ומורדמת באמצעות הזרקת בקרום הבטן עם תערובת של 75 מ"ג/ק"ג dexdomitor קטמין ו 1 מ"ג/ק"ג. מידת הרדמה אומתה באמצעות שיטת קמצוץ הבוהן לפני תחילת הניתוח. טמפרטורת הגוף נשמר על ידי הנחת העכבר על שמיכה homeothermic 37 ° C תחת הרדמה. הטכניקה הנכונה סטרילי בוצע עבור הניתוח, כולל אך לא מוגבל autoclaving כל מכשירי ניתוח מתכת עבור 1 שעה לפני השימוש, באמצעות כפפות מעוקר, שימוש מעקר חרוז חם לאורך כל הניתוח, שמירה על שדה סטרילי סביב האתר כירורגית של החיטוי של כלי פלסטיק עם 70% אתנול, הקרקפת depilated העור היה מוכן עם iodophor לפני החיתוך. ניתוחים הישרדות, לאחר סיום הניתוח, משחה antiobiotic היה מוחל מסביב לפצע, העכבר הוחזרה לכלוב מצויד ב- C ° 37 חימום משטח. עכברים היו ללא השגחה עד שהם היו חזרה להכרה מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. העכברים ניתנו הבופרנורפין שיכוך כאבים באמצעות הזרקת בקרום הבטן במינון של 0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף כל 12 שעות עד 72 שעות לאחר הניתוח. עכברים הם בודדו אותנו מהמתרחש חיות אחרות לאחר ניתוח. עכברים היו מורדמים באמצעות הזרקת בקרום הבטן או פנטוברביטל במינון של 270 מ"ג/ק"ג משקל גוף או באמצעות transcardial זלוף (ראה שלב 6.1). החוקרים מוזמנים לעיין גייגר, et al. . ³⁰, קירבי, et al. ³¹ולאחר גייג ', ואח. ³² פרטים על הניתוח stereotaxic מכרסמים.

1. עזים ומתנגד העכבר ולתקן את זה בתוך מסגרת stereotaxic.
2. חומר סיכה עינית חלות על העיניים של העכבר כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
3. השתמש מקדחת שיניים ומסגרת stereotaxic לפתיחת גולגולת בקואורדינטות הרצוי על הגולגולת. פתיחת גולגולת השני מן האתר הזרקת עבור הכניסה של בורג ההארקה פלדת או חוט.
4. לתקן את מצע clamping בגולגולת עם מלט שיניים. חותכים פער כ 1 מ מ בהמצע כדי לשפר את המהימנות של השלב מתקפלים בהמשך ההליך.
   הערה: כבל גמיש שטוח (מועדון כדורגל) חותכים "L" צורה עובד טוב (איור 7 א), למרות חומרים רבים יעבוד כל עוד הם של עובי הנכון עבור 32-הערוץ אפס מחבר כוח (זיף) ההכנסה (שתוכנן עבור כבלים עבים 0.18 ± 0.05 מ"מ).
5. הר בעל פיפטה עם המזרק המכיל רשת האלקטרוניקה אל מסגרת stereotaxic באמצעות מלחציים סוף ישרי-זווית (4C איור , איור 6A).
6. לחבר לשקע בצד של בעל פיפטה מהודקת של מזרק משאבה (איור 6D) באמצעות מזרק 5 מ ל כ 0.5-1 מ' אורך צינורות קפילר.
   הערה: ודא ישנם אין בועות לאורך צינור קפילרי לפני חיבורו עם בעלי פיפטה. בועות יכולים להפריע את זרימת במהלך ההזרקה ולמנוע משלוח חלקה, מבוקרת של רשת האלקטרוניקה.
7. השתמש המסגרת stereotaxic כדי למקם את קצה המחט-המיקום ההתחלתי הרצוי בתוך המוח.
   הערה: הגששים אלקטרוניקה רשת המשמש כאן נועדו עם הקלטה אלקטרודות על-פני באורך של ca. 2 מ מ, עם האלקטרודה הראשון ממוקם ca. 0.5 מ מ מהקצה ההתחלתי של רשת האלקטרוניקה (הקצה השמאלי ביותר ב איור 3A). מסיבה זו, יש לבחור את הקואורדינטות stereotaxic כך המיקום ההתחלתי הוא עמוק יותר מאשר האזור במוח של ריבית של 0.5 מ מ. הפיזור ואת מיקום האלקטרודות הקלטה בתוך רשת אלקטרוניקה ניתן לבחור באופן חופשי במהלך תהליך העיצוב המסכה ואת צריכה להיות מסומנת כך האלקטרודות הקלטה span region(s) את המוח של עניין כפי מוזרקים לאורך שלהם stereotaxic מסלול.
8. מקם את המצלמה (איור 6B) כדי להציג את החלק העליון של המכשיר אלקטרוניקה רשת בתוך המחט זכוכית. תוכנות מסוימות מאפשר למשתמש לצייר קו על המסך כדי לסמן את המיקום המקורי של רשת האלקטרוניקה.
9. ליזום את הזרימה על-ידי הגדרת את משאבת מזרק מהירות נמוכה והקשה התחלה. 10 מ ל/h הוא קצב זרימה המוצא טיפוסיים 400 מיקרומטר הקוטר הפנימי נימי מחט. אט-אט להגדיל את קצב הזרימה אם רשת האלקטרוניקה החללית לא זזה בתוך המחט.
   הערה: חשוב למזער את כמות הנוזלים מוזרק לתוך המוח כמו זו עלולה לגרום נזק רקמות המקיפים ההזרקה. התוצאות הטובות ביותר מושגות עם כמויות הזרקת µL פחות מ 25 לכל 1 מ מ אורך רשת מוזרק. ערכים אידיאליים הם פחות מחצי אמצעי אחסון זה; במעבדה שלנו, אנחנו בדרך כלל להזריק µL 10 – 50 לכל אורך רשת של 4 מ מ מוזרק.
10. רשת האלקטרוניקה החללית מתחיל לנוע בתוכם המחט, להשתמש המסגרת stereotaxic לחזור בו את המחט באותו קצב שבה רשת האלקטרוניקה החללית להיות מוזרק, באמצעות המיקום המקורי מסומן של רשת האלקטרוניקה כמדריך.
    הערה: הליך זה, כינה את שדה הראיה (FoV) הזרקה השיטה²⁵, מאפשר למסירה מדויק של רשת אלקטרוניקה אזור המוח יישוב ללא הקורסת או פריקה. לעיתים קרובות ניתן להפחית את קצב זרימת רשת האלקטרוניקה החללית יתחיל לנוע בתוך המחט. במעבדה שלנו, המחירים זרימה של 20 – 30 מ"ל/h לעתים קרובות נדרש כדי להתגבר על החיכוך הסטטי בין רשת קירות נימי המחט, אבל הקצב ואז ניתן להפחית 10 מ ל ש ברגע החל תהליך ההזרקה. זרימה המחירים ואמצעי אחסון הזרקת קטנים בדרך כלל על מחטים נימי קוטר קטן יותר.
11. ממשיכים לזרום מלוחים פותחים את המחט עד המחט ביצע את הגולגולת. לעצור את הזרימה מהמשאבה מזרק.

4. קלט/פלט מישק

הערה: בשלב זה, רשת האלקטרוניקה החללית שהוחדרו מנקודת ההתחלה הרצויה בתוך המוח לאורך המסלול שבחרת. המחט יש כבר חזר בו, הוא מעל הניתוח עם אלקטרוניקה חיבורי רשת השינוי על פני מהמוח את המחט, את הקלט/פלט רפידות עדיין בפנים המחט (איור 7 ב). סעיף זה משתמש לוח מעגלים מודפסים (PCB; איור 7, איור 8) ממשק ל רשת האלקטרוניקה החללית. PCB מחבר מחבר לזיף מחבר מגבר סטנדרטי 32 ערוצים דרך מצע קרעי הופך להיות הראש-הבמה לניסויים הקלטה עצבית. PCB ניתנת להתאמה אישית כדי להכיל את הראש-שלב תצורות שונות. קבצי העיצוב שלנו זמינים לפי בקשה או מן משאב האינטרנט, meshelectronics.org, והוא יכול לשמש כדי לרכוש Pcb לבוררויות של ספקים של שירותי ייצור והרכבת מעגלים מודפסים.

1. השתמש המסגרת stereotaxic להנחות את המחט מועדון כדורגל מחבר חובק למעקה המצע בקפידה, על פני הפער, זבת הפתרון משאבת מזרק כדי ליצור מרווח האלקטרוניקה רשת מהירים (איור 7C).
2. ברגע שהמחט מעל המצע clamping ועל -פני הפער, לחדש את זרימת בקצב מהיר כדי להוציא רשת האלקטרוניקה קלט/פלט רפידות על גבי המצע clamping (איור 7D).
3. בעזרת מלקחיים וחומר על פיפטה של די, לכופף את רפידות קלט/פלט ca. 90° זווית כמו קרוב בלוח קלט/פלט הראשונה ככל האפשר.
   הערה: כיפוף של חריצי הכרטיסים נחוצה לאפשר את רפידות שתצורף לתוך המחבר זיף PCB בשלב הבא. המחבר לזיף הוא בדיוק באותו הרוחב כמו רפידות קלט/פלט 32 של המכשיר אלקטרוניקה עם רשת שינוי, אז לא מושלם 90° לכופף, או עיקול אינה מתרחשת לנגד בלוח קלט/פלט הראשון, יביא שיש לחתוך את רפידות קלט/פלט (את רפידות השמאלי ביותר ב איור 7-אי).
4. ברגע הידיות קלט/פלט מיושרים, פרש, ואת בזווית של 90° ' על הגזע רשת, יבש אותם במקום עם זורם דחוס אוויר.
   הערה: רשת האלקטרוניקה רגשים עם פחות מ- 32 ערוצים יכול להיות לממשק כדי עם הלוח באותו ממשק 32 ערוצים. לדוגמה, המעבדה שלנו משתמש בדרך כלל 16 ערוצים רשת האלקטרוניקה רגשים עם 32 ערוצים Pcb. זה מספק שטח נוסף בתוך המחבר זיף, הפיכת ממשק קל, ערוצי uncontacted נוספים מזוהים בקלות כמו מעגלים פתוחים באמצעות עכבה בדיקות במהלך אולפן הקלטות.
5. חותכים את המצע clamping ישרה כ 0.5-1 מ מ מהקצה של הידיות קלט/פלט. גם לחתוך חלקים חיצוניים של המצע clamping שישבשו את ההוספה למחבר רכוב PCB 32 ערוצים זיף (איור 7F).
6. הוסף את רפידות קלט/פלט למחבר לזיף PCB וסגור את התפס (איור 7G). שימוש אלקטרוניקה מדידה למדוד את התנגדות בין הערוצים הבורג הקרקע כדי לאשר מוצלח מגשרים אם ערכי עכבה גבוהה מדי, כן המחבר זיף, להתאים את ההוספה, ובדוק שוב עד חיבור מוצלח הוא אישר.
7. מכסה המחבר זיף, רשת חשופה אלקטרוניקה מהירים עם מלט שיניים להגנה. הפוך PCB בפירצה במצע, ותקן PCB עם מלט על גבי הגולגולת העכבר (איור 7 H).
   הערה: כיפוף מועדון כדורגל בפירצה מפחית את המתח מכני יכול לפעמים לשבור את רשת השינוי אלקטרוניקה מהירים.
8. לאפשר את הבטון להקשיח, הופכת PCB חזקות, קומפקטי הראש-שלב עבור ממשק במהלך מאולפן ההקלטות עוקבות (איור 7I).

5. העצבית הקלטה ניסויים

1. מקם את העכבר tailveiner או אחרים restrainer³³. הכנס את מגבר קדם PCB למחבר מגבר סטנדרטי PCB הראש-שלב. השתמש בכבל נפרד לקרקע את הבורג הפניה.
2. להקלטות מאופקת, להשאיר את העכבר restrainer. להקליט את הנתונים באמצעות מערכת רכישת נתונים עבור תקופת הזמן הרצוי (איור 8A).
3. להעברת בחופשיות הקלטות, שחרר את לחצן העכבר מ restrainer לאחר הוספת מגבר קדם PCB ו את הפניה בורג ההארקה. שיא לאורך הרצוי של זמן באמצעות מערכת רכישת נתונים בזמן העכבר מתנהג באופן חופשי (איור 8 ב').
4. בסוף להקלטות, הכניסו את העכבר בחזרה restrainer, במידת הצורך. להסיר את חוט הארקה, מגבר, קדם ולאחר מכן שחרר את העכבר בחזרה לכלוב שלו ולהחזיר את המתקן בעלי חיים עד לפגישה הבאה הקלטה.

6. היסטולוגית חלוקתה מכתים, הדמיה

1. לחכות עד הזמן הרצויים שלאחר ההזרקה, ואז עזים ומתנגד העכבר, transcardially perfuse עם פורמלין. הסר, להקפיא ו cryosection המוח לפרוסות בעובי 10-מיקרומטר. פרוטוקול מפורט על אימונוהיסטוכימיה, cryosectioning של רקמת המוח מכרסמים ניתן למצוא Evilsizor, et al. ³⁴.
   הערה: רקמת המוח, המכיל רשת אלקטרוניקה יכול להיות קבוע, למחלקה בדרך כלל, אף-על-פי ניטור האלקטרוניקה נותרו בתוך. זוהי יכולת ייחודית לעומת קונבנציונאלי הגששים עצבית, אשר להסירו לפני חלוקתה, ולכן לשנות את הרקמה או להקשות לנתח את ממשק המכשיר-רקמות.
2. יש לשטוף את המקטעים רקמת מוח קפוא 3 פעמים ב- 1 x PBS.
3. לחסום את הסעיפים בפתרון של 0.3% טריטון X-100 ו-5% עז נסיוב ב- 1 x PBS. . בוא תשב בטמפרטורת החדר במשך 1 h
4. דגירה הסעיפים עם הפתרון של נוגדנים העיקרי. הפתרונות נוגדן העיקרי המשמש כאן היו ארנב אנטי-NeuN (דילול 1:200), העכבר אנטי Neurofilament (דילול 1:400) ועכברוש אנטי-GFAP (דילול שבערך) עם 0.3% טריטון X-100 ו- 3% עז סרום. דגירה בין לילה ב 4 º C.
5. לשטוף את הסעיפים 9 פעמים עבור סכום כולל של 40 דקות עם 1 x PBS.
6. דגירה הסעיפים המוח עם הפתרון של נוגדנים משניים. הפתרונות נוגדנים משניים המשמש כאן היו אלקסה עבור חיל הים 488 עז נגד הארנב (דילול 1:200), אלקסה עבור חיל הים 568 עז אנטי עכבר (דילול 1:200) ו אלקסה עבור חיל הים 647 עז אנטי חולדה (דילול 1:200). דגירה הסעיפים לשעה בטמפרטורת החדר.
7. לשטוף את הסעיפים 9 פעמים עבור סכום כולל של 30 דקות עם 1 x PBS.
8. הר הסעיפים בשקופיות זכוכית עם coverslips באמצעות antifade mountant. להשאיר את השקופיות בחושך לפחות 24 שעות לפני הדמיה.
9. תמונה של השקופיות עם מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות 488 ננומטר, 561 nm, ואת לייזרים nm 633 כמקורות עירור של אלקסה עבור חיל הים 488, אלקסה עבור חיל הים 568 ו אלקסה עבור חיל הים 647, בהתאמה. השתמש התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) לשיקוף רשת האלקטרוניקה המיקרוסקופ אותו עבור שכיסה עוקבות של תמונות ושל ניתוח.

תוצאות

תוצאות ישתנו בהתבסס על מינים בעלי חיים המחקר, האזור במוח יישוב, הזמן שחלף מאז הזריקה, את כמות הנזק חריפה במהלך ההזרקה, ולהצלחת הקלט/פלט התממשקות נוהל, בין גורמים אחרים. יחידה בודדת עולה פעילות עשויים שלא להופיע עד יום 1 (במקרה של 150 מחטים הקוטר הפנימי מיקרומטר) 1 שבוע לאחר amplitudes הזרקת וספייק עלולים להשתנות עבור עד 4-6 שבועות. איור 9 מציגה נתונים אלקטרופיזיולוגיות נציג בדיקה אלקטרוניקה 32 ערוצים רשת מוזרק היפוקמפוס, קליפת המגע העיקרית עכבר C57BL/6J זכר בוגר. כ 300-µV משרעת שדה מקומי פוטנציאל (LFPs) נרשמו בכל הערוצים 32, יחידה בודדת עולה הפעילות הוקלט בערוצים 26. LFPs ואת קוצים בודדים נשארו דומים בין 2 ו 4 חודשים, מציע ממשק מאוד יציב בין הנוירונים ואלקטרוניקה הקלטה על-פני פרק זמן ממושך זה. איור 10 מראה תוצאות נציג חלוקתה היסטולוגית immunostaining של רקמת המוח, המכיל רשת אלקטרוניקה 1 שנה לאחר ההזרקה. צביעת עבור NeuN, סמן somata עצבית, neurofilament, סמן אקסונים עצבית, מגלה קטן ללא אובדן צפיפות רקמה במקום ההזרקה, רומז חלקה מגשרים בין רקמת המוח ואלקטרוניקה רשת. צביעת עבור GFAP (סמן האסטרוציטים) נוסף מגלה רמות ליד-ברקע של האסטרוציטים סביב רשת האלקטרוניקה, המציין כי נוכחותה מעוררת תגובה חיסונית קטנה כרונית.

איור 1: בשלבים מזרק-להזרקה mesh אלקטרוניקה ניסוי. פרוטוקול זה מתאר את כל השלבים החשובים בניסוי טיפוסי הקלטה עצבית מכרסמים באמצעות רשת האלקטרוניקה. ניסויים כרוכה בדרך כלל, לפי סדר הביצוע, (1) ייצור של רשת האלקטרוניקה, (2) טעינה של רשת האלקטרוניקה אל נימי מחטים הזרקת stereotaxic (3) של רשת האלקטרוניקה לתוך המוח, קלט/פלט חשמל (4) התממשקות ל mesh אלקטרוניקה, הקלטות מאופק או נעה בחופשיות (5) ו- (6) רשת/רקמות חלוקתה, צביעת עבור כפפות. במחקרים מסוימים, רק היסטולוגיה הנתונים עשוי בחסר, ובמקרה הזה ניתן לדלג שלבים (4) ו- (5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: מפרטים טכניים המתארים את תהליך ייצור עבור plug-and-play רשת האלקטרוניקה באזור התקן גמיש במיוחד (שורה עליונה), גזע חיבורי אזור (בשורה האמצעית) ואזור קלט/פלט (שורה תחתונה). (א) photoresist שלילי SU-8 (אדום) הוא בדוגמת עם מסיכת PL-1 כדי להגדיר התחתון passivating שכבה של כל בדיקה אלקטרוניקה רשת plug-and-play. המתבנת (B) עם המסכה-2 PL, אידוי תרמי של המראה מתכת להגדיר Au מהירים, רפידות קלט/פלט (זהב). (ג) המתבנת עם המסכה-3 PL, אידוי קרן אלקטרונים של המראה מתכת להגדיר Pt אלקטרודות (כחול). (ד) photoresist שלילי SU-8 (אדום) הוא בדוגמת עם מסיכת PL-4 כדי להגדיר את השכבה העליונה passivating. הפתחים סו-8 נשארים כל אלקטרודה Pt ו לוח קלט/פלט. (E) A הושלמה רשת האלקטרוניקה החללית עם תיבות מקווקו המציין את מיקומי מוגדל העליון, האמצעי, שורות למטה. Photomask עיצוב קבצים זמינים לפי בקשה מן המחברים או מאתר משאבים, meshelectronics.org. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: תצלומים ותמונות במיקרוסקופ אופטי של plug-and-play mesh אלקטרוניקה- (א) אריחים במיקרוסקופ אופטי תמונות של בדיקה אלקטרוניקה מזרק-להזרקה רשת עם קלט/פלט plug-and-play. המכשיר היה השיקוף לאחר השלמתו של הזיוף צעדים באיור 2, אבל לפני שחרורו מן המצע מצופים ניקל. תיבות מקווקו תואמות משמאל לימין כדי הסעיפים של אזור ההתקן גמיש במיוחד, גזע, אזור קלט/פלט יוגדל ב- C, D ו- E, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. (B) צילום של רקיק סי 3 אינץ המכיל 20 הושלמה רשת האלקטרוניקה הגששים. סרגל קנה מידה = 20 מ מ. (ג) אופטי מיקרוסקופ תמונה של 20 מיקרומטר קוטר Pt הקלטה אלקטרודות באזור התקן גמיש במיוחד. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (D) אופטי מיקרוסקופ תמונת Au בצפיפות גבוהה חיבורי באזור גזע. כל interconnect Au מבודד חשמלית ומתחבר אלקטרודה Pt יחיד של לוח הקלט/פלט יחיד. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (E) אופטי מיקרוסקופ תמונת הקלט/פלט רפידות. כל משטח מורכב אזור רשת מתקפלת אזור סרט דק רציפה ממוקם על הגבעול. מוליכי ללא סו-8 סרטים לחבר את מנות רשת של הידיות יחד כדי לעזור לשמור על היישור. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: הרכבה של מכשירי מחזיק מחטים נימי במהלך ההזרקה. (א) תצלום של הרכיבים של המנגנון. הרכיבים כוללים מחט נימי זכוכית (1), (2) בעל פיפטה, תופסן בורג מעגלית (3) המחזיק פיפטה, (4) מנקה חרוט על המחזיק פיפטה. פריטים (2) עד (4) הינם כלולים עם הרכישה של בעל פיפטה. החץ מסמן בשקע של בעל פיפטה אשר צריך להיות דבוק סגורה עם אפוקסי. (B) תצלום של בעל פיפטה ואחרי הרכבה החדרת מחט נימי זכוכית. אפוקסי הוסיף הנראים השקע העליון של בעל פיפטה (מסומן בחץ), צינורות קפילר מתחבר המחזיק פיפטה מזרק (לא מוצג). (ג) תצלום של בעל פיפטה, המחט נימי לאחר המצורף על המסגרת stereotaxic עם מלחציים סוף מאונכים. גודל ברים הם 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: טעינה של רשת האלקטרוניקה לתוך זכוכית מחטים. (א) איור סכמטי של תהליך הטעינה עבור plug-and-play רשת האלקטרוניקה. מחט זכוכית ממוקם ליד הקצה של קלט/פלט של רשת האלקטרוניקה החללית בזמן היא תושעה בפתרון. הבוכנה מזרק ואז נסוגים באופן ידני כדי לצייר את הגשוש אלקטרוניקה רשת. מיקום אידיאלי הוא עם האזור מכשיר גמיש במיוחד רק בתוך הסוף של המחט. תמונות (B) המתאים (א) של רשת האלקטרוניקה החללית הנטען לתוך מחט זכוכית. גודל ברים = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: סכימטי של התחנה ניתוח stereotaxic. מסגרת stereotaxic ממונע (A) עם מחזיק מצורפת פיפטה משמש כדי למקם את המחט לתוך האזור במוח הרצוי. המיקום של המחט, טעון רשת האלקטרוניקה מנוטרים עם עדשת המטרה מחוברת המצלמה (B), מוצג במחשב (C). מזרק משאבה (D) זורם כרכים מדויק של תמיסת מלח דרך המחט, המאפשרות הזרקה מדויקת, מבוקר של רשת האלקטרוניקה לאזור המוח הרצוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7: קלט/פלט Plug-and-play התממשקות הליך. (א) טורבין מחבר חובק למעקה המצע מאובטח עם שיניים מלט סמוכים זה הניתוח. (B) Plug-and-play רשת האלקטרוניקה stereotaxically מוזרקים לתוך אזור המוח הרצוי באמצעות השיטה FoV. (ג) המחט, עם המגנים קלט/פלט של רשת השינוי אלקטרוניקה בדיקה עדיין בפנים, תמוקם מעל מועדון כדורגל מחבר חובק למעקה המצע. זרימה (D) הוא חידש דרך המחט כדי להוציא את רפידות קלט/פלט אל מועדון כדורגל מחבר חובק למעקה המצע. (E) רפידות קלט/פלט הן כפופות ב-90 מעלות ביחס הגזע, פרש עם הצד ניצוח פונה כלפי מעלה, ייבשה במקום. המצע (F) מועדון כדורגל הוא מטופח עם מספריים ca בקו ישר. 0.5 מ מ מהקצה של הידיות קלט/פלט. המצע עודף נחתך כדי לאפשר את הכניסה לתוך מחבר לזיף 32 ערוצים. רפידות (G) הקלט/פלט מוכנסים מחבר לזיף 32 ערוצים רכוב על PCB מותאם אישית. המחבר לזיף נעול סגור כדי להפוך קשר עם הידיות קלט/פלט. (H) המנעול הוא חיזקו PCB סגור, ערק אל הגולגולת, PCB קבוע במקום עם מלט שיניים. (אני) PCB טפסים headstage קומפקטית עם מחבר מגבר סטנדרטי עבור ממשק קל במהלך אולפן הקלטות. גודל ברים = 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 8: הקלטות מאופקת, נעה בחופשיות. (א) תצלום של עכבר C57BL/6J זכר restrainer במהלך הקלטה באולפן. PCB מגבר קדם 32 ערוצים הוכנס לתוך המחבר מגבר סטנדרטי. (B) תצלום של העכבר אותו עם מגבר קדם 32 ערוצים PCB במהלך ניסוי הקלטה נעה בחופשיות. גודל ברים = 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 9: נציג הקלטה עצבית תוצאות. (א) נציג LFP מפות חום מ- 32 ערוצים mesh הגששים אלקטרוניקה מוזרק לתוך עכבר היפוקמפוס, קליפה המגע. הנתונים נרשמו בזמן העכבר בחנו בחופשיות בכלוב-2 חודשים (למעלה), הזרקת שאחרי 4 חודשים (למטה). משרעת LFP מסומן בצבע על פי סרגל הצבע בצד ימין. מעבר גבוה מסוננים עקבות (שחור) מציג פעילות עולה הערוכים בשכבות על spectrogram עבור כל הערוצים 32. קוצים (B) מבודד לאחר מיון הנתונים מותווים ב (א). יחידה בודדת עולה פעילות זוהה על 26 של 32 ערוצי שני 2 חודשים שלאחר ההזרקה (למעלה) ו- 4 חודשים שלאחר ההזרקה (למטה). המספרים מעל כל אשכול של קוצים תואמות מספרי ערוצים ב- (א). איור זה שונה מפו, et al. ²⁸. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 10: היסטולוגיה נציג תוצאות. (א) מפרטים טכניים הממחישות את הכיוון של רשת האלקטרוניקה בתוך אופקי (לוח האמצעי) ואת הווריד פרוסות המוח (פאנל התחתונה). (B) זריחה תמונת מיקרוסקופ של פרוסה עבה מוח קליפתי 10 מיקרומטר שנה לאחר הזרקה של 16 ערוצים רשת האלקטרוניקה החללית. הפרוסה כבר immunostained עבור NeuN (ירוק). (ג) הפרוסה המוח באותו immunostained עבור neurofilament (אדום). (ד) immunostained פרוסה המוח זהה עבור GFAP (ציאן). (E) A מורכב דימוי (B) עד (ד) מציג את רשת האלקטרוניקה/הרקמות ממשק עם תוויות NeuN (ירוק), neurofilament (אדום), GFAP (ציאן), ואת רשת האלקטרוניקה (כחול). גודל ברים = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ פו. et al. ²⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1 וידאו משלימים: חזר וטעינה של הזרקה של רשת האלקטרוניקה בתוך תמיסת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

דיון

כל השלבים של ייצור ושימוש של רשת האלקטרוניקה הם חשובים, אבל כמה קריטי במיוחד. לפני שחרור רשת האלקטרוניקה של וופל שלהם, זה חיוני להתחמצן השטח כדי להפוך את רשתות שינוי בקלות מושעה בתמיסה המימית (שלב 1.6.1). אם המערכת תדלג על שלב זה, הרשתות בדרך כלל צפים על פני המים, שהופך אותם קשה לטעון לתוך. המחטים, אם הם יכולים להיות טעון, הם לעיתים קרובות מקל הצדדים של המחטים זכוכית, הדורשים כמויות גדולות (> 100 µL) על הזריקה. כשל להתחמצן השטח לפני שחרור, לכן, בדרך כלל אומר כי הרשתות לא יכול לשמש, הזיוף חייב להיות מחדש שבוצעו מההתחלה. עוד צעד קריטי מכופף רשת האלקטרוניקה "גזע" ~ 90 ° במהלך הקלט/פלט התממשקות (שלב 4.3). אם הזווית היא פחות מ 90°, ואז כל התחבושות קלט/פלט 32 לא יתאימו למחבר לזיף; כמה יהיה לחתוך את הסוף כדי לאפשר את הכניסה, צמצום מספר אלקטרודות המחוברות. התהליך חייב להיעשות גם בעדינות כדי למנוע את הגבעול של שבירה.

ניתן להתאים אישית את העיצוב של רשת האלקטרוניקה ליישומים שונים על ידי שינוי של photomasks באמצעות ההליך פבריקציה נוספת באותו המתוארים באיור2. לדוגמה, בעוד רשת האלקטרוניקה הגששים נהגו לרשום את הנתונים באיור 9 נועדו יש 32 אלקטרודות הקלטה span העכבר היפוקמפוס, קליפת המגע העיקרית, מיקום האלקטרודות בתוך רשת השינוי גמיש במיוחד יכול להיות נבחר להתמקד כמעט לכל region(s) מוח, או אלקטרודות גדול יותר לגירוי יכול להיות incorporated²⁷. באותה רשת בסיסיים מבנה פבריקציה ההליך נשמרים, אך האלקטרודה ובעיצוב מותאמים לצרכים של המחקר. החוקרים צריך בזהירות, אולם, ותמיד לבדוק כי עיצובים שונה יכול להיות מוזרק בקלות דרך המחטים המיועד. שינויים קטנים המכניקה כיפוף של רשת אלקטרוניקה יכול להיות השפעה משמעותית על injectability. דוגמה אחת כזו היא בזווית של 45° בין סרטים SU-8 רוחביים האורך והרוחב התשואות רשת האלקטרוניקה החללית זה יכול להיות מוזרק facilely אבל זווית 90 מעלות תוצאות שבה מקמט שסותם מחטים²¹.

מדידה של עכבה של האלקטרודות הקלטה שימושי לפתרון בעיות. אלקטרודה Pt 20-מיקרומטר עגול קוטר צריך להיות בסדר גודל של עכבה ליד MΩ 1 כאשר נמדדת בתדירות של 1 קילו-הרץ ויוו או 1 x PBS²⁹. עכבה גדולים משמעותית יותר מרמז כי האלקטרודה אינה נחשפת, כפי שעלול לקרות אם מזוהם עם משקעים photoresist או לא חשמלית מחוברים. האחרון עלולה להתרחש אם, לדוגמה, יש אבק על המסכה צילום במהלך PL זה תוצאות שזזה ב האיחוד האפריקני מהירים, או אם לאחד רפידות קלט/פלט של רשת הוא לא יצר קשר עם סיכות מחבר לזיף במהלך ממשק קלט/פלט. בסדר גודל עכבה בערך חצי ערך צפוי מציע כי ייתכן קיצרה את הערוץ לזו סמוכים, יצירת מעגל של שתי האלקטרודות impedances במקביל אחד לשני. ערכי עכבה נמדד לשמש מדריך במהלך פתרון בעיות; בשילוב עם מיקרוסקופ אופטי של הגששים אלקטרוניקה עם רשת שינוי, מקור הבעיה בדרך כלל ניתן לזהות, תוקנה בהתאם ייצור הבא להפעיל או ניסיון ממשק קלט/פלט.

השימוש במזרק-להזרקה רשת האלקטרוניקה ללימודי חריפה מוגבל בכך פעילות יחידות יחיד עולה בדרך כלל הוא לא ציין עד זריקה פוסט 1 בשבוע²⁷, למרות עבודה (לא פורסם) מראה כי בעיה זו בקלות להתגבר. גורמים מרכזיים של הזמן הדרוש כדי לראות spiking פעילות רשת השינוי עיצוב, הנפח של נוזלים מוזרק לתוך המוח יחד עם רשת האלקטרוניקה, וקוטר המחט משמש הזרקה, כמו אלה משפיעים על מידת הנזק רקמות במהלך הזרקה, הקצב של ריפוי. כרכים גדולים הזרקת עשוי להידרש. אם רשת האלקטרוניקה לא מטופלות עם חמצן פלזמה פרסום ב- Ni etchant; כלומר, אם הרשת אינה הידרופיליות, זה יכול לדבוק המחט זכוכית. לעיתים, הרשתות יש פגמים להוביל כיפוף מכניקה מה שהופך אותם קשה להזריק. במהלך הטעינה של רשת האלקטרוניקה, חשוב לבדוק כי רשתות עוברים בקלות בצורה חלקה בתוך המחט (כפי שמוצג 1 וידאו משלימים). אם לא, אמור לשמש מכשיר בדיקה אלקטרונית רשת שונים. התוצאות הטובות ביותר עבור ממשק עצבי חלקה תושג עם אמצעי האחסון אידיאלי הזרקה של 10 – 50 µL לכל 4 מ מ אורך רשת מוזרק. תוצאות עדכניות יותר עם הגששים אלקטרוניקה עדינה יותר של רשת מוזרק ו/או (קטן כמו מיקרומטר 150 הקוטר הפנימי, 250 הקוטר החיצוני מיקרומטר) קטנים בקוטר נימי מחטים להראות את יחידה spiking יכול להיות שנצפו מן זמן קצר לאחר הזריקה (מידות חריפה) זמנים ארוכים יותר. מסכת קבצי העיצוב עבור אלה מבנים רשת עדינה יותר זמינים לפי בקשה או מאתר האינטרנט של משאבים, meshelectronics.org. אנו מעריכים את התשואה הכוללת של ויוו רשת הזרקת הנהלים שלנו באמצעות מחטים (הקוטר החיצוני של 650 מיקרומטר) הקוטר הפנימי של מיקרומטר 400 להיות סביב 70%, למרות התשואה הוא קרוב ל- 80-90% לעבודה שלנו עדכני יותר עם 150 הקוטר הפנימי מיקרומטר (250 מיקרומטר הקוטר החיצוני ) מחטים. הסיבות הנפוצות לכשל נמצאים (1) כי הרשת לא להזריק בצורה חלקה, וכתוצאה מכך בצקת במוח מאמצעי אחסון גדול באופן בלתי צפוי הזרקת לתוך המוח, (2) רשת שבירה במהלך המניפולציה ידני נדרש הקלט/פלט התממשקות הליך ו- (3) דימום גרימת נזק לכלי דם במהלך ההזרקה. פגיעה של כלי דם במהלך ההזרקה היא נדירה (הגורם של פחות מ-10% של כשלים) יכול להיות מופחת נוספת באמצעות ניתוח תמונה מונחה. נציין גם כי הנזק של כלי הדם היא מגבלה משותף של כל ההליכים הקשורים חדירה של רקמת המוח, כולל הזרקה של נגיפים עבור תרביות תאים, השתלה של מוח נוקשה הגששים, הזרקה של רשת האלקטרוניקה.

רשת האלקטרוניקה הגששים מסוגלים stably להקליט, לעקוב אחר של נוירונים בודדים אותו לפחות חודשים צירי זמן של שנה, לעורר תגובה חיסונית אין כמעט כרונית, כפי שמתואר באיור 9 ו 10 איור, בהתאמה. זה מייצג יתרון משמעותי לעומת אמנה עומק אלקטרודות, אשר בדרך כלל סובלים הפחתת ספייק amplitudes אותות לא יציב, דלקת כרונית במהלך ארוך טווח הקלטה ניסויים^{14, 15}. בנוסף, רשת האלקטרוניקה יש יתרון כי הם יכולים להישאר בתוך רקמת במהלך חלוקתה היסטולוגית, מכתים, הדמיה, בניגוד קונבנציונאלי הגששים, אשר הם נוקשה מדי ויש לכן להסירו לפני היסטולוגיה ניתוחים. לפיכך, רשת האלקטרוניקה לאפשר יכולת ייחודית לשימוש immunohistochemical ניתוח ללמוד דווקא הסביבה התאית סביב כל אתר הקלטה.

פרוטוקול שהוצג כאן פותח להמציא מרגש הזדמנויות חדשות במדעי המוח. שיטת מסירה פולשנית של ומיזוג חלקה של רשת חשמל עם רקמת המוח מזעור disruption המעגלים העצביים ומונעת כרונית תגובה חיסונית, אשר יכול להפיק תועלת מרבית סוגי הניסויים הקלטה עצבית כרונית. היכולת של רשת האלקטרוניקה לתעד ולעקוב הנוירונים בודד באותו פרקי זמן ארוכים במיוחד יהיה עניין חוקרים המבקשים לתאם אלפיות השנייה עולה לפעילות עם עד שנה-חודש תהליכים כגון הזדקנות, בפתוגנזה של מחלת מוח, או מוח פיתוח^16,18. בנוסף, קיימות הזדמנויות משמעותי כדי להרחיב ולהתאים את פרוטוקול זה, כגון הוספת פעיל אלקטרוניקה לשלב עדינות הראש-ליישום פונקציונליות כמו דיגיטלי ריבוב^8,35, אלחוטית תקשורת^35,36,37, עיבוד³⁵, שיתוף הזרקת תאי גזע או פולימרים עם האלקטרוניקה רשת כדי לסייע^18,התחדשות רקמות^{38, 39}, שילוב nanowire שדה – אפקט טרנזיסטורים (NW-FETs) לתוך רשת אלקטרוניקה עבור מאוד מקומי, רב תכליתיים המוח רגשים^{24,29,40,41 ,42}.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסגרת סטריאוטקסית ממונעת	World Precision Instruments	MTM-3	לניתוח סטריאוטקסי
בעכבר בקר הקלטה 512 ערוצים	Intan Technologies	C3004	רכיב של מערכת ההקלטה העצבית
RHD2132 לוח מגבר	Intan Technologies	C3314	רכיב של מערכת ההקלטה העצבית
RHD2000 כבל ממשק SPI דק במיוחד באורך 3 רגל	Intan Technologies	C3213	רכיב במערכת ההקלטה העצבית
Mouse restrainer	Braintree Scientific	TV-150  קוטר	פנימי סטנדרטי של 1.25 אינץ'; משמש לריסון העכבר במהלך הפעלות הקלטה מאופקות.
פרוסות Si	נובה חומרים אלקטרוניים		3 אינץ' P < 100> .001-.005 אוהם-ס"מ 356-406 μ m פרוסות SSP Si עבות Prime Grade עם 2 Semi-Std. שטוחות & 6,000 A° ± 5% תחמוצת תרמית רטובה משני הצדדים.
מסכות פוטו (כרום על זכוכית סודה ליים)	Advance Reproductions		Advance Reproductions וספקים אחרים מייצרים מסכות פוטו מקבצי עיצוב שסופקו. קבצי עיצוב מסכות הצילום שלנו זמינים על פי בקשה או מאתר המשאבים, meshelectronics.org. לחלופין, בחלק מהחדרים הנקיים של האוניברסיטה יש כותבי מסכות להכנת מסכות צילום באתר.
תוכנת AutoCAD	Autodesk Inc.		עיצוב תוכנה לציור מסכות צילום. אלטרנטיבה חינמית היא LayoutEditor. קבצי עיצוב מסכות הצילום שלנו זמינים על פי בקשה או מאתר המשאבים, meshelectronics.org.
מאייד תרמי	שרון ואקום		משמש לאידוי Ni, Cr ו-Au על גבי אלקטרוניקה רשת במהלך הייצור. לחדרים נקיים רבים באוניברסיטה יש כלי זה או דומה.
SU-8 2000.5 שלילי פוטו-רזיסט	MicroChem Corp.		פוטו-רזיסט שלילי המשמש להגדרת השכבות הפסיביות התחתונות והעליונות של אלקטרוניקת רשת.
יישור מסכות MA6	Karl Suss Microtec AG		משמש ליישור כל מסכת פוטו לתבנית שעל הפרוסה ולחשוף את הפרוסה לאור UV. ברוב החדרים הנקיים של האוניברסיטה יש כלי כזה או דומה.
מפתחת SU-8	MicroChem Corp.		משמש לפיתוח התנגדות פוטו-רזיסטית שלילית SU-8 בעקבות חשיפה לאור UV.
LOR3A מתנגד	ל-MicroChem Corp.		משמש עם Shipley 1805 photoresist לקידום חיתוך תחתון במהלך תהליכי הרמת מתכת
שיפלי 1805 פוזיסט פוזיט	חיובי, חברת		פוטו-רזיסט חיובי המשמש להגדרת חיבורי מתכת ואלקטרודות Pt באלקטרוניקה רשת
MF-CD-26 מפתח פוטו-רזיסט חיובי	Microposit, חברת		Dow Chemicalלפתח התנגדות אור חיובית S1805 לאחר חשיפה ביישור מסכה. חדרים נקיים רבים באוניברסיטאות מחזיקים את הכימיקל הזה.
ציפוי ספין	ריינולדס טק		לציפוי ופלים עם התנגדות חיובית ושלילית. ברוב החדרים הנקיים של האוניברסיטה יש מעילים מסתובבים.
מערכת טיפול משטח פלזמה PJ	AST Products, Inc.		משמש לחמצון פני השטח של אלקטרוניקת רשת לפני שחרורו לתמיסה מימית. ברוב החדרים הנקיים של האוניברסיטה יש כלי כזה או דומה.
מאייד קרן אלקטרונים	דנטון ואקום		לאידוי Cr ו-Pt במהלך ייצור אלקטרוניקה של רשת. לחדרים נקיים רבים באוניברסיטה יש כלי זה או דומה.
מסיר PG	MicroChem Corp.		משמש להמסת LOR3A ו-Shipley S1805 מתנגד במהלך הרמת מתכת
תמיסת כלוריד ברזל	MG Chemicals	415-1L	רכיב של תמיסת תחריט Ni
36% תמיסת חומצה הידרוכלורית	Kanto Corp.		רכיב של תמיסת תחריט Ni
מחטים נימיות זכוכית	Drummond Scientific Co.		קוטר פנימי 0.40 מ"מ, קוטר חיצוני 0.65 מ"מ. קטרים אחרים זמינים.
מחזיק מיקרופיפטה התקנים	מולקולריים מסוג U, LLC	1-HL-U	משמש להחזקת מחטי נימי הזכוכית במהלך הזרקה סטריאוטקסית
מזרק 1 מ"ל	NORM-JECT®, Henke Sass Wolf		משמש להעמסה ידנית של אלקטרוניקת רשת למחטים נימיות
צינורות קטטר תוך-דמי מפוליאתילן	Becton Dickinson and Company		קוטר פנימי 1.19 מ"מ, קוטר חיצוני 1.70 מ"מ
מזרק 5 מ"ל	בקטון דיקינסון ושות		משמש במשאבת המזרק להזרקת אלקטרוניקה רשת in vivo
מצלמת עינית	Thorlabs Inc.	DCC1240C	משמש לצפייה באלקטרוניקה של רשת בתוך מחטים נימיות במהלך הזרקה
תוכנת רכישת תמונות ThorCam uc480 עבור מצלמות USB	Thorlabs Inc.		משמש לצפייה באלקטרוניקה של רשת בתוך מחטים נימיות במהלך הזרקה
משאבת מזרק	מכשיר הרווארד	PHD 2000	משמש להזרמת נפחים מדויקים של תמיסה דרך מחטים נימיות במהלך הזרקת אלקטרוניקת רשת
מקדחה דנטלית EXL-M40	Osada	3144-830	לקידוח הגולגולת
0.9 מ"מ מקדחה	מדע עדינים	19007-09	לקידוח הגולגולת
מעקר חרוזים חמים 14 ס"מ	Fine Science Tools	18000-50	משמש לעיקור מכשירים כירורגיים
CM1950 מכשיר חיתוך הקפאה	Leica Microsystems		משמש לחיתוך רקמות קפואות לחלקים. לאוניברסיטאות רבות יש כלי זה או כלי דומה זמין במתקן משותף.
0.3% Triton x-100	Life Technologies		משמש להיסטולוגיה
5% סרום עיזים	Life Technologies		משמש להיסטולוגיה
3% סרום עיזים	Life Technologies		משמש להיסטולוגיה
ארנב אנטי-NeuN	Abcam	ab177487	משמש להיסטולוגיה
עכבר אנטי-נוירופילמנט	Abcam	ab8135	משמש להיסטולוגיה
עכברוש נגד GFAP	תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ	PA516291	משמש להיסטולוגיה
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific Inc.	P36930	משמש להיסטולוגיה
פולי-די-ליזין	סיגמא-אולדריץ' קורפ.	P6407-5MG	משקל מולקולרי = 70-150 kDA
מהדק קצה בזווית ישרה	Thorlabs Inc.	RA180/M	משמש לחיבור מחזיק הפיפטה למסגרת הסטריאוטקסית
לוח מעגלים מודפסים (PCB)	מעגלים		המשמש לממשק בין אלקטרוניקת רשת לאלקטרוניקה למדידה היקפית כגון מערכת ההקלטה Intan. Advanced Circuits וספקים אחרים מייצרים ומרכיבים מעגלים מודפסים על סמך קבצי תכנון מסופקים. קבצי תכנון ה-PCB שלנו זמינים על פי בקשה או באתר המשאבים meshelectronics.org
מחבר מגבר סטנדרטי 32 ערוצים	Omnetics Connector Corp.	A79024-001	רכיב מורכב על
גבי כבל גמיש שטוח 32 ערוצים PCB (FFC)	Molex, LLC	152660339	משמש כמצע הידוק בעת התממשקות לרפידות I/O של אלקטרוניקת רשת עם מחבר ZIF המותקן על ידי PCB
מחבר 32 ערוצים אפס כוח תחיבה (ZIF) Hirose	Electric Co., LTD	FH12A-32S-0.5SH(55)	רכיב מורכב על ה- PCB