בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא

Summary

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה micropipette ישירות להחיל כוח מבוקר את הגרעין בתא החי. Assay הזה מאפשר חקירת תכונות מכניות הגרעין בתא חי, חסיד.

Abstract

התכונות המכאניות של הגרעין לקבוע את תגובתה מכני הכוחות שנוצר בתאים. מכיוון הגרעין מולקולרי רציפה עם שלד התא, שיטות נחוצים כדי לחקור את התנהגותו מכני בתאים חסיד. כאן, אנו נדון החללית כוח ישיר ( DFP) ככלי להפעיל כוח באופן ישיר הגרעין בתא חסיד חי. אנחנו לצרף micropipette צרים על פני השטח גרעיני עם השאיבה. Micropipette מתורגמת הרחק מהגרעין, הגורמת הגרעין לעוות ולתרגם. כאשר הכוח שחזור שווה כוח יניקה, הגרעין לניתוק ונרגע elastically. בגלל הלחץ היניקה הוא ידוע במדויק, הכוח על פני הגרעין ידוע. שיטה זו חשפה כי בקנה מידה ננו כוחות מספיקים לעוות ולתרגם את הגרעין בתאים חסיד, זיהה רכיבים cytoskeletal המאפשרים את הגרעין להתנגד כוחות.  DFP ניתן לנתח התרומות של רכיבים הסלולר וגרעיני תכונות מכניות הגרעין בתאים חיים.

Introduction

פתולוגיות כגון סרטן כרוך שינויים גרעיני צורה, מבנה^1,2, אשר באופן כללי מלוות של "ריכוך" של גרעין^3,4. התנגדות גרעיני דפורמציה מכאנית בדרך כלל התאפיין החלת כוח מבודדים גרעינים⁵.

הגרעין בתאים מחובר מולקולרי שלד התא על ידי מקשר של Nucleoskeleton שלד התא (לינק) מורכב^6,7,8,9. כתוצאה מכך, הגרעין מכנית משולב עם שלד התא ודרכו תא-תשתית הדבקויות, מטריצות. מכנית חיטוט הגרעין בתוך תאים חסיד יכול לספק תובנה זו אינטגרציה מכנית. שיטות לטפל גרעין תאים חיים כוללים micropipette שאיפה^10,11,^13,12,מיקרוסקופ כוח אטומי¹⁴. אנחנו לאחרונה תיאר בדיקה ישירה כוח ( DFP) שחל כוחות מכני ישירות על גרעין תא חסיד חי¹⁵.

כאן, אנחנו חלוקה לרמות נוהל באמצעות מערכת microinjection זמין בדרך כלל במתקנים מיקרוסקופ כדי להחיל כוח מכני ידוע, בקנה מידה ננו ישירות על גרעין תא חסיד. Femtotip (0.5 מיקרומטר קוטר micropipette tip) רכוב, המחוברים למערכת microinjection באמצעות צינור. הטיפ, מוצבים בזווית של 45 מעלות ביחס השטח של המנה תרבות, היא יורדת עד סמוך אל פני השטח גרעינית. הצינור ואז מנותק ולאחר שנפתח לאווירה, אשר יוצרת לחץ שאיבה שלילי על פני הגרעין, חותמות את הטיפ micropipette נגד פני השטח גרעינית. באמצעות תרגום של קצה micropipette, הגרעין מעוותים, בסופו של דבר (בהתאם לגודל הכוח חלה), מנותקת את micropipette. בחבורה הזאת מתרחשת כאשר הכוחות (התנגדות) שחזור, המופעל על ידי גרעין התא, שווה את כוח היניקה שהחיל את micropipette. הניתוח יכול להתבצע על ידי מדידת הפיזור של הגרעין, המתח אורך (משוואה 1), או המתח באזור (איור 1 א').

Protocol

1. מכינים את התאים עבור הדמיה

הערה: החללית כוח ישיר ( DFP) יכול לשמש עבור כל סוג התא חסיד. כאן, NIH 3T3 העכבר fibroblasts משמשים את שורת התאים מודל עבור פרוטוקול זה.

1. תאי פיברובלסט 3T3 תרבות NIH בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% התורם שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין על 35 מ מ זכוכית התחתונה מגישים עד confluency הרצוי. לשמור על תאים-CO 37 ° C ו-5%₂.
   1. הקפד מעיל כל המנות התחתון 35 מ מ זכוכית עם 5 µg/mL fibronectin (או חלבון ה-ECM דומה), לפני זריעה NIH 3T3 תאים עבור הדמיה.
      הערה: התאים יש מלא למרוח, חסיד על המנה לניסוי. אין אילוצי במונחים של confluency עבור שיטת  DFP לעבודה.
2. מיד לפני הניסוי, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולאחריה שטיפה אחת עם מדיום הגידול מלאה.
3. להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול מלאה המנה קרקעית זכוכית.

2. מיקרוסקופ ורכישת תמונות

הערה: הפוכה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (או שווה ערך) עם micromanipulator מותקן לזרוע בצד, על פי ההמלצות של היצרן. המיקרוסקופ צריך להיות מאובזר גם עם חדר סביבתיים לשמירה על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס ורמת CO₂ ב-5%. נדרש גם micromanipulator עם microinjector מחובר המיקרוסקופ. טבילה שמן x 40 / 1.3 נה או 60 x / 1.49 NA (או מטרות שוות ערך) מומלץ לקבל הניסויים. המיקרוסקופ צריך להיות מותקן על שולחן בידוד רטט.

איור 1 . דפורמציה גרעיני ומיקוד מיקרוסקופ
א דפורמציה מקסימלית גרעיני ורגיעה של דפורמציה גרעינית. לפני חישוב דפורמציה מקסימלית גרעינית, הקצוות האחורי של צורות גרעיני היו קודם בד בבד לתקן את התרגום של גרעין מעוותים. הצורה של הגרעין ברגע של ניתוק עצה micropipette ומצופה על-גבי צורת הגרעין הראשוני לפני שנעלם. ההבדל באזור בין שתי הצורות נמדדה כ Δ₁. להרכב גרעיני מרבי מוגדר כδA₁ מחולק באזור הגרעין המקורי. באופן דומה, פרמטר השני, ΔA₂, עשויה להיות מוגדרת על-ידי השלכת צורת הגרעין מצב יציב הסופי לאחר ניתוק micropipette על-גבי צורת הגרעין המקורי. B. למקד את התא-A המטוס ולאחר מכן הזז את מטוס מוקד עד המטוס B כדי למצוא את הטיפ micropipette. במהלך דימות, micropipette היה לתרגם את הזכות (כיוון החץ הכתום). איור זה השתנה מ קיראן ואח. ¹⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. הפעל את microinjector לכל הפרוטוקול של היצרן.
2. בעזרת טפטפת שמן של טבילה, להחיל טיפת שמן טבילה על גבי העדשה אובייקטיבי.
3. תהדק את המנה בחוזקה לתוך בעל צלחת וטען בעל צלחת לבמה.
   הערה: התאים חייב להישמר-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ לאורך כל הניסוי.
4. להתאים את גובה המטרה להביא את התאים אל המוקד (A המטוס, איור 1B).
5. הזז את הבמה מיקרוסקופ כדי למצוא תא עניין.
6. לסובב את מוט ההיגוי על micromanipulator כדי לעבור על בעל pipet המיקום העליון. טען את micropipette עצה בקוטר 0.5 מיקרומטר על בעל pipet.
   1. כדי למנוע הידבקות תאים כדי micropipette, מראש לפנק את הטיפ micropipette עם 0.3 מ"ג/מ"ל PLL-g-יתד פתרון עבור 1 h בטמפרטורת החדר. מבחן הדבקה על ידי נגיעה את micropipette את הגרעין וללא לחץ היניקה, ולאחר מכן תרגום של micropipette הרחק מהגרעין. העדר אדהזיה וריחו מורגש חוסר מוחלט דפורמציה גרעיני ותרגום.
      הערה: אנא עקוב אחר ייצור הצעות כדי לפתוח את החבילה.
7. להעלות את המטוס מוקד אובייקטיבית מעל המטוס A והעליונה של התא על מטוס B על ידי התאמת הפקד בסדר (איור 1B, ראה שלב 2.4).
8. הגדר את micromanipulator מחוספס בפקד. לאט לאט להביא את micropipette אל המטוס B על ידי צופה על הצללית של micropipette, עד micropipette מגיע באופן מלא אל המוקד.
9. לאחר קצה micropipette בפוקוס, הגדר את micromanipulator שליטה טובה .
10. להוריד את המטרה קו המשווה של התא (א המטוס, איור 1B) ולהוריד את micropipette בסביבות 15 מיקרומטר מעל המטוס א (איור 1B, micropipette מקווקו).
11. להגדיר את הלחץ פיצוי (P._c) microinjector ללחץ הרצוי; המתן מספר שניות עד הלחץ עד שהוא יתייצב.
    הערה: שנקבעה מראש הלחץ האופטימלי תלוי סוג התא והן את מטרותיה של הניסוי. ברוב המקרים, 300 hPa יהיה נקודת התחלה טובה.
12. ודא כי micropipette זה לא סתם באמצעות ההגדרה נקיים בלוח micromanipulator ו בודק כדי לוודא בועות אוויר מגיחים הטיפ micropipette.
13. הכנס את הטיפ לתוך התא על-ידי הנמכת בהדרגה את micropipette עד הטיפ נוגעת בקלילות על פני הגרעין.
    הערה: כאשר מורידים את micropipette, הצללית של קצה micropipette יתבהר כפי שהוא מגיע אל המוקד. לפני micropipette נוגע הגרעין, להעלות את המוקד אובייקטיבית, ליישר את הטיפ micropipette עם גרעין (באותו x-y רביע, z-מישור גבוה יותר). להחזיר את הפוקוס בחזרה קו המשווה של הגרעין (A המטוס, איור 1B) ולהוריד בהדרגה את הטיפ micropipette.
14. ליצור חותם בין קצה micropipette את קרום גרעיני על ידי ניתוק הצינור אספקת לחץ מן המערכת microinjection, ובכך פותח בסוף הצינור micropipette לאווירה. שלב זה יוצר לחץ שלילי שווה ל- P_c על פני הגרעין.
15. לרכוש תמונות עם התוכנה אוסף תמונות מיקרוסקופ. הגדר של אבי-רכישה (וידאו) או nd-רכישה (תמונות) בתוכנה אוסף תמונות.
    הערה: עבור כל רכישת תוכנת הדמיה, להגדיר הדמיה וידאו בזמן אמת או רכישות תמונות בצילום מואץ עם מרווח זמן קצר.
16. לעבור כדי פלורסנט התואם הדמיה ערוץ (קרי, ה-GFP, RFP, וכו) ולהתחיל הדמיה.
17. לתרגם את הטיפ micropipette, והגוף של התא (מימין, איור 1B) עד לגרעין לניתוק מן micropipette.
    הערה: משוך את הקצה לאורך הכיוון-x חיובי (מימין עם שדה הראייה). הקצב מושך יכול להיות מתוכנת, נשלט על-ידי מחשב או הג'ויסטיק ניתן להעביר באופן ידני. לא נמצא כל מתאם בין הוצאת גרעיני דפורמציה¹⁵ מציע מענה בעיקר אלסטי לכפות וקצב.

3. ניתוח נתונים

1. לבצע ניתוח תמונות עם תוכנות עיבוד תמונה בסיסי זמינים. ניתן לכמת את מידת דפורמציה גרעיני על ידי המתח אורך (Ɛ) או המתח באזור (איור 1 א'). לכמת אורך המתח באמצעות משוואה 1, איפה L ו- L₀ מייצג את המרחק של הגרעין-דפורמציה מקסימלית ואת המיקום הראשוני, בהתאמה.
   (משוואת 1)

Results

איור 2A מראה שהאילוץ של גרעין פיברובלסט העכבר NIH 3T3. הטיפ micropipette מתורגם מימין, הגרעין מתעוות, בסופו של דבר לניתוק מהקצה micropipette. המתח אורך של הגרעין נתפסת להגדיל עם הגדלת כוח יניקה (איור 2B). הקצה הקדמי של הגרעין (micropipette משיכת הקצה) יוצר בליטה גרעינית, הקצה נגרר מעקורי ממיקומה המקורי. האורך של בליטה היא הרבה יותר גדולה מאשר העקירה בקצה (איור 2C), מציע שילוב הדוק בין הגרעין לבין הצי...

Discussion

מדידת השילוב מכני של הגרעין עם שלד התא היא אתגר עבור שיטות העדכנית ביותר, כמו השאיפה micropipette¹⁶, כי הם דורשים גם גרעינים בודדים (הגרעין איפה decoupled מ שלד התא) או הגרעינים מושעה תאים (היכן כוחות חוץ-תאית, כמו כוחות המתיחה, נעדרים). כוח הוחל את הגרעין על-ידי החלת זן biaxial תאים ו"היסטוריון^17,ממברנה¹⁸; עם זאת, טכניקה זו מוגבל על ידי העובדה כי הכוח על הגרעין אינו ידוע. כוח אטומי (AFM) מיקרוסקופיה הגששים שימשו כדי להסיט פנימה את הגרעין ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FluoroDish	WPI	FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	הופסק, דגם מקביל נוכחי: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	דגם נוכחי FemtoJet 4i
Plan טבילת שמן פלואור 40x	Nikon	NA
Apo TIRF טבילת שמן 60x	Nikon	NA
Donor Bovine Serum (DBS)	ThermoFisher 16030074 מדעי		NIH 3T3 סרום
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3
בינוני פניצילין-סטרפטומיצין	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 תוסף בינוני
שמן טבילה מסוג LDF ללא פלואורסצינג	Nikon	77007	שמן טבילה לעדשה אובייקטיבית