מאמר שיטה

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

DOI:

10.3791/58024

⸱

29 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה (רזבורה rerio) בעלי orthologues 84% של הגנים הידועים להיות מזוהה עם מחלות אנושיות. בנוסף, בעלי חיים אלה יש זמן דור קצר, קל לטפל, להציג שיעור הרבייה גבוה, בעלות נמוכה, ואת נתונות בקלות שינויים גנטיים על-ידי microinjection של ה-DNA של העוברים. התפתחויות אחרונות ג'ין כלי עריכה מפעיל את הקדמה מדויק של מוטציות, transgenes של דג זברה. מחלת דוגמנות בשנת דג זברה לעיתים קרובות מוביל פנוטיפים זחל ומוות מוקדם, אשר עשויה להיות מאתגרת לפרש אם אחרים אינם ידועים. זה זיהוי מוקדם של אחרים הוא גם הצורך בניסויים הדורשים מדגם איגום, כגון גנים ביטוי או מסה ספקטרומטר מחקרים. עם זאת, ההקרנה נרחב genotypic מוגבל באמצעות שיטות מסורתיות, אשר במעבדות רוב מבוצעות רק על דג זברה למבוגרים או הזחלים לאחר המוות. אנחנו פתרנו בעיה זו על ידי התאמת שיטת הבידוד של DNA גנומי מוכן-PCR הזחלים חיים דג זברה ניתן להשיג מוקדם ככל 72 h שלאחר ההפריה (hpf). הזמן הזה, טכניקה חסכונית, השתפרו מפרוטוקול genotyping שפורסמו בעבר, מאפשר זיהוי אחרים מן מיקרוסקופיים פין. ביופסיות. הסנפירים במהירות להתחדש כאשר הזחלים מתפתחים. חוקרים יכולים ואז בחר ולגדל את אחרים הרצוי לבגרות על ידי ניצול זה תפוקה גבוהה הליך genotyping מבוססי ה-PCR.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה (רזבורה rerio) הוא יצור חוליות בשימוש נרחב כמודל לחקירה המחלה, כמו גם לגבי בדיקות פרה של השערות טיפולית-1,-2,-3. בעלי חיים אלה יש זמן דור קצר, קל לטפל, להציג שיעור הרבייה גבוה, בעלות נמוכה, ולא נתונות בקלות שינויים גנטיים על-ידי microinjection של ה-DNA עוברי4. דרך ההתפתחות הגוברת של הרומן הטרנסגניים וג'ין עריכה טכנולוגיות כגון אבץ-אצבע nucleases (ZFN)5,6,Nucleases אפקטור כמו טל (TALENs)7, וקצר את מקובצים באופן קבוע Interspaced Palindromic חוזר (CRISPR) / CRISPR-הקשורים 9 (Cas9) מערכת8, דג זברה צפוי באופן משמעותי לשפר את ההבנה של מספר תנאים פיפטות. טכנולוגיות אלה שימשו כדי ליצור כיסויים ממוקד בשני סומאטית ולשנות germline בתאים דג זברה, ביעילות מחורזות גנטית בעלי חיים8. הדוגמאות האחרונות בספרות כוללות פיתוח מוצלח של דגמים גנטיים של אפילפסיה, הפרעות מטבוליות דג זברה3,9,10,11,12 .

עם ההתקדמות בעריכת הגנום דג זברה, מהיר ואמין genotyping הפך צעד הגבלת קצב מוטל בספק. זיהוי מוטציות DNA ספציפיים סמוכים לאתר החזוי לעריכת הגנום היעד היא שלב חיוני של הפרוטוקול. באופן מסורתי, טכניקות genotyping מאת פין מסיכה בדרך כלל רק שבוצעו בנער או מבוגר דג זברה. עם זאת, הזמן בילה דג זברה העלאת לבגרות (> 2 חודשים) מעכב במידה ניכרת התקדמות במחקר. במקרים רבים, לבגרות אינה יכולה להיות מושגת בשל הסתרה באמצעות גנים חיוניים (למשל, בדוגמנות מחלה) או רווח-של-פונקציה מוטציות שמוביל פנוטיפי השפעות מזיקות. בנוסף, מספר מבחני דורשים איגום של הזחלים, כגון ה-RNA או מטבוליט החילוץ, ולערב ובכך זיהוי מראש של אחרים, אשר עשויה להיות מאתגרת כאשר רק פוסט הוק genotyping טכניקות זמינים. את הדוגמאות הנ ל מדגישים את החשיבות של טכניקות genotyping זחל אשר נמצאים באותו זמן מדויק ולאפשר החלמה מלאה, התפתחות תקינה של הזחלים. Genotyping דג זברה בשלב מוקדם לא מופיע כעת כדי להיות בשימוש נרחב; זה משתקף על ידי פרסומים אחרונים של מודלים מחלה שבה הזחל אחרים מזוהים באמצעות פוסט-מורטם genotyping ולא genotyping לפני ביצוע הניסוי12,13,14. בנייר זה, אסטרטגיה קליפ פין זחל מוצגת במטרה לייעל את ההליכים genotyping שנוצרו קודם לכן.

בעבר, אסטרטגיות העסקת מערכת העיכול proteinase K גנוטיפ חיים דג זברה הזחלים הובילו פולימראז משתנה-תגובת שרשרת (PCR)-יעילות-15. למרות יותר שפורסם לאחרונה טכניקה ביופסיה הזנב מיקרוסקופיים סיפק תוצאות מבטיחות יותר16, אנחנו וארגונים אחרים לא היו מסוגלים להפיק את נצילות גבוהה והתאוששות DNA שדווחו על-ידי המחברים. עיכוב העיקריים של פרוטוקול מתוארת על ידי ווילקינסון. et al. 16 יכול להיות ההעברה של הרקמה זנב אל הצינור ה-PCR. בשל גודלו מיקרוסקופיים, קשה להבטיח הנוסח היה כראוי שנאספו על ידי pipetting. כדי לטפל מחסום זה, פיתחנו פרוטוקול משופרת עבור מספרים גדולים genotyping של הזחלים חיים דג זברה עם כמעט 100% יעילות9. שימוש של microscalpel, קצה הזנב סנפיר הוסר, להציב על גבי פיסת נייר סינון. פיסת נייר סינון המכיל את הרקמה יכול להיות בקלות דמיינו והניח כהלכה לתוך צינור ה-PCR. הפקת דנ א גנומי מתבצע לאחר מכן, ואחריו PCR הגברה של האזור בעל עניין עד גנוטיפ הדגימה. היתרונות של שיטה זו כוללים PCR יעילות גבוהה, קצב נמוך חיובי כוזב, התמותה נמוכה. בנוסף, genotyping מספר גדול של עוברי אפשרי באמצעות פרוטוקול זה. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר סנפיר-מסיכה של מאות הזחלים בתוך 2-3 h באמצעות גישה זו ועל זיהוי נכון של דגים genotyped והתחדשות הזנב בתוך יומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נהלים מעורבים בעלי חיים אושרו והנושאים הם על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים מסופקים על ידי המועצה הקנדית על בעלי חיים והטיפול מאוניברסיטת אוטווה ועדות טיפול בבעלי חיים.

1. הכנה

  1. להכין את השטח לנתיחה על ידי מקליטה מכסה פטרי 9 ס מ עם קלטת autoclave על פני השטח הפנימי שלו. מקם את זה תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  2. מקום 3-5 ימים לאחר ההפריה (dpf) דג זברה הזחלים ב פטרי צלחת, עזים ומתנגד במ מ ˜1.5 Tricaine x E3 1 העובר בתקשורת (5 מ מ NaCl, 0.17 מ מ אשלגן כלורי, 0.33 מ מ CaCl2, 0.33 מ מ MgSO4, pH 7.2).
  3. לחתוך את הקצה של טיפ פיפטה P1000 עם זוג מספריים או סכין גילוח עד קוטר של 2 מ מ כדי להכיל זחל dpf 3 עם לחץ מינימלי.

2. פין מסיכה של הזחלים דג זברה

  1. לאסוף של זחל anesthetized באמצעות micropipette את-P1000 ששונה ולמקם הזחל דג זברה על הקלטת אוטוקלב ממוקם על המכסה פטרי.
  2. הסרת עודפי פתרון Tricaine סביב הזחל משתמש של micropipette. האזור צריך להיות יבש כמו אפשרי בהצלחה סעיף ולאסוף את הנוסח אבל עדיין רטוב כדי להבטיח הישרדות.
  3. באמצעות אזמל מיקרו, סעיף הסנפיר סימטרית תחת סטריאו-מיקרוסקופ כמצוין ב- איור 1, כפי שמתואר ווילקינסון ואח16. במהלך החיתוך, החל לחץ כלפי מטה קבוע בתוך האתר הפער פיגמנט של סנפיר סימטרית, דיסטלי להגביל זרימת הדם (איור 1 א'). הפעילו לחץ עדין כדי למנוע נזק של מיתר הגב.
  4. לדמיין את הסנפיר משרטוטי תחת המיקרוסקופ ומקם את פיסת מעל הקצה הלהב microscalpel (איור 2 א). מניחים את microscalpel המכיל את הנוסח על פני פיסת נייר סינון קטנה.
    הערה: בשל נוכחותם של מלנוציטים בתוך רקמת transected, שלב זה מאפשר הדמיה של הסנפיר כמו כתם שחור קטן (איור 2B).
  5. באמצעות מספריים תגליתו (איור 2C), העברת נייר הסינון המכיל את הנוסח כדי צלחת PCR 96-ובכן, המכיל 25 μL של 50 מ מ NaOH פתרון לכל טוב (איור דו-ממדי).
  6. להכין צלחת 96-ובכן שטוח התחתונה, מספור לבאר על פי התווית של צלחת PCR. בזהירות בעזרת פיפטה P1000 ששונה את מלא 200 µL של טרי 1 x E3 העובר מדיה, לאסוף את הזחל דג זברה באמצעות לחץ עדין. לוותר על הזחל בתוך הלוחית תרביות רקמה 96-ובכן, באותו מספר טוב כמו הצלחת ה-PCR (2E איור).
  7. ודא כי נייר הסינון טוב שקוע בפתרון (איור 2F). לנקות את הלהב של microscapel, פינצטה בין כל חתך למניעת זיהום צולב על ידי טבילת האזוב בתוך תמיסת EtOH 70%. נגב את הלהב עם רקמת נייר נקי/מחיקה.
  8. חזור על שלבים 2.1-2.7 עד שאיבדת כל העוברים.
  9. לאחסן את הזחלים בצלחת 96-ובכן-28 ° C עד אחרים זוהו.
    הערה: המדיה העובר לא צריך להיות שונה, שכן הפרוטוקול ניתן להשלים בקלות פחות מ- 2 ימים. אם נדרש זמן רב יותר, מומלץ שינוי מדיה.

3. הפקת דנ א גנומי

  1. חותם את הצלחת ה-PCR 96-ובכן, צנטריפוגה הדגימות-1000 g x עבור 1 דקות לוודא את כל הניירות מסנן טובע בתוך הפתרון NaOH.
  2. עבור פירוק רקמת, מחממים את דוגמאות thermocycler ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחריו קירור עד 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. להוסיף 6 μL של 500 מ מ טריס-HCl, pH 8.0 על כל דגימה. מערבולת.
  4. Centrifuge בקצרה את הצלחת ב g x 1,500, עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. השתמש μL 1.5 של תגובת שיקוע הדנ א לפי תגובת ה-PCR.
  6. הכן ה-PCR כדי גנוטיפ הזחלים, כפי שמוצג בטבלה 1-2.
    הערה: פרוטוקול זה נבדקה שני יישומים: מגה-פלקס תגובות PCR חושף את גנוטיפ באמצעות ג'ל agarose9, heteroduplex נמס assay (HMA) חושף את אחרים באמצעות לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד)17.

4. אלטרנטיבית החילוץ גנומית באמצעות שרף Chelating

  1. שלב שלם 2.5 על-ידי הוספת מסנן נייר עם הסנפיר החתוכים צלחת PCR 96-ובכן, המכיל 30 μL של 5% chelating שרף (styrene-divinylbenzene קופולימר המכיל יונים iminodiacetate מזווג).
    הערה: זה סוג של שרף משמש בדרך כלל עבור פירוק רקמת והכנה של PCR-מוכנות DNA באופן מהיר ויעיל18.
  2. בצע את שלבים 2.6-2.8 כמצוין.
  3. לאטום את הצלחת ה-PCR 96-ובכן, בקצרה centrifuge את הדוגמאות כדי לוודא כי כל נייר סינון שקוע בתוך השרף chelating.
  4. עבור פירוק רקמת, מחממים את דוגמאות thermocycler ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחריו קירור עד 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: שלב זה מאפשר פירוק איגוד עוקבות של חרוזים שרף קוטבי לרכיבים הסלולר בעוד DNA ו- RNA להישאר בפתרון.
  5. Centrifuge בקצרה את הדגימות הצניפה את החרוזים שרף ולקבל את ה-DNA ההשעיה.
  6. בצע את שלבים 3.5-3.6 להשלמת הליך genotyping.

5. יישום 1: מגה-פלקס PCR שלאחריה יבוא ניתוח Agarose ג'ל

  1. בעקבות טבלה 1, להגדיר תגובה PCR מולטיפלקס כדי לאפשר את האפליה בין מוטציות homozygous, heterozygotes, WT הזחלים. השתמש הצנטרפוגה תרמי 96-ובכן כדי לבצע את תגובות PCR באמצעות רכיבה על אופניים בתנאים המתוארים בטבלה3.
    הערה: תגובות PCR ניתן גם לבצע ב כל אחרים קונבנציונאלי PCR תרמי הצנטרפוגה. דוגמה זו מתארת את אסטרטגיית ה-PCR המשמש פנה, et al. 9 כדי לזהות aldh7a1 WT ו- 5-bp הכניסה אללים mutant ב אותה התגובה מולטיפלקס.
  2. הכנת ג'ל agarose 1% נתרן בוראט מאגר, מוכתם 1 x GelRed.
    הערה: 20 x מלאי מאגר נתרן בוראט מורכב 40 מיליליטר 10 מ' NaOH, מ 1800 ל- ddH2O, pH להתאים ל- 8.5 עם 76 גרם חומצה בורית, ואז השלים לנפח סופי 2 ל' באמצעות ddH2O.
  3. הפעל את הג'ל במאגר נתרן בוראט 1 x למשך 15 דקות ב 250 V. כדי להקל על התהליך, במידת האפשר, השתמש ג'ל מערכת תואמת pipets רב-ערוצי כדי לאפשר יכולות תפוקה גבוהה יותר על-ידי הפחתת הזמן דוגמיות.
  4. תמונה הג'ל מתחת לאור אולטרה סגול (UV) כדי לאפשר אפליה אחרים שונים.

6. יישום 2: Heteroduplex נמס Assay

  1. להכין דף 12% ג'ל שימוש במשטח מרווח 1.5 מ מ ומסרקים 15-דוגמאות. להכין שני ג'לים דף משתמש mL 12.21 ddH2O, 2.52 מיליליטר 10 x טריס/בוראט/EDTA (TBE), 10 מ של אקרילאמיד 30%, 250 μL של 10% קירור (APS) ו 20 μL של tetramethylethylenediamine (TEMED). השתמש 1 מאגר x TBE (0.089 מ' טריס-HCl, חומצה בורית מ' 0.089 וחומצה ethylenediaminetetraacetic 0.002 M (EDTA)) זהה להפעלת המאגר.
  2. מחממים את המוצרים PCR ב 94 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  3. מגניב הצינורות על הקרח או את thermocycler 10 דקות ב 4 º C.
  4. לטעון μL 10 עבור דגימה PCR ו- 8 μL של סמן משקל מולקולרי.
  5. הפעל את הדף ב-150 V ב- x 1 TBE באמצעות מערכת אלקטרופורזה אנכי 1 h או עד דה מרקר משקל מולקולרי כמעט מגיע לקו הרגל של לוח הזכוכית.
  6. תמונה הג'ל תחת אור UV כדי לאפשר אפליה אחרים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היעילות של protocoll הודגם על ידי genotyping הצאצאים הצלב משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (aldh7a1/ ot100, המוצג כאן כ aldh7a1+ /-) (איור 3A- C)9. אלל mutant aldh7a1ot100יש 5-(bp) הכניסה אקסון קידוד הראשון של הגן aldh7a1 דג זברה שמוביל frameshift ותפקוד אובדן-של-בשל codon מוקדם להפסיק9. 4 צבעי יסוד שימשו לתגוב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'ין כלי עריכה יש כבר מועסקים בדיוק להציג מוטציות, transgenes של דג זברה האחרונות שנים5,6,7,8. בעת ביצוע המחלה דוגמנות בשנת דג זברה, פנוטיפים זחל או ילדותי המוקדמות הם נצפו לעתים קרובות9,12,13,14. פרוטוקול המובאת כאן מתאר הפקת דנ א מוכן-PCR של ביופסיות זחל זנב דג זברה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות מודלים מחלה נדירה ורשת מנגנון (RDMM) (במימון את קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR) ואת הגנום קנדה). CK נתמכת על ידי פרס מלגת UROP (מאוניברסיטת אוטווה). DLJ נתמך על ידי מלגה לתואר שני של קנדה וניהר. חוג ידידי הפקולטה נתמכת על ידי פרס בתר קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR). המחברים תודה על גנטיקה החברה של אמריקה למתן הרשאה לפרסם פרוטוקול זה וכדי להשתמש עיבוד של 5 איור משלים מ פנה, ואח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת פטריקורנינג430167
מיקרואזמלמכשירים מדויקים עולמיים500249
סטריאומיקרוסקופניקוןSMZ1500
טריקאין/אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאטסיגמא-אולדריץ'E10521
96 בארות צלחת תרבית רקמותCostar3595
96 בארות PCR צלחתפישר14230232
NaOHFisherS25548A 
בסיס טריס Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5% Chelex 100 נתרן בצורתSigma-AldrichC7901
GelRed 1xביוטיום41003
חומצה בוריתSigma-AldrichB6768
מערכת תת-תא דגם 192Bio-Rad 
30% תמיסת אקרילאמיד/BIS, 37.5: 1ביו-רד 
GoTaq Green Master Mix, 2Xמגבוני נייר PromegaM7123
(מגבונים חד פעמיים)Sigma-AldrichZ188956
סמן משקל מולצילר פלוס 1kb Thermo ScientificSM1343
מים ללא נוקלאז מערכת Sigma-AldrichW4502
תת-תא דגם 192 (מערכת ג'ל אגרוז בתפוקה גבוהה)Bio-Rad 
1704508 מערכת אלקטרופורזה ג'ל אנכית Mini-PROTEAN Tetra Cell ביו-רד 
170450816101581658004

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  2. Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
  3. Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
  4. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115(2009).
  5. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  6. Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  7. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
  8. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  9. Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
  10. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410(2013).
  11. Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
  12. Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
  13. Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
  14. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
  15. Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
  16. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  17. Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420(2014).
  18. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
  19. Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRMultiplex PCR

מאמרים קשורים