הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרופיל תאימות ביולוגית על Biomaterials עבור התחדשות העצם

12.6K צפיות

DOI:

10.3791/58077

16 בנובמבר 2018

במאמר זה

סיכום

המספר של הרומן biomaterials מתוכנן עבור תיקון גדול עצמות נגעים מתרחבת באופן רציף, במטרה לשפר את עצם ריפוי ולהתגבר על הסיבוכים עם השתלת עצם. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה רב תחומיים לניסויים קליניים הביו של biomaterials לתיקון העצם.

תקציר

שברים בעצמות, והמעלית גדול הם אתגר משמעותי בכירורגיה אורתופדית. למרות אוטומטי, שתלי עצם allogeneic מצוינים לריפוי פצעים כאלה, ישנם סיבוכים פוטנציאליים עם השימוש שלהם. לפיכך, מפתחים מדענים גשמי biomaterials סינתטי, מסתיימים כדי להתגבר על בעיות אלה. במחקר זה, אנו מציגים פלטפורמה רב תחומיים להערכת biomaterials לתיקון העצם. אנו משלבים מומחיות של ביולוגיה עצם ואימונולוגיה לפתח פלטפורמה כולל במבחנה אוסטאוקלסט (OC) ואת אוסטאובלסט (אבוב) מבחני ויוו העכבר מודלים של עצם תיקון, immunogenicity ו- allergenicity. נדגים כיצד לבצע את הניסויים, לסכם את התוצאות, ולדווח על הביו biomaterial. בפרט, בדקנו הכדאיות OB, בידול, ואת מינרליזציה ו OC הכדאיות ובידול בהקשר של β-tricalcium פוספט (β-TCP) דיסקים. בדקנו גם קצף (β-TCP/C) β-TCP/קולגן שהינו חומר זמין מסחרית בשימוש קלינית לתיקון עצם במודל של עכברים פגם קריטי בגודל העצם calvarial כדי לקבוע את ההשפעות על שלב מוקדם של עצם ריפוי. בניסויים מקבילים, הערכנו תגובות מערכת החיסון ו אלרגית בעכברים. הגישה שלנו יוצר פרופיל תאימות ביולוגית של biomaterial העצם עם מגוון של הפרמטרים הדרושים לניבוי את התאימות של biomaterials המשמש עבור עצם ריפוי ותיקון בחולים.

מבוא

תיקון העצם הוא תהליך מורכב זה מתחיל עם היווצרות שטף דם, דלקת, מתייבש היווצרות ובניה ואז1,2. עם זאת, פוטנציאל התחדשות העצם מוגבל לגודל של1,שבר עצם3. למשל, שברים בעצמות גדולים. הנגרם על ידי הטראומה, סרטן או אוסטיאופורוזיס לא יכול לרפא, מכונים שברים בעצמות, והמעלית. נגעים עצם לעיתים קרובות דורשים טיפול כדי לקדם את עצם בריאה פיזיולוגיים תיקון והתחדשות. כיום, השתלת עצם בשתל, להשתלת הוא הגישה של בחירה4 עם הליכי החלפת עצם 2.2 מיליון מדי שנה5. למרות הליכים אלה שיש אחוזי הצלחה גבוהים, ייתכנו סיבוכים, למשל, המוגבל ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים נעשו עם עכברים BALB/c בעקבות הנחיות כל טיפול, שימוש של חיות מעבדה של אוסטריה משרד חינוך, מדע ומחקר, אושרו על ידי ועדת האתיקה של משרד החינוך, המדע אוסטרי ומחקר.

1. תרבות העכבר הראשי אוב

  1. OB בידוד מן העכבר neonatal calvaria באמצעות עיכול אנזימטי
    1. המתת חסד בת 1-2 יום neonatal הגורים (60 סה כ) ע י עריפת ראשו ולמקם את ראשי בצלוחית עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    2. . תחזיק את הראש על ידי העורף של הצוואר, לחתוך את העור משם באמצעות מספריים סטרילי. פצעים וחתכים החילונית על ידי פירסינג זה (כ- 0.1 – 0.3 מ"מ) עם זוג מספריים ואז מוכנס מתחת החילונית בעורף בבסיס הגולגולת, גזור לאורך הקצה calvari....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך β-TCP עבור יעילותו כמו biomaterial לתיקון העצם, השתמשנו במבחנה , ויוו הקרנת שיטות. ראשית, אנחנו נמדדים OB התגובות הדיסקים β-TCP בהשוואה עם פקדים לבד בינוני בסיסית. איור 2 מדגים את הכדאיות OB בתגובה β-TCP דיסקים ב 7 ו 14 ימים של תרבות. תא הכדאיות נמדדת מתאי סמויה פעיל ב הבארות התרבות היה זהה עבור OBs בינונית בפלסטיק תרביות רקמה, כמו גם עם דיסקים β-TCP המציין biomaterial הזה זה לא שיפור ולא דיכוי התפשטות OB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מראים רב תחומית להערכה פרה של הביו עבור נציג biomaterials שפותחו עבור התחדשות העצם ותיקון. . בדקנו את התגובות של OBs, OCs, ומודל תגובת ריפוי vivo בפגם קריטי עצם עכברים, כמו גם בתוך חוץ גופית ו ויוו תגובות מערכת החיסון. אנחנו נועדו להדגים איך מבחני עבודה ולסכם את הנתונים והמסקנות הנגזרות בחינת biomaterials. אנו מראים כי האסטרטגיה שלנו יוצר פרופיל בעל ערך של עצם biomaterial הביו...

מבחני התא הראשי שימשו להערכת OB ו- OC. OBs אחראים עצם היווצרות ותיקון פיזיולוגי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

פרויקט מחקרי זה קיבל מימון תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם מס 263363.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דיסקים <חזקים>ביו-חומרים
&בטא;-טריקלציום פוספט (β-TCP, 14 מ"מ)דיסקים סונטרו בתנור עמום בטמפרטורה של 1150 מעלות צלזיוס. תיאור מפורט של הייצור ניתן למצוא ב-Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). הדגימות עברו קרינת UV (15 דקות לכל צד) לפני השימוש בתרביות תאים.
קצף Orthovita Vitoss (&בטא;-TCP/C)Orthovita2102-1405
<חזק>תרבית אוסטאובלסטים של עכבר
Alizarin RedS Sigma-AldrichA5533
ALP מאגר בדיקה (2x) pH 10.4ממיסים 200 מ"מ גליצין, 2 מ"מ מגנזיום כלוריד, 2 מ"מ אבץ כלוריד במים אולטרה-טהורים ומתאימים ל-pH 10.
מדיום גידול עצם (BGM)& אלפא;-MEM + 10% FBS מומת בחום + 1% פניצילין/סטרפטומיצין
מאגר ליזה של תאים: מאגר ליזה של תאים CyQuant תרכיז פי 20Thermo ScientificC7027לדלל את מלאי מאגר הליזה של התאים המרוכזים פי 20 במים טהורים במיוחד.
מגיב כדאיות התאים: מגיב כדאיות התאים הכחולים של פרסטוInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
קולגנאז מסוג IV מ- clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
ערכת בדיקת חלבון DC IIBio Rad5000112DC מכילה מגיב A, מגיב B, מגיב S ו- BSA לתקן הייחוס. עבור מגיב A', הוסף 20 ומיקרו; מגיב L S עד 1000 ומיקרו; מגיב L A. 
דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD8418מסנן סטרילי DMSO לפני השימוש. 
Dispase II (פרוטאז ניטרלי, דרגה II)פוספטאז של Roche
EnzCheck לפעילות פוספטאז אלקליין Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck ערכת בדיקת פוספטאז מכילה 6,8-דיפלואורו-4-מתילומבליפריל פוספט (DiFMUP), N,N-דימתילפורממיד ו-6,8-דיפלואורו-7-הידרוקסי-4-מתילקומרין (DiFMU). 
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichF7524
תמיסת פורמלין ניטרלית חומצה 10%סיגמא-אולדריץ'HT501128
גליציןסיגמא-אולדריץ'G8898
הקסדסצילפירדיניום (צטילפירידיניום) כלוריד מונוהידרטסיגמא-אולדריץ'C9002
חומצה L-אסקורבית 2-פוספט ססקימגנזיום מלח הידרטSigma-AldrichA8960
מגנזיום כלוריד הקסהידרטSigma-AldrichM2670
MEM אלפא בינוני (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
מדיום מינרליזציה אוסטאוגני (MM)ואלפא;-MEM + 10% FBS מומת בחום + 1% פניצילין-סטרפטומיצין + 50 ומיקרו; גרם/מ"ל חומצה אסקורבית + 5 מ"מ ובטא;-גליצרופוספט
פניצילין-סטרפטומיצין   Sigma-AldrichP4333
תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054לדלל את תמיסת המלאי המרוכז פי 10 ב-1x PBS.
Tween20Sigma-AldrichP1379
מים טהורים במיוחד: תרבית תאים ללא פירוגןVWRL0970-500
מאגרהוסף  0.05% Tween20 עד 1x PBS.
אבץ כלורידסיגמא-אולדריץ'1.08816
&בטא;-גליצרופוספט דיסודיום מלח הידרטסיגמא-אולדריץ'G5422
צלחת תרבית השעיה 24 בארותגריינר ביו-אחד662102
24 בארות צלחת תרבית רקמותגריינר ביו-אחד662160
50 מ"ל צינור חרוטיגריינר ביו-אחד227261
96 בארות צלחת שחורהGreiner bio-one655076
96 בארות צלחת שקופהGreiner bio-one655001
צנטריפוגה: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Incubator: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 מ"לGreiner bio-one122263
יחידת מסנן חד פעמית FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200לסינון סטרילי של תמיסת אנזים.
סורק שטוח: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro קורא מיקרו-פלטותTecan
צינור מיקרוצנטריפוגה: צינור אפנדורף מנעול בטוח 0.5 מ"לVWR20901-505
צינור מיקרוצנטריפוגה: מנעול כספת צינור אפנדורף 1.5 מ"לVWR21008-959
החלקת שייקר (מסלולית ואופקית) אדמונד בוהלר 
חממת טלטול GFL3032GFL 3032
פיפט חד פעמי: סרום פיפטגריינר ביו-וואן612301
מכשירים סטריליים (מספריים, פינצטה, מלקחיים מעוקלים)
צלחת תרבית רקמות (10 ס"מ)גריינר ביו-וואן664960
<חזק>עכבר אוסטאובלסט-אוסטאוקלסט קו-תרבית
1&אלפא;,25- דיהידרוקסיויטמין D3סיגמא-אולדריץ'17936מלאי מרוכז פי 1000 (10 ומיקרו; M באתנול 100%)
אצטוןVWR כימיקלים22065.327
מדיום צמיחת עצם (BGM)ואלפא;-MEM + 10% FBS מומת בחום + 1% פניצילין-סטרפטומיצין
מים מזוקקיםקארלרוט 3478.4
אתנול (100% נפח/נפח)VWR כימיקלים20821.365
אתנול (70% נפח/נפח)כימיקליםVWR93003.1006
LB סגול אדום מהירSigma-AldrichF3381
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichF7524
תמיסת פורמלין ניטרלית חוצצת 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM אלפא בינוני (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-דימתילפורממידסיגמא-אולדריץ'D4551
נפתול AS-MX פוספטסיגמא-אולדריץ'N4875
מדיום התמיינות אוסטאוקלסט (DM)ואלפא;-MEM + 10% FBS מומת בחום + 1% פניצילין-סטרפטומיצין + 1 ננומטר 1,25-(OH)2-ויטמין D3 + 1 ומיקרו; M פרוסטגלנדין E2 
פניצילין-סטרפטומיצין Sigma-AldrichP4333
תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
10010023 פרוסטגלנדין E2 (PGE2)חברת קיימן כימיקלים9003016מלאי מרוכז פי 1000 (1 מ"מ באתנול 100%)
נתרן אצטט טריהידרטסיגמא-אולדריץ'S7670
נתרן טרטרט די-בסיסי דיהידראטסיגמא-אולדריץ'S8640
מכשירים סטריליים (מספריים, מלקחיים, אזמל)
TRAP חוצץ pH 5.0ממיסים 40 מ"מ נתרן אצטט, 10 מ"מ נתרן טרטרט במים טהורים במיוחד ומתאימים ל-pH 5.
מים טהורים במיוחד: תרבית תאים מים ללא פירוגןVWRL0970-500
24 בארות צלחת תרבית מתלהגריינר ביו-וואן662102
24 בארות צלחת תרבית רקמותגריינר ביו-וואן662160
50 מ"ל צינור חרוטיגריינר ביו-וואן227261
צנטריפוגה: VWR מגה כוכב 600RVWR
חממת CO2: HeraCell 240Thermo Scientific
להב פרוסות יהלום (10.2 ס"מ x 0.3 ס"מ)Buehler
Isomet מסור במהירות נמוכהצלחת פטרי Buehler
(6 ס"מ)Greiner bio-one628,161
בקבוק זכוכית מכסה בורג 20 מ"לCarl RothEXY4.1
מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"להנרי Schein Animal Health9003016
פיפט לשימוש חד פעמי: סרום פיפטגריינר ביו-וואן612301
מחט סטרילית: מחט היפודרמית RW 27 G x 3/4''Henry Schein Animal Health9003340
<חזק>מודל פגם קלוריאלי של עכבר
משכך כאבים: בופרנורפין (Bupaq)Richter Pharma AG
הרדמה: קטמין (קטמידור), קסילזין (רומפון)ריכטר פארמה AG/Bayer HealthCare
סטרילנט קר: Safesept MaxHenry Schein בריאות בעלי חיים9882765
אתנול (70% נפח/נפח)VWR Chemicals93003.1006
משחת עיניים: VitA POS 5 גרםUrsapharm
תמיסת מלח רגילה (0.9% תמיסת נתרן כלוריד)Fresenius Kabi
Phosphate-buffered מלח 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
תמיסת יוד פובידון: בראונול 1000 מ"לB. בראון3864154
רוטי-היסטופיקס 4.5% פורמלין חומציקארל רוט2213.6
דבק רקמות: היסטואקריל 5 x 0.5 מ"ל ב. בראון כירורגי1050060
ציוד מגן אישי: כפפות כירורגיות, כובע ומסכה, שמלההנרי שיין לבריאות בעלי חיים1045073, 1026614, 9009062 370406
מכשירים סטריליים (אזמל, מספריים, מלקחיים, מחזיק מחט)
מחטים סטריליות: מחטים היפודרמיות RW 27 G x 3/4 אינץ' ו-30 G x 1/2'' Henry Schein Animal Health9003340, 9003630
מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"לHenry Schein Animal Health9003016
צלחת חימום: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
ספוגיות גזה סטריליותHenry Schein Animal Health220192
אזמל חד פעמי סטרילי (איור 20)Henry Schein Animal Health9008957
מקדחה כירורגית/דנטלית: מושתל SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
ידית מסוג S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
טרפין, קוטר 4 מ"מHager& Meisinger GmbH229040
סט צינורות השקיה 2.2 מ'W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
מעלית Periosteal 2 מ"מ / 3 מ"מHenry Schein Animal Health472683
תפר שאינו נספג: ירוק פוליאסטר, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 ס"מHenry Schein Animal Health300715
in vitro תגובות חיסוניות
הרדמה להמתת חסד: קטמין (קטמידור), קסילזין (רומפון)ריכטר פארמה AG/Bayer HealthCare
התפשטות תאים ELISA, ערכת בדיקה BrdU (קולורימטרי)Sigma-Aldrich11647229001הערכה מכילה תמיסת תיוג BrdU, תמיסת קיבוע (FixDenat), תמיסת נוגדנים נגד BrdU, מאגר כביסה ותמיסת מצע.
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
תרבית טחולRPMI בינוני + 10% FBS מומת בחום + 1% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין + 0.1% גנטמיצין + 0.2% ß-מרקפטואתנול + 1% חומצות אמינו לא חיוניות
אתנול (70% נפח/נפח)VWR Chemicals93003.1006
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& נ.ב.פ;
ג'נטמיציןגיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק 
עכבר 15750037 IL-1β אליסה מוכנה-סט-צא לדרך!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
עכבר IL-2 ELISA MAX עכבר431001BioLegend
IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Mouse INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותGibco, Thermo Fisher Scientific 
פניצילין-סטרפטומיצין גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק 
תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC): BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 medium, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
&בטא;-מרקפטואתנולג'יבקו, תרמו פישר סיינטיפיק 
31350010 צינור חרוטי 50 מ"לגריינר ביו-וואן227261
צלחת תרבית רקמות 96 בארותגריינר ביו-וואן655180
צנטריפוגה: מסננת תאים VWR Mega Star 600RVWR
40 ומיקרו; mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro קורא מיקרו-פלטותTecan
מזרק סטרילי לשימוש חד פעמי 1 מ"להנרי שיין 9003016
מכשירים כירורגיים סטריליים (מלקחיים, שקופיות זכוכית)
<חזק>דגם תוך-צפקי תפוקה גבוהה
הרדמה: קטמין (קטמידור), קסילזין (רומפון)ריכטר פארמה AG/Bayer HealthCare
סטרילנט קר: Safesept MaxHenry Schein בריאות בעלי חיים9882765
אתנול (70% נפח/נפח)VWR Chemicals93003.1006
משחת עיניים: VitA POS 5 גרםעכבר אורספארם
IL-1β אליסה מוכנה-סט-צא לדרך!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
עכבר IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Phosphate-buffered Salt 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
תמיסת יוד פובידון: Braunol 1000 מ"לB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff ערכת צביעהThermo Scientific9990700לספירת תאים דיפרנציאלית.
צלחת חימום: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hemocytometer: תא נויבאוארCarl RothPC72.1
תפר שאינו ניתן לספיגה: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
תפר נספג: PolysorbCovidienSL-5628
צנטריפוגה שנדון לציטופסיןThermo Scientific
מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"להנרי שיין בריאות בעלי חיים9003016
ספוגיות גזה סטריליותהנרי שיין בריאות בעלי חיים220192
מחטים סטריליות: מחטים היפודרמיות RW 27 G x 3/4 אינץ' ו-25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
מכשירים כירורגיים סטריליים (אזמל, מספריים, מלקחיים, מחזיק מחטים)
תמיסה כחולה טריפאן 0.4%גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק 15250061
<דגם תת עורי חזק>תת כרוני
הרדמה: קטמין (קטמידור), קסילזין (רומפון)ריכטר פארמה AG/Bayer HealthCare
סטרילנט קר: SafeSep MaxHenry Schein בריאות בעלי חיים9882765
אתנול (70% נפח/נפח)VWR כימיקלים93003.1006
משחת עיניים: VitA POS 5 גרםUrsapharm
Phosphate-buffered מלח 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
תמיסת יוד פובידון: בראונול 1000 מ"לB. בראון3864154
רוטי-היסטופיקס 4.5% פורמלין חוצץקארל רוט2213.6
פלטת חימום: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
תפר שאינו נספג: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
ציוד מגן אישי: כירורגי כפפות, כובע ומסכה, שמלההנרי שיין 1045073 בריאות בעלי חיים, 1026614, 9009062, 370406
מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"להנרי שיין בריאות בעלי חיים9003016
ספוגיות גזה סטריליותהנרי שיין בריאות בעלי חיים220192
מכשירים סטריליים (אזמל, מספריים, מלקחיים, מחזיק מחט)
מחט סטרילית: מחטים היפודרמיות RW 27 גרם x 3/4 אינץ' הנרי שיין 9003340 לבריאות בעלי חיים, 420939
ערכת בדיקת חלבון ערכת בדיקת 4942078001 10010023 כביסה מלח 10010023 בינוני 10500064סטנדרטי 111400501514012210010023לבריאות בעלי חיים1001002310010023

מקורות

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Alizarin Red SBeta Tricalcium PhosphateIn VitroIn Vivo