הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרופיל תאימות ביולוגית על Biomaterials עבור התחדשות העצם

12.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58077

⸱

16 בנובמבר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

במאמר זה

סיכום

המספר של הרומן biomaterials מתוכנן עבור תיקון גדול עצמות נגעים מתרחבת באופן רציף, במטרה לשפר את עצם ריפוי ולהתגבר על הסיבוכים עם השתלת עצם. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה רב תחומיים לניסויים קליניים הביו של biomaterials לתיקון העצם.

תקציר

שברים בעצמות, והמעלית גדול הם אתגר משמעותי בכירורגיה אורתופדית. למרות אוטומטי, שתלי עצם allogeneic מצוינים לריפוי פצעים כאלה, ישנם סיבוכים פוטנציאליים עם השימוש שלהם. לפיכך, מפתחים מדענים גשמי biomaterials סינתטי, מסתיימים כדי להתגבר על בעיות אלה. במחקר זה, אנו מציגים פלטפורמה רב תחומיים להערכת biomaterials לתיקון העצם. אנו משלבים מומחיות של ביולוגיה עצם ואימונולוגיה לפתח פלטפורמה כולל במבחנה אוסטאוקלסט (OC) ואת אוסטאובלסט (אבוב) מבחני ויוו העכבר מודלים של עצם תיקון, immunogenicity ו- allergenicity. נדגים כיצד לבצע את הניסויים, לסכם את התוצאות, ולדווח על הביו biomaterial. בפרט, בדקנו הכדאיות OB, בידול, ואת מינרליזציה ו OC הכדאיות ובידול בהקשר של β-tricalcium פוספט (β-TCP) דיסקים. בדקנו גם קצף (β-TCP/C) β-TCP/קולגן שהינו חומר זמין מסחרית בשימוש קלינית לתיקון עצם במודל של עכברים פגם קריטי בגודל העצם calvarial כדי לקבוע את ההשפעות על שלב מוקדם של עצם ריפוי. בניסויים מקבילים, הערכנו תגובות מערכת החיסון ו אלרגית בעכברים. הגישה שלנו יוצר פרופיל תאימות ביולוגית של biomaterial העצם עם מגוון של הפרמטרים הדרושים לניבוי את התאימות של biomaterials המשמש עבור עצם ריפוי ותיקון בחולים.

מבוא

תיקון העצם הוא תהליך מורכב זה מתחיל עם היווצרות שטף דם, דלקת, מתייבש היווצרות ובניה ואז1,2. עם זאת, פוטנציאל התחדשות העצם מוגבל לגודל של1,שבר עצם3. למשל, שברים בעצמות גדולים. הנגרם על ידי הטראומה, סרטן או אוסטיאופורוזיס לא יכול לרפא, מכונים שברים בעצמות, והמעלית. נגעים עצם לעיתים קרובות דורשים טיפול כדי לקדם את עצם בריאה פיזיולוגיים תיקון והתחדשות. כיום, השתלת עצם בשתל, להשתלת הוא הגישה של בחירה4 עם הליכי החלפת עצם 2.2 מיליון מדי שנה5. למרות הליכים אלה שיש אחוזי הצלחה גבוהים, ייתכנו סיבוכים, למשל, המוגבל של העצם, זיהום, תורם אתר תחלואה ודחייה4. חלופות חדשות עבור הנדסת רקמות העצם להיות מתבקשות לטפל באתגרים אלה.

העיצוב של biomaterials המבוססת על פולימרים טבעיים או סינתטיים, bioceramics או מתכות בשילוב עם תאים ומולקולות ביואקטיביות הוא על עלייתו6. ההבנה הנוכחית שלנו של עצם פיזיולוגיים הילינג וריפוי בהקשר של biomaterials תלוי גורמים רבים כגון תכונות מכניות גורמים המקומי ומערכתית מרובים כולל תאים זרימת הדם ואת האתר שבר7 8, ,9. Biomaterials עבור התחדשות העצם שואפת לקדם את osteogenicity ואת פונקציונלי אורתופדיים10 והם אידיאלי מסתיימים, מתכלה, נקבובי (קידום נדידת תאים, חמצן וחומרים מזינים). הם גם צריכים להיות חזק מספיק כדי לתמוך באתר שבר להקל על כאבים. בנוסף, גורמים דלקתיים נדרשים כדי להתחיל את תהליך הריפוי. עם זאת, אם biomaterial גורם דלקת מופרזת ותגובות אלרגיות, זה עלול להגביל או לעכב את עצם ריפוי11,12. לפיכך, הבינתחומיות יש צורך להעריך biomaterials שפותחו עבור תיקון עצם.

במחקר זה, אנו מציגים הערכה טרום קליניים של חומרים נציג, 1) Orthovita Vitoss קצף המהווה תחליף שתל עצם ספוגית זמינים מסחרית המורכב tricalcium פוספט המורכב בגודל ננומטר טהור β-tricalcium חלקיקים פוספט (β-TCP), סוג 1, קולגן (C) (β-TCP/C קצף) ו- 2) β-TCP דיסקים. . כאן, אנחנו להמחיש הביו בדיקה של אלה biomaterials באמצעות ראשי אוסטאובלסט (אבוב), אוסטאוקלסט (OC) assays, מודל ויוו של עצם תיקון, הערכה אימונולוגי הכוללת במבחנה לימפוציטים-T התפשטות ו ייצור ציטוקינים, ויוו immunogenicity, allergenicity, כפי שדווחה בעבר13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים נעשו עם עכברים BALB/c בעקבות הנחיות כל טיפול, שימוש של חיות מעבדה של אוסטריה משרד חינוך, מדע ומחקר, אושרו על ידי ועדת האתיקה של משרד החינוך, המדע אוסטרי ומחקר.

1. תרבות העכבר הראשי אוב

  1. OB בידוד מן העכבר neonatal calvaria באמצעות עיכול אנזימטי
    1. המתת חסד בת 1-2 יום neonatal הגורים (60 סה כ) ע י עריפת ראשו ולמקם את ראשי בצלוחית עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    2. . תחזיק את הראש על ידי העורף של הצוואר, לחתוך את העור משם באמצעות מספריים סטרילי. פצעים וחתכים החילונית על ידי פירסינג זה (כ- 0.1 – 0.3 מ"מ) עם זוג מספריים ואז מוכנס מתחת החילונית בעורף בבסיס הגולגולת, גזור לאורך הקצה calvarial רוחבית מאחורה לקדימה מעל האוזניים ולאחר מכן abov e גשר האף (איור 1).
    3. דגירה calvaria ביתור עם 8 מ של מסנן לעקר עיכול פתרון (300 יחידות/mL collagenase הסוג הרביעי ו יחידות/mL 2.14 dispase II מומס α-מינימום הכרחי בינוני (α-מם)) צינור חרוטי 50 מ ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב חממה חזק ב 200 שייקס /min.
    4. למחוק את תגובת שיקוע הראשון וחזור על הליך העיכול שלוש פעמים עם 8 מ של פתרון מערכת העיכול. לאסוף את תגובת שיקוע המכילות את התאים לאחר כל שלב העיכול ולהוסיף אותו צינור חרוטי 50 מ. לאחסן את הצינור חרוט 50 מ עם תאי באמבט מים קרים עד להשלמת ההליך עיכול (כ 40 דקות).
    5. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע (עם פיפטה פסטר המצורפת משאבת ואקום) ו resuspend ב 40 מ"ל של מדיום הגידול עצם (בגמ) המכיל α-מ עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS), ו- 1% פניצילין-סטרפטומיצין פתרון. לאחר מכן להוסיף 10 מ של התליה תא תרביות רקמה 4 צלחות (10 ס מ).
    6. התרבות התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד למפגש (2-3 ימים).
    7. הנהרות, תשאף המדיום הישן, לשטוף צלחות תרביות רקמה פעם עם 1 x PBS (37 מעלות צלזיוס). לאחר מכן וארוקן את PBS, להוסיף 2 מ"ל של פתרון טריפסין 1 x המכילה 0.5% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כל צלחת תרביות רקמה של 10 ס מ.
    8. דגירה הלוחות תרבות 4-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5 דקות ולאחר מכן בדוק את הצלחות עם מיקרוסקופ אור הפוך כדי להבטיח כי התאים ינותקו מעמוד הפלסטיק. ואז להעביר תא כל המתלים (סה כ 8 מ ל) צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של בגמ טריים. לשטוף כל צלחת עם 5 מ ל בגמ ורענן העברת הצינור חרוט באותה 50 מ.
    9. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend התאים מ 16 ל בגמ טריים. להכין 16 10 ס מ תרביות רקמה את לוחיות הרישוי (פיצול 1:4) המכיל 9 מ ל בגמ. להוסיף 1 מ"ל של התליה תא כל צלחת.
    10. חזור על שלבים 1.1.6. כדי 1.1.8.
    11. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב- 10 מ"ל של בגמ טריים. לספור את התאים ולחשב את הריכוז התא.
      הערה: הליך זה יוצר כ 7.5-8.3 x 105 תאים/גור.
    12. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend קפואים בינוני המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), 40% α-מ ו- 50% FBS. העברה 1.5 מ של התליה תא cryovials 2 mL עבור סכום כולל של 2 x 106 תאים לכל מבחנה.
    13. פלאש להקפיא את הבקבוקונים של חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך בתוך מיכל חנקן נוזלי. השתמש בתאים תוך שנה אחת כדי להבטיח פונקציונליות מלאה. להשתמש אלה OBs העיקרי להערכת תפוצת (שלב 1.2), בידול (ALP מבחני: שלב 1.4., 1.5.) ואת מינרליזציה (שלב 1.6.) בנוכחות biomaterials. השתמש תאים אלה ההבשלה של עצם מח-נגזר מבשרי OC בתרבות שיתוף (שלב 2.3).
  2. OB התפשטות assay
    1. מראש דגירה 14 מ"מ קוטר β-TCP דיסקים 1 מ"ל של בגמ צלחת תרבות ההשעיה. ובכן 24-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 24 שעות לפני הוספת ראשי לוחות תרביות רקמה סטנדרטי תשיג לשימוש עבור פקדים, ההשעיה תרבות עומדי הדגימות biomaterial כדי הימנע תא שיצורפו לפלסטיק.
    2. האחות המדיום הדגירה מראש, ואז resuspend העכבר הראשי OBs ב בגמ. להוסיף 4.4 x 10 ס מ/OBs4 2 על גבי הדיסקים מראש מודגרות β-TCP בצלחת תרבות ההשעיה 24-ובכן, עבור קבוצת בקרה, לתוך צלחת 24-ובכן תרביות רקמה (1 מ"ל/טוב). OBs לצרף את הצלחת תרביות רקמה או את biomaterial.
    3. תקופת דגירה של 14 ימים-CO 37 ° C ו-5%2. במהלך תקופת דגירה, שינוי המדיום כל 2-3 ימים ולהוסיף 1 מ"ל של בגמ טריים מכל קידוח.
    4. כדי להעריך את התפשטות OB, להעביר את הדיסקים β-TCP בימים 7 ו-14 בארות חדשות כדי לא לכלול את האותות התאים גדל על הצלחת תרבות ההשעיה.
    5. האחות המדיום הישן, להוסיף 0.5 מ ל בגמ (37 מעלות צלזיוס), דגירה הלוחות תרבות למשך 30 דקות-CO 37 ° C ו- 5%2. לאחר מכן להוסיף µL 55 של 10 x ריאגנט התפשטות תאים (1:10 דילול) ישירות לתוך התרבות היטב. עבור תאים ריקים, מכינים משלוש בארות המכילה 0.5 מ ל בגמ ו µL 55 מהתרכובת התפשטות תאים 10 x. דגירה כל הצלחות במשך 30 דקות-CO 37 ° C ו-5%2.
    6. לסגת, להעביר µL 150 של תגובת שיקוע מכל קידוח לתוך צלחת שחורה 96-ובכן ולקרוא זריחה עם עירור ב 560 nm, פליטה-590 ננומטר. להחסיר את הקריאות ריק מן המקראות מדגם.
  3. מבחני הבידול והיתרון מינרליזציה אוב
    1. מראש דגירה 14 מ"מ קוטר β-TCP דיסקים 1 מ"ל של בגמ צלחת תרבות ההשעיה. ובכן 24-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 24 שעות לפני הוספת הלוחות תרביות רקמה סטנדרטי תשיג לשימוש עבור פקדים, ההשעיה תרבות עומדי הדגימות biomaterial להימנע תא שיצורפו לפלסטיק.
    2. האחות המדיום הדגירה מראש, ואז resuspend העכבר הראשי OBs ב בגמ. להוסיף 8.8 x 10 ס מ/OBs4 2 על גבי הדיסקים מראש מודגרות β-TCP בצלחת תרבות ההשעיה 24-ובכן, עבור קבוצת בקרה, לתוך צלחת 24-ובכן תרביות רקמה (1 מ"ל/טוב). OBs לצרף את הצלחת תרביות רקמה או המדגם biomaterial.
    3. החלף את בגמ 1 מ"ל של מינרליזציה osteogenic בינוני (מ מ) המכיל בגמ, 50 חומצה אסקורבית µg/mL, 5 מ מ β-glycerophosphate 24 שעות לאחר התוספת של מכשול, תקופת דגירה של 14 ימים-CO 37 ° C ו-5%2. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים עם 1 מ"ל של מ מ שזה עתה הוכנו מכל קידוח.
  4. בידול OB מוערך על ידי פעילות פוספטאז אלקליין (ALP) מתא lysates
    1. למדידת פעילות ALP ביום 7 לאחר התוספת של מ מ, תשאף המדיום תרבות מן הבארות ולאחר מכן לשטוף עם 1 מ"ל של PBS סטרילי x 1 (37 מעלות צלזיוס). בזהירות מחוק לגמרי מגניב כדי לאפשר את התאים המצורף כדי להישאר על תרביות רקמה פלסטיק או biomaterial ומקפיאים את הצלחות ב- 80 ° c
    2. לאחר 24 שעות (או עד שבועיים), להפשיר את הבקרה תרביות רקמה צלחת וצלחת biomaterial ההשעיה התרבות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להתכונן OB פירוק. עבור הדגימות biomaterial, להעביר את הדיסקים β-TCP לתוך צלחת חדשה של תרבות ההשעיה כדי לא לכלול את התאים מחובר לצלחת. להוסיף µL 75 לכל טוב 1 x תא פירוק מאגר שתי צלחות. לנער את הצלחות במשך 5 דקות על מטרף ב 400 שייקים/דקה.
    3. להעביר את התא lysate לתוך צינור microcentrifuge 0.5 mL צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 6 דקות ב RT להסיר את הלכלוך. להוסיף 50 µL של תגובת מדגם של lysate תא שיקוע צלחת שחורה 96-ובכן, ולאחר מכן להוסיף 50 µL של פתרון בהיקף של 200 מיקרומטר פוספט 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl (DiFMUP) fluorogenic המצע מומס 2 x מאגר ALP (pH 10) לכל טוב. להגדיר את שתי בארות ריק עם 100 µL של פתרון 1:1 המכיל מאגר של פירוק התא x 1 ו- 2 x ALP מאגר.
    4. הכנת סטנדרטים 8 עם 100 μL טוב עם 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) ועד 0.5 μM 200 מומס ב- 1:1 פתרון המכיל מאגר של פירוק התא x 1 x 2 ALP מאגר ליצירת עיקול רגיל הפניה.
    5. דגירה לוח שחור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן קרא את זריחה עם עירור ב 358 nm, פליטה-455 ננומטר. להחסיר את קריאות ריק מכל הסטנדרטים הפניה ובחומר מדגם.
    6. לנרמל את הפעילות האנזים ALP מתוך lysates התא כדי הסכום הכולל של חלבון שימוש assay ערכי צבע מוחלטים של ריכוז חלבון. להכין שור אלבומין (BSA) סטנדרטים חלבון בטווח מ 0.05 – 2.5 µg/µL מומס 1 x תא מאגר פירוק ליצירת עיקול רגיל.
    7. להכין את דגימת תאים lysates BSA חלבון סטנדרטים כפולים. להוסיף 5 µL של התא מדגם lysate או µL 5 של BSA חלבון סטנדרטית לתוך צלחת 96-ובכן ולאחר מכן להוסיף 25 µL של ריאגנט A' ו- µL 200 של ריאגנט B. קבע את שתי בארות ריק עם µL 5 1 x מאגר פירוק התא. דגירה הצלחות ב- RT למשך 15 דקות ולאחר מכן קרא את ספיגת-690 ננומטר. להחסיר את קריאות ריק מכל הסטנדרטים הפניה ובחומר מדגם.
  5. בידול OB מוערך על ידי צביעת ALP בתרבות תא
    1. כתם ALP ב- OBs בתרבית ביום 7 לאחר התוספת של מ מ על צלחת תרביות רקמה שליטה, את biomaterial בצלחת תרבות ההשעיה.
    2. האחות המדיום תרבות מן הבארות ולהחליף אותו עם 0.5 מ ל 1 x PBS (37 מעלות צלזיוס). מחוק לגמרי מגניב ולתקן את התאים על ידי המקננת בהם ב- 0.5 מ ל 10% buffered פורמלין-RT עבור 1 דקות.
    3. האחות של פורמלין 10% באגירה מלאה עם pipet לשימוש יחיד ולהוסיף 0.5 mL שטיפת מאגר (0.05% Tween20 ב 1 x PBS).
    4. להמיס טבליה המצע tetrazolium (BCIP/NBT) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl פוספט/ניטרו כחולה אחת ב 10 מ"ל של מים הנדסה גנטית, מערבולת עד התפרקה לחלוטין. הפתרון חייב להיות מוגן מפני אור ומשמשים בתוך שעתיים.
    5. תשאף המאגר לשטוף, להחליף 0.5 מ של BCIP/NBT המצע פתרון, דגירה הצלחת ב RT בחושך במשך 10 דקות לשאוב את הפתרון מכתימים ולהחליף עם 0.5 מ של מאגר לשטוף.
    6. להעביר את הדיסקים β מוכתם-TCP לתוך באר חדשה ולסרוק את הצלחות שהוכתמו ALP עם סורק גרר קונבנציונליות כדי להכתים ALP הרשומה.
  6. OB מינרליזציה מוערך על ידי צביעת עם S אדום Alizarin (ARS)
    1. תשאף המדיום תרבות מן הבארות המכיל העיקרי OBs 14 ימים לאחר התוספת של מ מ, לשטוף פעמיים עם 0.5 מ ל 1 x PBS ב RT. וביופסיה של PBS ותקן את התאים על-ידי הוספת 0.5 מיליליטר 10% buffered פורמלין פתרון ב RT 10 דקות.
    2. האחות של פורמלין 10% באגירה מלאה עם pipet לשימוש יחיד ולשטוף פעמיים עם 0.5 מיליליטר מים הנדסה גנטית.
    3. כדי מכשול קבוע, להוסיף 0.25 mL של 40 מ מ ARS מכתימים פתרון (pH 4.2) מומס במים הנדסה גנטית, דגירה את הצלחת ב RT למשך 10 דקות על מטרף-שייק 100/min.
    4. האחות הפתרון מכתימים עם pipet לשימוש יחיד ולשטוף עם 1 מ ל מים הנדסה גנטית. חזור על צעד זה 5-10 פעמים כדי להסיר לא ספציפי מכתים.
      הערה: הפתרון השטיפה צריך להיות ללא צבע.
    5. האחות המים הנדסה גנטית ולהוסיף 1 מ"ל של PBS קר. דגירה את הצלחת ב RT למשך 10 דקות על מטרף-שייק 100/min.
    6. מחוק לגמרי מגניב, להעביר את הדיסקים β מוכתם-TCP באר חדשה ולסרוק את הצלחות עם סורק משטח אופקי כדי להקליט מינרליזציה.
    7. הוסף 0.25 mL של 10% cetylpyridinium פתרון כלוריד, דגירה את הצלחת ב RT למשך 15 דקות על מטרף ב 100 שייקים/דקה כדי לחלץ את צבען ארס.
    8. להעביר את supernatants צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה ב 17,000 x g למשך 5 דקות ב- RT.
    9. להוסיף 10% cetylpyridinium פתרון כלוריד תמציות עם יחס דילול של 1:10 – 1:20 ולהוסיף את הדגימות (300 µL) לתוך צלחת 96-ובכן כולל שתי בארות ריק המכיל רק 10% cetylpyridinium כלוריד.
    10. להכין 7 סטנדרטים הפניה של ארס, החל 4 מיקרומטר 400 על ידי דילול של ארס 40 מ מ מכתים פתרון (pH 4.2) עם 10% cetylpyridinium כלוריד פתרון ליצירת עיקול רגיל.
    11. הוסף µL 300 של תקן התייחסות למצב שבו כפילויות לצלחת 96-ובכן.
    12. לקרוא את ספיגת של הדגימות, כדורי סרק, וההתייחסות סטנדרטים-520 ננומטר.
    13. להחסיר את קריאות ריק מכל הסטנדרטים הפניה ובחומר מדגם.

2. העכבר OB-OC תרבות משותפת להפיק OCs בוגרת

  1. הכנה ועיקור של פרוסות שור קליפת העצם שקצרנו
    1. לנקות חלקי עצם הרקמה שמסביב ולהסיר את עצם trabecular, מח עצם.
    2. יבש את העצם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    3. לחתוך את העצם לתוך חתיכות קטנות וקאט לפרוסות (כ 300-350 מיקרומטר עבה) באמצעות מהירות נמוכה ראה עם להב היהלום.
    4. חותכים את הפרוסות מיקרומטר 300-350 דיסקים ריבועית (1 ס מ2).
    5. כדי לנקות את הדיסקים עצם (1 ס מ2), לשים אותם לתוך בקבוקון זכוכית לנעילה מילוי עם מים מזוקקים. להעביר את המבחנה זכוכית מלא לתוך באמבט אולטרא, sonicate עבור 5 דק. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    6. יוצקים את המים מזוקקים, להוסיף 70% אתנול, sonicate במשך 5 דקות.
    7. יוצקים את האתנול 70% והחלף 100% אתנול.
      הערה: אחסן את הפרוסות עצם 100% אתנול ב 4 ° C עד 4 שבועות.
    8. להאיר את הפרוסות עצם עם אור UV למשך 15 דקות בכל צד בתנאים סטריליים. לאחסן את הפרוסות סטיריליים עצם צלחת תרבות סטרילי-RT עד שימוש נוסף.
  2. בידוד של מח העצם OC מבשרי
    1. המתת חסד תמים שבוע 8 – 12 BALB/c עכברים באמצעות זריקה בקרום הבטן (i.p.) של פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים.
    2. לבודד את מבשרי OC מח עצמות הירך העכבר ו tibiae.
    3. להסיר את הרגליים עם מספריים סטרילי הנקודה הקרובה ביותר לגוף-מפרק הירך, חותכים את הגפיים המפרקים בברך ובקרסול ולהסיר הרקמות הרכות עם האזמל סטרילי וחדים. לחתוך את epiphyses. לשטוף, להשעות את מח העצם עם 1 מ ל בגמ לתוך 6 ס מ עקר פטרי באמצעות מחט 27G המצורפת מזרק 1 מ"ל לקבל השעיה התא.
    4. להוסיף התליה תא צינור חרוטי 50 מ ל, לשטוף את 6 ס מ צלחת פטרי עם 5 מ ל בגמ ואת העברת הצינור חרוט באותה 50 מ. צנטריפוגה ב x 350 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק Resuspend התאים OC בידול בינוני (DM) המכילים בגמ, 1 nM 1,25-(OH)2-ויטמין D3 ו- 1 מיקרומטר פרוסטגלנדין E2 (1 מ"ל/טוב).
      הערה: עכבר BALB/c אחד מספק מספר מספיק של OC מבשרי לצלחת תרבות 24-טוב אחד.
  3. הכנה של העכבר OB-OC תרבות משותפת עם biomaterial
    1. מראש דגירה 14 מ"מ קוטר β-TCP דיסקים או עצם שור פרוסות (1 ס מ2) ב 1 מ"ל בגמ בצלחת תרבות ההשעיה. ובכן 24-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 24 שעות לפני הוספת התאים.
      הערה: פרוסות עצם שור הם קבוצת ביקורת המצע הפיזיולוגיות ללמוד OC בידול בנוכחות biomaterials.
    2. הוסף 8.8 x 10 תאים/ס מ4 2 של ראשי OBs הושעו ב בגמ biomaterials או את העצם שליטה בצלחת תרבות 24-ובכן השעיה או צלחת תרביות רקמה 24-. טוב. דגירה-37 ° C ו- 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: OBs לצרף את הפלסטיק או העצם biomaterial או שור.
    3. הוסף טרי מבודד מח עצם OC המבשרות על 24 שעות ביממה תרבותי העיקרי OBs ותרבות -37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 5 ימים. החלף את המדיום מיט OC טריות בכל יום אחר. ואז כתם OCs עבור tartrate חסיני חומצה פוספטאז (השמנה) כדי להעריך את הבידול OC.
  4. בידול OC מוערך על ידי מלכודת מכתים
    1. כדי לאפיין OCs multinucleated בוגר, המתקבל שלב 2.3.3, תשאף המדיום תרבות מן הלוח תרביות רקמה שליטה לצלחת תרבות ההשעיה biomaterial ולהוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x (37 מעלות צלזיוס). מחוק לגמרי מגניב ולתקן את התאים על ידי המקננת בהם ב 1 מ"ל של 10% buffered פורמלין פתרון RT למשך 10 דקות.
    2. תשאף הפתרון 10% buffered פורמלין עם pipet לשימוש יחיד להוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x בכל RT. חזור על שלב זה שלוש פעמים, וארוקן את PBS, להחליף 1 מ"ל של מאגר מלכודת (pH 5) ואז דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. האחות מאגר מלכודת ולהוסיף 1 מ"ל אתנול אצטון ל- 100% 1:1. דגירה לצלחת-RT 30 ס' במהירות וביופסיה אצטון-האתנול פתרון עם pipet לשימוש יחיד, יבש לחלוטין את הצלחות ב- RT.
    4. המלכודת מכתים פתרון, להכין פוספט naphthol-AS-MX פתרון מניות ב- N, N-dimethylformamide, התמוססות 0.6 מ"ג/מ"ל של סגול מהר אדום מלח במאגר מלכודת, ולהוסיף 0.1 מ"ל של פתרון מניות פוספט naphthol-AS-MX 10 מ"ל של מלח מהר אדום סגול 10 מ"ג/מ"ל מאגר מלכודת.
    5. להוסיף 1 מ"ל של מלכודת מכתים פתרון דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן וארוקן את המלכודת מכתים פתרון ו להוסיף 1 מ"ל של מים הנדסה גנטית כדי לעצור את התגובה.
    6. להעביר את הדיסקים β-TCP ואת עצם שור פרוסות לאחר צביעת לתוך באר חדשה, להתבונן אדום OCs מוכתם בסיוע מיקרוסקופ אור (הגדלה: 10 X) ולספור השמנה + OCs בוגרת עם גרעינים שלושה או יותר.

3. קריטי בגודל של עכבר פגם Calvarial דגם

  1. מזריקים 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין subcutaneously (ש) לתוך עכברים BALB/c 8 - בן שבועיים על שיכוך כאבים.
  2. עזים ומתנגד העכברים עם תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים i.p., להוסיף ג'ל או משחה לעיניים כדי שיישארו לחים ומניחים את העכבר על צלחת חימום ב 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו כדי למנוע היפותרמיה. להעריך את עומק הרדמה על ידי צביטה הבוהן וזנב.
  3. לגלח את הפרווה על ראש בראש בין האוזניים, לנקות את השטח עם 7.5% povidone יוד פתרון ו- 70% אתנול.
  4. עושים חתך הסאגיטלי קו האמצע בראש הגולגולת בין האוזניים עם איזמל סטרילי כדי לחשוף את קליפת הגולגולת ולהסיר את רקמות החיבור pericranium לעיל חוזק על ידי גירוד זה עם אזמל.
  5. יוצר פגם קריטי בגודל חוסן באמצעות trephine שיניים סטרילי בקוטר של 4 מ מ (2000 סל ד) תחת השקיה קבועה עם תמיסת מלח רגיל חלק על חוזק, לחתוך את ectocortex, כמה endocortex.
  6. כדי למנוע נזק קרום הדורה, להשתמש מפשיל קטן כדי לפרוץ את endocortex הנותרים, בזהירות להרים את העצם calvarial, להסיר אותו עם מלקחיים. הפגם שנוצר צריך להיות עגול כ 3.5 מ מ קוטר.
  7. למלא את הפגם calvarial עם טרום רטוב (1 x סטרילי PBS ב RT) קצף β-TCP/C באמצעות מלקחיים.
  8. הכן מספר מתאים של פקדים שלילי מתאימים-גיל, דמה עם פגם ריק.
  9. כדי לשמור את biomaterial במקום, שים 0.5 µL של רקמת דבק בקצה הפגם בנקודות מול שני.
  10. סגור את העור בתפר נספגים.
  11. נקה כל מכשירי ניתוח עם sterilant קר כדי לשמור על תנאים סטריליים לפני ביצוע הניתוח הבא עכבר anesthetized.
  12. לטיפול לאחר ניתוח, במקום החיות על צלחת חימום יבשים ונקיים ב 37 מעלות צלזיוס באזור הניתוח לניטור המתאים במהלך תקופת ההחלמה. לנטר את קצב נשימה, טמפרטורת הגוף וצבע של הקרומים הריריים והעיניים כל 10 דקות עד שהם להעיר.
  13. העברת העכברים בהכרה המופעלים לתוך כלוב עם מזון ומים מופרדים משאר בעלי החיים עד החלמה מלאה. מזריקים 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין ספורטינג לטיפול כאבים לאחר ניתוח פעמיים ביום למשך 72 ה' שובו החלים לחלוטין עכברים לכלובים.
  14. כדי לקבוע את היעילות של biomaterial, המתת חסד i.p. עכברים עם פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים.
  15. ב- 8-12 שבועות שלאחר ההשתלה, לערוף את העכבר לאללה עם מספריים חדות.
  16. תיקון הראש העכבר שראשו נערף ב 30 מ של 4.5% buffered פורמלין פתרון 1-2 שבועות להבטיח חדירה מלאה של מקבע לתוך הרקמה.
  17. להעביר את ראשי לתוך 70% אתנול לאחסון לטווח ארוך ב 4 ° C עד שנה אחת.
  18. השימוש מיקרו שמחושב טומוגרפיה (microCT) או טכניקות היסטולוגית undecalcified מתוקננים להערכת התחדשות העצם. ניתן להשתמש microCT סריקה על דגימות לאחר המוות ברזולוציה גבוהה (90 kV, 4 דקות) 2D ו 3D הווריד, מטוסים הקדמית.
  19. היסטולוגיה undecalcified, מייבשים את ראשי בסדר עולה ציונים של אתנול, להטביע חומצתי גליקול.
  20. חותכים גליקול חומצתי-מוטבע עם מסור יהלום, לטחון את המקטעים בעובי של-80 – 100 מיקרומטר.
  21. הערכת Laczko Levai צבעונית סעיפים עצם לזהות את היווצרות העצם החדש14.

4. במבחנה תגובות מערכת החיסון

  1. המתת חסד תמים 8 - בן שבועיים BALB/c i.p. עכברים עם פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים.
  2. הנח את העכבר בצד ימין שלה, לגלח את הפרווה בצד שמאל, לנקות את העור מעל בצד שמאל של הבטן עם 70% אתנול.
  3. להפוך את 10 מ"מ 1 מ"מ חתך עמוק בעור של העכבר בצד שמאל posteriorly בעקבות הצלעות מעל הקיבה באמצעות מספריים סטרילי.
  4. פתח את העור, ואז לחשוף את הצפק. הפוך של 10 מ מ ארוך ופחות מ 1 מ"מ חתך עמוק לתוך הצפק באמצעות מספריים בתנאים סטריליים.
  5. דחף את הבטן הציר הקרוב כדי לחשוף את הטחול.
  6. החזק את הטחול בעדינות עם מלקחיים סטרילי ולהסיר אותו על ידי חיתוך רקמה וכלי מחובר מתחתיו.
  7. מקום הטחול בשלמותם לתוך צינור 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של קר 1 x PBS סטרילי.
  8. הכן השעיה תא בודד על ידי לקמץ הטחול באמצעות מלקחיים סטרילי 2 או 2 מגלשות זכוכית סטריליים.
  9. הסרת לכלוך על ידי העברתו דרך מסננת סטרילית 40 µm תא עם PBS קר 1 x באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל.
  10. Centrifuge התליה תא בודד ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 ° C צינור חרוטי 50 מ ל, תשאף וזורקים את תגובת שיקוע. ואז resuspend בגדר תא ב 5 מ של מאגר פירוק תאי הדם האדומים (RBC).
  11. דגירה התליה תא למשך 14 דקות ב RT ולהפסיק את התגובה על-ידי הוספת 45 מ של מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בינוני.
  12. Centrifuge התאים לאחר פירוק תאים ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
  13. Resuspend splenocytes RPMI בינוני המכיל 10% חום-להשבית FBS 1% פתרון פניצילין-סטרפטומיצין, 0.1% גנטמיצין, 0.2% ß-mercaptoethanol, 1% חומצות אמינו שאינן הכרחיות.
  14. מראש תדגור β-TCP/C קצף לתוך צלחת תרבות סטרילי 96-ובכן המכיל RPMI בינונית במשך 24 שעות ביממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפני זריעה תא
  15. להוסיף splenocytes, טיטרציה המספרים, למשל., 1.25 x 105, 2.5 10x5 ו 5 x 105/well כדי בארות בצלחת תרביות רקמה 96-ובכן המכיל RPMI בינוני ותוספים, עם או בלי הקצף β-TCP/C incubated מראש.
  16. להוסיף 10 concanavalin µg/mL (קון A) התפרקה בינוני עבור סכום כולל של 100 µL טוב לבארות המתאים, אז דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 72 h.
  17. למדוד התפשטות תאים עם וזמינותו bromodeoxyuridine (BrdU). להוסיף 10 µL/טוב של פתרון תיוג BrdU ב 48 שעות של תרבית תאים, ואז דגירה את הצלחת. בשביל h 24 נוספים.
  18. 72 h, לאסוף את תגובת שיקוע, לאחסן ב-20 ° C עד שימוש נוסף.
  19. להוסיף 200 µL טוב של הפתרון קיבוע מכל קידוח, ואז תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT. וביופסיה הפתרון קיבעון. להוסיף 100 µL טוב של הפתרון עובד נוגדן anti-BrdU, תקופת דגירה של 90 דקות.
  20. האחות הפתרון נוגדן, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 200 – 300 µL/טוב של שטיפת פתרון ולהסיר הפתרון כביסה.
  21. להוסיף 100 µL של פתרון המצע תקופת דגירה של 3 – 10 דקות ב RT ואז למדוד את ספיגת ב 450 ננומטר.
  22. למדוד אינטרלוקין-1β (IL-1β), interleukin-2 (il-2), אינטרלויקין-4 (IL-4), אינטרפרון-γ (IFN-γ) ב- supernatants שנאספו באמצעות של אליסה סטנדרטי.

5. מודל בקרום הבטן תפוקה גבוהה

  1. עזים ומתנגד הנשי 6-8 שבועות הישן BALB/c עכברים עם תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים i.p., להוסיף ג'ל או משחה לעיניים כדי שיישארו לחים ומניחים את העכבר על צלחת חימום ב 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו כדי למנוע היפותרמיה. להעריך את עומק הרדמה על ידי צביטה הבוהן וזנב.
  2. לגלח את הפרווה בטן ולנקות עם 7.5% povidone יוד פתרון ו- 70% אתנול.
  3. 8 מ מ רב קו האמצע בחתך דרך העור לאורך linea alba. עושים חתך קטן לתוך הצפק באמצעות אזמל.
  4. המקום סטרילי PBS שנספג שתלי קצף β-TCP/C (2 x 2 x מ מ 23) לתוך חלל הצפק או בלי להוסיף חומרים עבור העכברים שליטה מתאימים לגיל המזויפים.
  5. תפר של הצפק ועור בתפר חומרים נספגים ולא נספגים, בהתאמה.
  6. נקה כל מכשירי ניתוח עם sterilant קר כדי לשמור על תנאים סטריליים לפני ביצוע הניתוח הבא עכבר anesthetized.
  7. לטיפול לאחר ניתוח, במקום החיות על צלחת חימום יבשים ונקיים ב 37 מעלות צלזיוס באזור הניתוח לניטור המתאים במהלך תקופת ההחלמה. לנטר את קצב נשימה, טמפרטורת הגוף וצבע של הקרומים הריריים והעיניים כל 10 דקות עד שהם להעיר.
  8. העברת העכברים בהכרה המופעלים לתוך כלוב עם מזון ומים מופרדים משאר בעלי החיים עד החלמה מלאה. שהחלמת באופן מלא עכברים לשוב הכלובים.
    הערה: הליך זה גורם כאב מינימלי. טיפול כאבים לאחר ניתוח הוא בדרך כלל לא הכרחי. אם המופעלים בעלי חיים מראים סימנים של כאב, מזריקים 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין ספורטינג או אחר תרופה לשיכוך כאבים כאבים המתאים.
  9. המתת חסד עכברים 7 ימים שלאחר ההשתלה, עם פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים i.p.
  10. ב 7 ימים שלאחר ההשתלה, שטיפת חלל הצפק באמצעות 1 מ"ל מזרק עם מחט 25 גרם עבור סכום כולל של 3 מ"ל של PBS קר על-ידי החזקת הראש העכבר החדרת המחט ברבע הבטן התחתון השמאלי ואת המטרה הציר הקרוב.
    הערה: הנוזל הצפק צריך להיות ללא RBCs.
  11. Centrifuge נוזל שטיפת הצפק ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאסוף את הנוזלים הצפק לאחסון ב-20 ° C למדידות אליסה של ציטוקינים IL-1β, il-2, IL-4.
  12. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל ל- PBS, ולספור את התאים הצפק באמצעות trypan blue על hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge התליה תא ב 5 x 10 תאים5 על שקופיות זכוכית, לאפשר את השקופיות יבש, כתם על ספירת תאים דיפרנציאלית.
  14. באמצעות מיקרוסקופ אור, נחשב למינימום של תאים 300 סה כ, להבדיל בין, אאוזינופילים, נויטרופילים, מאקרופאגים לימפוציטים.

6. מודל תת עורית subchronic

  1. עזים ומתנגד בשבוע 6-8 נקבה בת BALB/c עכברים עם תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים i.p., להוסיף ג'ל או משחה לעיניים כדי שיישארו לחים ומניחים את העכבר על צלחת חימום ב 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו כדי למנוע היפותרמיה. להעריך את עומק הרדמה על ידי צביטה הבוהן וזנב.
  2. הנח את העכבר על גבו, לגלח את הפרווה בטן, לנקות את השטח מגולח עם 7.5% povidone יוד פתרון ו- 70% אתנול.
  3. 8 מ מ רב קו האמצע בחתך דרך העור לאורך לינאה אלבה של הבטן בעזרת אזמל. ואז שתל PBS ספוג biomaterial (2 x 2 x מ מ 23) מתחת לעור או להוסיף בלי חומרים עבור העכברים שליטה מתאימים לגיל המזויפים.
  4. תפר את העור בתפר נספגים.
  5. נקה כל מכשירי ניתוח עם sterilant קר כדי לשמור על תנאים סטריליים לפני ביצוע הניתוח הבא עכבר anesthetized.
  6. לטיפול לאחר ניתוח, במקום החיות על צלחת חימום יבשים ונקיים ב 37 מעלות צלזיוס באזור הניתוח לניטור המתאים במהלך תקופת ההחלמה. לנטר את קצב נשימה, טמפרטורת הגוף וצבע של הקרומים הריריים והעיניים כל 10 דקות עד שהם להעיר.
  7. העברת העכברים בהכרה המופעלים לתוך כלוב עם מזון ומים מופרדים משאר בעלי החיים עד החלמה מלאה. שהחלמת באופן מלא עכברים לשוב הכלובים.
    הערה: הליך זה גורם כאב מינימלי. טיפול כאבים לאחר ניתוח הוא בדרך כלל לא הכרחי. אם המופעלים בעלי חיים מראים סימנים של כאב, מזריקים 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין ספורטינג או כאבים מתאים אחר.
  8. כאשר מוכן לבחון את האתר השרשה, המתת חסד i.p. עכברים עם פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים.
  9. שמונה שבועות שלאחר ההשתלה, נכנסים לאתר ההשתלה עם הרקמה (1 ס מ2) שמסביב.
  10. את הרקמה בפתרון 4.5% buffered פורמלין בן לילה, להטביע פרפין וחתוכים לקוביות 4 סעיפים מיקרומטר.
  11. כתם 4 מיקרומטר רקמות פרפין-מוטבע סעיפים ועם Hematoxylin אאוזין (H & E) דלקת או מאסון trichrome עבור התצהיר קולגן ו פיברוזיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך β-TCP עבור יעילותו כמו biomaterial לתיקון העצם, השתמשנו במבחנה , ויוו הקרנת שיטות. ראשית, אנחנו נמדדים OB התגובות הדיסקים β-TCP בהשוואה עם פקדים לבד בינוני בסיסית. איור 2 מדגים את הכדאיות OB בתגובה β-TCP דיסקים ב 7 ו 14 ימים של תרבות. תא הכדאיות נמדדת מתאי סמויה פעיל ב הבארות התרבות היה זהה עבור OBs בינונית בפלסטיק תרביות רקמה, כמו גם עם דיסקים β-TCP המציין biomaterial הזה זה לא שיפור ולא דיכוי התפשטות OB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מראים רב תחומית להערכה פרה של הביו עבור נציג biomaterials שפותחו עבור התחדשות העצם ותיקון. . בדקנו את התגובות של OBs, OCs, ומודל תגובת ריפוי vivo בפגם קריטי עצם עכברים, כמו גם בתוך חוץ גופית ו ויוו תגובות מערכת החיסון. אנחנו נועדו להדגים איך מבחני עבודה ולסכם את הנתונים והמסקנות הנגזרות בחינת biomaterials. אנו מראים כי האסטרטגיה שלנו יוצר פרופיל בעל ערך של עצם biomaterial הביו...

מבחני התא הראשי שימשו להערכת OB ו- OC. OBs אחראים עצם היווצרות ותיקון פיזיולוגי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

פרויקט מחקרי זה קיבל מימון תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם מס 263363.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דיסקים <חזקים>ביו-חומרים
&בטא;-טריקלציום פוספט (β-TCP, 14 מ"מ)דיסקים סונטרו בתנור עמום בטמפרטורה של 1150 מעלות צלזיוס. תיאור מפורט של הייצור ניתן למצוא ב-Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). הדגימות עברו קרינת UV (15 דקות לכל צד) לפני השימוש בתרביות תאים.
קצף Orthovita Vitoss (&בטא;-TCP/C)Orthovita2102-1405
<חזק>תרבית אוסטאובלסטים של עכבר
Alizarin RedS Sigma-AldrichA5533
ALP מאגר בדיקה (2x) pH 10.4ממיסים 200 מ"מ גליצין, 2 מ"מ מגנזיום כלוריד, 2 מ"מ אבץ כלוריד במים אולטרה-טהורים ומתאימים ל-pH 10.
מדיום גידול עצם (BGM)& אלפא;-MEM + 10% FBS מומת בחום + 1% פניצילין/סטרפטומיצין
מאגר ליזה של תאים: מאגר ליזה של תאים CyQuant תרכיז פי 20Thermo ScientificC7027לדלל את מלאי מאגר הליזה של התאים המרוכזים פי 20 במים טהורים במיוחד.
מגיב כדאיות התאים: מגיב כדאיות התאים הכחולים של פרסטוInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
קולגנאז מסוג IV מ- clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
ערכת בדיקת חלבון DC IIBio Rad5000112DC מכילה מגיב A, מגיב B, מגיב S ו- BSA לתקן הייחוס. עבור מגיב A', הוסף 20 ומיקרו; מגיב L S עד 1000 ומיקרו; מגיב L A. 
דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD8418מסנן סטרילי DMSO לפני השימוש. 
Dispase II (פרוטאז ניטרלי, דרגה II)פוספטאז של Roche
EnzCheck לפעילות פוספטאז אלקליין Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck ערכת בדיקת פוספטאז מכילה 6,8-דיפלואורו-4-מתילומבליפריל פוספט (DiFMUP), N,N-דימתילפורממיד ו-6,8-דיפלואורו-7-הידרוקסי-4-מתילקומרין (DiFMU). 
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichF7524
תמיסת פורמלין ניטרלית חומצה 10%סיגמא-אולדריץ'HT501128
גליציןסיגמא-אולדריץ'G8898
הקסדסצילפירדיניום (צטילפירידיניום) כלוריד מונוהידרטסיגמא-אולדריץ'C9002
חומצה L-אסקורבית 2-פוספט ססקימגנזיום מלח הידרטSigma-AldrichA8960
מגנזיום כלוריד הקסהידרטSigma-AldrichM2670
MEM אלפא בינוני (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
מדיום מינרליזציה אוסטאוגני (MM)ואלפא;-MEM + 10% FBS מומת בחום + 1% פניצילין-סטרפטומיצין + 50 ומיקרו; גרם/מ"ל חומצה אסקורבית + 5 מ"מ ובטא;-גליצרופוספט
פניצילין-סטרפטומיצין   Sigma-AldrichP4333
תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054לדלל את תמיסת המלאי המרוכז פי 10 ב-1x PBS.
Tween20Sigma-AldrichP1379
מים טהורים במיוחד: תרבית תאים ללא פירוגןVWRL0970-500
מאגרהוסף  0.05% Tween20 עד 1x PBS.
אבץ כלורידסיגמא-אולדריץ'1.08816
&בטא;-גליצרופוספט דיסודיום מלח הידרטסיגמא-אולדריץ'G5422
צלחת תרבית השעיה 24 בארותגריינר ביו-אחד662102
24 בארות צלחת תרבית רקמותגריינר ביו-אחד662160
50 מ"ל צינור חרוטיגריינר ביו-אחד227261
96 בארות צלחת שחורהGreiner bio-one655076
96 בארות צלחת שקופהGreiner bio-one655001
צנטריפוגה: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Incubator: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 מ"לGreiner bio-one122263
יחידת מסנן חד פעמית FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200לסינון סטרילי של תמיסת אנזים.
סורק שטוח: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro קורא מיקרו-פלטותTecan
צינור מיקרוצנטריפוגה: צינור אפנדורף מנעול בטוח 0.5 מ"לVWR20901-505
צינור מיקרוצנטריפוגה: מנעול כספת צינור אפנדורף 1.5 מ"לVWR21008-959
החלקת שייקר (מסלולית ואופקית) אדמונד בוהלר 
חממת טלטול GFL3032GFL 3032
פיפט חד פעמי: סרום פיפטגריינר ביו-וואן612301
מכשירים סטריליים (מספריים, פינצטה, מלקחיים מעוקלים)
צלחת תרבית רקמות (10 ס"מ)גריינר ביו-וואן664960
<חזק>עכבר אוסטאובלסט-אוסטאוקלסט קו-תרבית
1&אלפא;,25- דיהידרוקסיויטמין D3סיגמא-אולדריץ'17936מלאי מרוכז פי 1000 (10 ומיקרו; M באתנול 100%)
אצטוןVWR כימיקלים22065.327
מדיום צמיחת עצם (BGM)ואלפא;-MEM + 10% FBS מומת בחום + 1% פניצילין-סטרפטומיצין
מים מזוקקיםקארלרוט 3478.4
אתנול (100% נפח/נפח)VWR כימיקלים20821.365
אתנול (70% נפח/נפח)כימיקליםVWR93003.1006
LB סגול אדום מהירSigma-AldrichF3381
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichF7524
תמיסת פורמלין ניטרלית חוצצת 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM אלפא בינוני (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-דימתילפורממידסיגמא-אולדריץ'D4551
נפתול AS-MX פוספטסיגמא-אולדריץ'N4875
מדיום התמיינות אוסטאוקלסט (DM)ואלפא;-MEM + 10% FBS מומת בחום + 1% פניצילין-סטרפטומיצין + 1 ננומטר 1,25-(OH)2-ויטמין D3 + 1 ומיקרו; M פרוסטגלנדין E2 
פניצילין-סטרפטומיצין Sigma-AldrichP4333
תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
10010023 פרוסטגלנדין E2 (PGE2)חברת קיימן כימיקלים9003016מלאי מרוכז פי 1000 (1 מ"מ באתנול 100%)
נתרן אצטט טריהידרטסיגמא-אולדריץ'S7670
נתרן טרטרט די-בסיסי דיהידראטסיגמא-אולדריץ'S8640
מכשירים סטריליים (מספריים, מלקחיים, אזמל)
TRAP חוצץ pH 5.0ממיסים 40 מ"מ נתרן אצטט, 10 מ"מ נתרן טרטרט במים טהורים במיוחד ומתאימים ל-pH 5.
מים טהורים במיוחד: תרבית תאים מים ללא פירוגןVWRL0970-500
24 בארות צלחת תרבית מתלהגריינר ביו-וואן662102
24 בארות צלחת תרבית רקמותגריינר ביו-וואן662160
50 מ"ל צינור חרוטיגריינר ביו-וואן227261
צנטריפוגה: VWR מגה כוכב 600RVWR
חממת CO2: HeraCell 240Thermo Scientific
להב פרוסות יהלום (10.2 ס"מ x 0.3 ס"מ)Buehler
Isomet מסור במהירות נמוכהצלחת פטרי Buehler
(6 ס"מ)Greiner bio-one628,161
בקבוק זכוכית מכסה בורג 20 מ"לCarl RothEXY4.1
מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"להנרי Schein Animal Health9003016
פיפט לשימוש חד פעמי: סרום פיפטגריינר ביו-וואן612301
מחט סטרילית: מחט היפודרמית RW 27 G x 3/4''Henry Schein Animal Health9003340
<חזק>מודל פגם קלוריאלי של עכבר
משכך כאבים: בופרנורפין (Bupaq)Richter Pharma AG
הרדמה: קטמין (קטמידור), קסילזין (רומפון)ריכטר פארמה AG/Bayer HealthCare
סטרילנט קר: Safesept MaxHenry Schein בריאות בעלי חיים9882765
אתנול (70% נפח/נפח)VWR Chemicals93003.1006
משחת עיניים: VitA POS 5 גרםUrsapharm
תמיסת מלח רגילה (0.9% תמיסת נתרן כלוריד)Fresenius Kabi
Phosphate-buffered מלח 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
תמיסת יוד פובידון: בראונול 1000 מ"לB. בראון3864154
רוטי-היסטופיקס 4.5% פורמלין חומציקארל רוט2213.6
דבק רקמות: היסטואקריל 5 x 0.5 מ"ל ב. בראון כירורגי1050060
ציוד מגן אישי: כפפות כירורגיות, כובע ומסכה, שמלההנרי שיין לבריאות בעלי חיים1045073, 1026614, 9009062 370406
מכשירים סטריליים (אזמל, מספריים, מלקחיים, מחזיק מחט)
מחטים סטריליות: מחטים היפודרמיות RW 27 G x 3/4 אינץ' ו-30 G x 1/2'' Henry Schein Animal Health9003340, 9003630
מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"לHenry Schein Animal Health9003016
צלחת חימום: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
ספוגיות גזה סטריליותHenry Schein Animal Health220192
אזמל חד פעמי סטרילי (איור 20)Henry Schein Animal Health9008957
מקדחה כירורגית/דנטלית: מושתל SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
ידית מסוג S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
טרפין, קוטר 4 מ"מHager& Meisinger GmbH229040
סט צינורות השקיה 2.2 מ'W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
מעלית Periosteal 2 מ"מ / 3 מ"מHenry Schein Animal Health472683
תפר שאינו נספג: ירוק פוליאסטר, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 ס"מHenry Schein Animal Health300715
in vitro תגובות חיסוניות
הרדמה להמתת חסד: קטמין (קטמידור), קסילזין (רומפון)ריכטר פארמה AG/Bayer HealthCare
התפשטות תאים ELISA, ערכת בדיקה BrdU (קולורימטרי)Sigma-Aldrich11647229001הערכה מכילה תמיסת תיוג BrdU, תמיסת קיבוע (FixDenat), תמיסת נוגדנים נגד BrdU, מאגר כביסה ותמיסת מצע.
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
תרבית טחולRPMI בינוני + 10% FBS מומת בחום + 1% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין + 0.1% גנטמיצין + 0.2% ß-מרקפטואתנול + 1% חומצות אמינו לא חיוניות
אתנול (70% נפח/נפח)VWR Chemicals93003.1006
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& נ.ב.פ;
ג'נטמיציןגיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק 
עכבר 15750037 IL-1β אליסה מוכנה-סט-צא לדרך!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
עכבר IL-2 ELISA MAX עכבר431001BioLegend
IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Mouse INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותGibco, Thermo Fisher Scientific 
פניצילין-סטרפטומיצין גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק 
תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC): BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 medium, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
&בטא;-מרקפטואתנולג'יבקו, תרמו פישר סיינטיפיק 
31350010 צינור חרוטי 50 מ"לגריינר ביו-וואן227261
צלחת תרבית רקמות 96 בארותגריינר ביו-וואן655180
צנטריפוגה: מסננת תאים VWR Mega Star 600RVWR
40 ומיקרו; mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro קורא מיקרו-פלטותTecan
מזרק סטרילי לשימוש חד פעמי 1 מ"להנרי שיין 9003016
מכשירים כירורגיים סטריליים (מלקחיים, שקופיות זכוכית)
<חזק>דגם תוך-צפקי תפוקה גבוהה
הרדמה: קטמין (קטמידור), קסילזין (רומפון)ריכטר פארמה AG/Bayer HealthCare
סטרילנט קר: Safesept MaxHenry Schein בריאות בעלי חיים9882765
אתנול (70% נפח/נפח)VWR Chemicals93003.1006
משחת עיניים: VitA POS 5 גרםעכבר אורספארם
IL-1β אליסה מוכנה-סט-צא לדרך!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
עכבר IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Phosphate-buffered Salt 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
תמיסת יוד פובידון: Braunol 1000 מ"לB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff ערכת צביעהThermo Scientific9990700לספירת תאים דיפרנציאלית.
צלחת חימום: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hemocytometer: תא נויבאוארCarl RothPC72.1
תפר שאינו ניתן לספיגה: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
תפר נספג: PolysorbCovidienSL-5628
צנטריפוגה שנדון לציטופסיןThermo Scientific
מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"להנרי שיין בריאות בעלי חיים9003016
ספוגיות גזה סטריליותהנרי שיין בריאות בעלי חיים220192
מחטים סטריליות: מחטים היפודרמיות RW 27 G x 3/4 אינץ' ו-25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
מכשירים כירורגיים סטריליים (אזמל, מספריים, מלקחיים, מחזיק מחטים)
תמיסה כחולה טריפאן 0.4%גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק 15250061
<דגם תת עורי חזק>תת כרוני
הרדמה: קטמין (קטמידור), קסילזין (רומפון)ריכטר פארמה AG/Bayer HealthCare
סטרילנט קר: SafeSep MaxHenry Schein בריאות בעלי חיים9882765
אתנול (70% נפח/נפח)VWR כימיקלים93003.1006
משחת עיניים: VitA POS 5 גרםUrsapharm
Phosphate-buffered מלח 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
תמיסת יוד פובידון: בראונול 1000 מ"לB. בראון3864154
רוטי-היסטופיקס 4.5% פורמלין חוצץקארל רוט2213.6
פלטת חימום: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
תפר שאינו נספג: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
ציוד מגן אישי: כירורגי כפפות, כובע ומסכה, שמלההנרי שיין 1045073 בריאות בעלי חיים, 1026614, 9009062, 370406
מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"להנרי שיין בריאות בעלי חיים9003016
ספוגיות גזה סטריליותהנרי שיין בריאות בעלי חיים220192
מכשירים סטריליים (אזמל, מספריים, מלקחיים, מחזיק מחט)
מחט סטרילית: מחטים היפודרמיות RW 27 גרם x 3/4 אינץ' הנרי שיין 9003340 לבריאות בעלי חיים, 420939
ערכת בדיקת חלבון ערכת בדיקת 4942078001 10010023 כביסה מלח 10010023 בינוני 10500064סטנדרטי 111400501514012210010023לבריאות בעלי חיים1001002310010023

מקורות

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076(2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585(2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביומטריאלייםהתחדשות עצםחיוניות אוסטאובלסטיםהתמיינות אוסטאוקלסטיםצביעת Alizarin Red Sפגם בגולגולת בגודל קריטיBeta-Tricalcium Phosphateבדיקות In Vitroמודלים של עכברים In Vivoבדיקת אימונוגניותהערכת אלרגניזות
פרופיל תאימות ביולוגית על Biomaterials עבור התחדשות העצם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.