הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58079

⸱

29 באוגוסט 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

תקציר

לימודי שינויים דינמיים בתרגום חלבונים דורשים שיטות מיוחדות. כאן נבחנו שינויים בחלבונים מסונתז לאחרונה, בתגובה איסכמיה, פגיעה reperfusion באמצעות הלב העכבר perfused מבודדים בשילוב עם polysome פרופיל. כדי להבין עוד יותר את השינויים הדינמיים בתרגום חלבונים, אנחנו מאופיין mRNAs זה היו מפוצצות ריבוזומים cytosolic (polyribosomes או polysomes) וגם התאושש polysomes מיטוכונדריאלי ו לעומת התפלגות mRNA וחלבון ב יעילות גבוהה שברים (מצורף mRNA הריבוזומים רבים), נמוך-יעילות (פחות ריבוזומים מצורף) אשר כללה גם את polysomes מיטוכונדריאלי, השברים ללא תרגום. miRNAs ניתן גם לשייך mRNAs זה מתורגם, ובכך להפחית את היעילות של תרגום, שבדקנו את חלוקת miRNAs לאורך השברים. ההתפלגות של mRNAs, miRNAs חלבונים נבדק בתנאים perfused הבזליים, בקצה של 30 דקות של איסכמיה זרימה לא גלובלי, ואחרי 30 דקות של פגיעה reperfusion. כאן אנו מציגים את שיטות השתמשו כדי לבצע ניתוח זה — בפרט, הגישה אופטימיזציה של חלבון החילוץ של מעבר הצבע סוכרוז, כמו זה לא תואר קודם — ולספק תוצאות נציג.

מבוא

הלב מגיב לפציעה של איסכמיה (I), פגיעה reperfusion (R) בצורה דינמית. עם זאת, יש קצת תובנה חריפה לשינויים סינתזת חלבונים במהלך התגובה. כדי לטפל בבעיה זו, לקחנו היתרון של השיטה ומבוססת של polysome פרופיל1 כדי לזהות שינויים בשפע חלבון המשקפים הפצה של הריבוזומים ו translational גורמים רגולטוריים מ ציטוזול כדי polysomes, ו לודיג לאחרונה מסונתז חלבונים (NSPs). בסביבה של אני / R, הגדלת סינתזת החלבון החדש מתרחש במסגרת זמן זה אינו עולה בקנה אחד עם שעתוק של mRNAs חדש2; יתר על כן, הכתבים בין רמות הביטוי mRNA ושפע חלבון כבר דווח על3. מסיבות אלה, בחרנו לנתח השינויים פרוטאום דינמי כפי שהיא משתקפת תרגום החלבון. כדי לעשות זאת, אנחנו לכמת mRNA שברים polysome, ולנתח את הרכב החלבון בשברים polysome. לבסוף, מאחר מיקרו Rna (מירס) לווסת את הזמינות של mRNAs לתרגום יכולים להפריע היעילות של חלבון תרגום4,5, בדקנו את ההפצה של מירס בחלקים polysome, התמקדות תגובה / רבי

בחרנו להשתמש בעכבר מבודד Langendorff זלוף המודל לבין רקמת שנקטפו בתנאים הבזליים של רציף זלוף, אחרי איסכמיה זרימה לא גלובלי 30 דקות, ואחרי 30 דקות של איסכמיה ואחריו 30 דקות של פגיעה reperfusion. אנחנו solubilized את רקמת הלב ואז מופרדים polysomes מעבר הדרגתי סוכרוז, ואחריו פרוטיאומיה מבנית ניתוח וזיהוי סלקטיבי של mRNAs ושל miRNAs ע י PCR microarray, בהתאמה. שילוב זה של שיטות מייצג גישה רב-עוצמה להבנת פרוטאום דינמי, המאפשר זיהוי סימולטני של mRNA, miRNA, NSPs, כמו גם הפצה מחדש של חלבוני, miRNA ו- mRNA בין שברים nontranslating, יעילות נמוכה polysomes, יעילות גבוהה polysomes (ראה איור 1). תובנות ברגולציה דינמי של תהליך זה יורחב על ידי ניתוח נוסף של זירחון של גורמים רגולטוריים מרכזיים כגון eIF2α או mTOR. צעדים בודדים אלה מתוארים עכשיו בפירוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל היו שבוצעה בהתאם המוסדיים הנחיות ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff זלוף העכבר לב

  1. Langendorff זלוף העכבר לב עם איסכמיה, פגיעה reperfusion
    1. לנהל סודיום פנטוברביטל בקרום הבטן 70 מ"ג/ק"ג העכבר בוגרים (8-בת שבוע, זכר, C57BL6/j). לאשר הרדמה עמוקה על ידי חוסר משיכה שאורך צביטה.
    2. Anticoagulate עם הפרין בקרום הבטן 500 U/ק"ג.
    3. . תפתח את התיבה דרך החתך בחזה ובצלעות פתח הסרעפת וחותכים לאורך הגבול costal לציר בבית השחי הקדמי. . תעצור את הציר הקדמי בבית השחי עד forelimb כדי לפתוח לגמרי את כלוב בית החזה. לאחר מכן, להמחיש את הלב, תהדק את העורקים עם מלקחיים, במהירות לסלק את הלב. המוות הוא עקב דימום למוות. מקום בלב קר קרבס (NaCl 6.9 g/L, אשלגן כלורי 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/L, ח'2PO4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, גלוקוזה, 2 g/L ו- CaCl2 0.373 g/L).
    4. נקרר את העורקים עם מחט וקהה, perfuse את הלב retrogradely עם פתרון קרבס במצב לחץ קבוע.
    5. לאחר ייצוב פרק זמן של 15 דקות, נושא את הלב איסכמיה גלובלית זרימה לא למשך 30 דקות ולאחריו פגיעה reperfusion למשך 30 דקות.
    6. הקציר לבבות לאחר 15 דקות בסיסית זלוף, לאחר 30 דקות איסכמיה או לאחר פגיעה reperfusion 30 דקות. לקצץ את אטריה, snap-הקפאת הרקמה של חנקן נוזלי.
    7. לאחסן ב- 80 ° C עד לשימוש

2. רקמת המגון, Solubilization, צפיפות סוכרוז שקיעת מעבר צבע

  1. הכנה מעבר צבע
    1. להכין 2 פתרונות (15% ו- 50%) של סוכרוז 100 מ ל, ערבוב 4 מ"ל של NaCl 2.5 מ';
      MgCl 0.8 מ ל2 1.25 מ'; 1 מ"ל טריס-HCl 1 מ', pH 7.5; 15 גרם או 50 גר' סוכרוז (עבור 15% ו- 50%, בהתאמה); הנדסה גנטית מים כדי להגיע 100 מ; קסילן cyanol (0.02 נקודות mg/mL) לצבע הפתרון 15%
    2. לסנן את כל הפתרונות (0.22 מסננים מיקרומטר)
    3. היום שמעבר הצבע היא לשמש, להכין 40 מ של כל פתרון סוכרוז, להוסיף cycloheximide כל פתרון כדי להשיג את הריכוז הסופי של µg 100/mL
      1. שימוש מכונת מעבר צבע כדי להכין שילוב בין 15% ל- 50% סוכרוז הפתרונות
      2. למלא את התא השמאלי עם 5 מ של המילוי ההדרגתי 15% סוכרוז
      3. למלא את התא הנכון במעבר 50% סוכרוז
      4. לפתוח את הברז ולעבור על המשאבה להניע את שני תאים קטנים עם פגים
      5. שימוש צינור קשורה בהקשה השנייה כדי לאפשר את הפתרון סוכרוז מעורב לזרום בצינור אולטרה-צנטריפוגה עם קירות דקים. נפח הסופי יהיה בסביבות 10 מ"ל.
    4. לשמור על מעברי הצבע ב 4 ° C (לילה אם יש צורך, אבל לא יותר)
  2. המגון רקמת הלב
    1. Homogenize טרי או קפוא הלב עם polytron במאגר פירוק מסוננים (שונה עבור fractionation הדרגתיות סוכרוז) המכיל 100 מ מ אשלגן כלורי, 20 מ מ טריס pH 7.5, 5 מ מ MgCl2, 0.4% NP-40. כוללים 100 cycloheximide µg/mL כדי לשמור על מבנה polysome, 0.1 U RNase מעכב, מעכבי פרוטאז קוקטייל (1 טבליה עבור 50 מ ל).
    2. דגירה של lysate על קרח 15 דקות.
    3. צנטריפוגה ב x 18,000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי להסיר חומרים לא מסיסים ולאסוף את תגובת שיקוע.
    4. הזמינו µL 50 עבור קביעת חלבון, בידוד RNA וניתוח RNA תקינות (ראה איור 2).
    5. שכבה את תגובת שיקוע (500 – 100 µL) על מעברי הצבע ולאזן את הצינורות עם פירוק מאגר.
  3. שקיעת ואוסף של שברים
    1. בצע ultracentrifugation עבור 120 דקות-37,000 סל ד ב 4 ° C ברוטור דלי מתנדנדים. לדברי היצרן, זה מקביל x 228,000 g ב- radius מקסימלי.
    2. לאסוף את כל מעבר צבע כשברים 17 (כ-600 µL כל שבר) microcentrifuge צינורות עם ניטור רציף של ספיגת-254 ננומטר (OD254).
    3. תוכנית האספן שבר כדלקמן:
      1. למחוק את 3 דקות הראשונה של האוסף (תואם להנוזל הכלול הצינורות לפני מעבר הצבע)
      2. בין 4 ל- 19 דקות, לאסוף את השברים במהירות של 1 מ"ל לדקה בחלקים 17.
    4. למקם השברים בקרח ברגע אחד נאסף. הקפאת דגימות ב-80 מעלות צלזיוס, אם הם לא המעובדות מיד. עקיבה densitometric UV טיפוסי של מעבר הצבע כמו זה נאסף מוצג באיור1.

3. בידוד וניתוח של mRNAs Polysome, שברים Nontranslating

  1. הפקת mRNA
    1. הפשרת השברים בקרח, אם הם היו קפואה לאחר אוסף
    2. µL 200 של כל שבר להעביר צינור טריים
      הערה: בשלב זה, שברים ברציפות שתיים או יותר יכול להיות איחדו ביחד. זה צריך להיעשות בזהירות לאחר ניתוח הגרף254 OD כך polysome ו- polysome ללא שברים לא מבלבל.
    3. להוסיף 10 ng של לוציפראז RNA כמו בקרה פנימית על כל דגימה לצורך נורמליזציה.
      הערה: לוציפראז תחל צריך לשמש פקד פנימי לנרמל את התוצאות.
    4. להוסיף 700 µL של ריאגנט החילוץ RNA (תמיסת monophasic פנול, guanidine isothiocyanate; ראה טבלה של חומרים) כל שפופרת. מערבבים היטב, דגירה של הצינורות עבור 5 דקות ב RT (טמפרטורת החדר).
    5. הוסף 140 µL כלורופורם, מערבולת על Incubate ס' 15 דקות 2-3-RT.
    6. Centrifuge את הדגימות למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    7. להעביר בזהירות מימית השלב העליון צינור חדש.
    8. מאז בתוכן הרנ א של השברים אינה גבוהה, להוסיף 10 µg של גליקוגן כנשא כל שפופרת.
    9. להוסיף אלכוהול איזופרופיל µL 350 כל שפופרת. מערבבים היטב, דגירה ב-20 ° C עבור h 1 כדי להגדיל את התשואה.
    10. צנטריפוגה למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    11. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 700 אתנול µL 75% לשטוף בגדר RNA.
    12. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 7,500 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    13. הסר אתנול, תנו לאוויר צניפה יבש למשך 10-15 דקות.
      הערה: ייבוש יתר בגדר RNA תמנע שלה solubilization מלאה במים.
    14. Resuspend בגדר RNA ב- 50 μL של RNase ללא הנדסה גנטית H2O.
    15. דגירה הדגימות 10 דקות-55 מעלות צלזיוס.
    16. השתמש μL 2 של כל מדגם למדוד את האיכות והכמות של RNA שחולצו ולאחסן את השארית ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. שעתוק במהופך, qPCR
    1. השתמש 4 μL שעתוק במהופך cDNA סינתזה של קיט (ראה טבלה של חומרים) לתגובה 20 μL. הכינו את supermix על פי מספר דוגמאות. להעביר את אמצעי האחסון הדרושים כל שפופרת ולהוסיף 5 μL של הקלט RNA כל שפופרת. ניתן לתקן אמצעי אחסון זה להיות רלוונטי עבור הטווח לתנאי העבודה של פולימראז Taq.
    2. דגירה של צינורות הצנטרפוגה תרמי עם התוכנית הבאה המומלץ על ידי היצרן: 5 דקות 25 ° c, 20 דקות שעתוק במהופך למשך 20 דקות ב 46 ° C, איון רוורס טרנסקריפטאז עבור 1 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס.
    3. הפעל את qPCR עם התוכנית ממוטב עבור כל זוג של צבעי יסוד.
      הערה: כדי לזהות הנוכחות של mRNAs מסויימים בחלקים, נפח שווה של כל שבר (של RNA מבודד) יש להשתמש עבור שעתוק במהופך.
  3. ניתוח של התוצאות
    1. השתמש בערך Ct של הגן מעוניין, את לוציפראז כדי לחשב את הערכים Ct דלתא
    2. אקספרס דלתא שבר כל ערך Ct כאחוז מתוך סה כ ערך mRNA הכלול כל השברים להמחיש את ההפצה של mRNA מעבר שברים שונים (טבלה 1)

4. בידוד וניתוח של miRNAs מ Polysome שברים שברים Nontranslating

  1. הפקת mRNA, miRNA
    הערה: פרוטוקול זה עוקב אחר הוראות היצרן, עם כמה שינויים.
    1. להפשיר את הגליקוגן ואת הפקד ספייק-אין. לשמור על הקרח.
    2. להוסיף 700 µL של miRNA החילוץ ריאגנט µL 200 מדגם במאגר.
    3. הוסף µg 1/µL של גליקוגן, homogenize אותו בעזרת פיפטה. תקופת דגירה זה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. מוסיפים 3.5 µL של 1.6 x8 10 ספייק-אין שליטה ומערבבים אותו.
    5. להוסיף 200 µL של כלורופורם, מערבולת זה במשך 15 שניות לפחות.
    6. תקופת דגירה של 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. צנטריפוגה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
    8. באמצעות פיפטה של, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ. למחוק את שלבי האמצעי והתחתון.
    9. להוסיף 1.5 x נפח של 100% אתנול תגובת שיקוע, ולערבב.
    10. העברת 700 µL של תערובת זו לעמודה החילוץ miRNA ו- centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT, להשליך הזרימה דרך; חזור על שלב זה עם דוגמה הנותרים.
    11. להוסיף 700 µL מאגר 1 לעמודה, centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
    12. להוסיף 500 µL מאגר 2 העמודה, centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
    13. להוסיף 500 µL של 80% אתנול העמודה, centrifuge זה במלוא המהירות למשך 2 דקות ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
    14. להעביר את העמודה mL 2 חדש uncapped צינור, פותחים את המכסה, centrifuge זה ב RT במשך 5 דקות במהירות מלאה; למחוק את הזרימה דרך.
    15. להוסיף 16 µL של מים נטולי RNAse העמודה ואת צנטריפוגה זה מלא מהירות של 1 דקות ב- RT. שמור את eluate על הקרח או לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח עתידי.
      הערה: שני microliters של כל מדגם יכול לשמש לניתוח יתר.
  2. שעתוק במהופך
    1. הכן על קרח. עבור כל תגובה RT-PCR 20 µL, להוסיף 4 µL של המאגר RT miRNA, 2 µL של חומצות גרעין, µL 9 של RNA הכולל, 2 µL של האנזים µL 3 RNAse ללא מים; לערבב את זה ואת זה ספין למטה בקצרה.
    2. הגדר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן:
      37 º C למשך 60 דקות;
      95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות;
      4 ° C החזק.
    3. להסיר את הצינורות הצנטרפוגה תרמי ולהוסיף µL 200 RNAse ללא מים. ב-20 ° C או להמשיך ה-PCR בזמן אמת.
  3. PCR בזמן אמת
    הערה: פרוטוקול זה עוקב אחר עיצוב הצלחת היטב 96. מכינים את תערובת התגובה על קרח.
    1. להכין תערובת התגובה PCR ולהוסיף cDNA (מתוך miRNAs לעיל) על פי הטווח התקבלה על-ידי הפרוטוקול. ניתן להכין תגובות מרובות באצווה.
    2. להוסיף סך של 25 µL של ה-PCR מיקס + cDNA מכל קידוח.
    3. חותם את הצלחת בעזרת חותם על צלחת אופטי.
    4. Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 1,000 x g בטמפרטורת החדר.
    5. תוכנית הצנטרפוגה בזמן אמת כדלקמן:
      שלב ההפעלה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות;
      3-צעד רכיבה על אופניים: דנטורציה ב 94 ° C 15 s; חישול ב 55 ° C ל 30 s; סיומת ב 70 ° C ל 30 s (לבצע איסוף נתונים קרינה פלואורסצנטית); להוסיף 40 מחזורי;
      התכה-עיקול על פי הצנטרפוגה ברירת המחדל.
  4. ניתוח השוואתי
    1. דוגמה של נורמליזציה (ראה טבלה 2):
      1. למצוא את הערך המינימלי של SCM.
      2. לנרמל את כל הערכים SCM למינימום הזה.
      3. לחסר ערך זה לפי הערכים Ct של miRNAs של עניין (MOI) הפניה ג'ין (שופט).
      4. ניתוח נתונים באמצעות הנוסחה 2-ΔCt .

5. פרוטיאומיה מבנית ניתוח

  1. מיצוי של חלבונים של שברים polysome
    1. לשלב סוכרוז שנאספו שברים שברים סופית שלוש. לסמן השברים כבד (יעילות גבוהה polysomes בחלקים במאגר 4, 5, 6 ו-7 עם הריכוז הגבוה ביותר של סוכרוז; התחתון של צינור מעבר צבע), אור (יעילות נמוכה polysomes ב שבר במאגר 8, 9, 10 ו- 11; אמצע שפופרת צבע) או ללא תרגום (שברים במאגר 12, 13, 14 ו 15 עם הריכוז הנמוך ביותר של סוכרוז; העליון של הצינור מעבר צבע). לבצע חלבון assay בשברים במאגר.
    2. להכין מלאי 100% של חומצת חומץ טריכלור (TCA) ואחסן אותו ב 4 ° C בחושך. מערבבים 0.5 מ של דגימה עם 60 µL של 100% TCA דגירה ב-20 ° C בלילה בחושך.
      הערה: השתמש 1.5 mL חלבון נמוכה השמירה צינורות (ראה טבלה של חומרים).
    3. לאחר דגירה לילה, להפשיר את הדגימה על קרח, צנטריפוגה ב 15,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להשליך תגובת שיקוע.
      הערה: µg 100 של חלבון הכולל דוגמה נותן חלבון גלוי צניפה בתחתית צינור.
    4. מראש מקררים אצטון במקפיא-20 ° C. להוסיף 0.5 מ של אצטון קר חלבון צניפה, צנטריפוגה ב 15,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להשליך תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים.
    5. האוויר יבש בגדר. Resuspend בגדר ב 360 µL מאגר טריס-HCl 50 מ מ (pH 8).
      הערה: אם יש צורך, להשתמש sonicator הדופק כדי resuspend בגדר.
    6. להוסיף 40 µL של 0.1 M dithiothreitol (ריכוז סופי 10 מ מ) דגירה -55 מעלות צלזיוס על שאכר במשך 45 דקות להוסיף 50 µL של 0.15 מ' iodoacetamide (ריכוז סופי 17 מ"מ) דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר למשך 30 דקות בחושך.
    7. להכין פתרון טריפסין: resuspend 20 µg של טריפסין ב 100 µL של 50 מ מ אמוניום ביקרבונט. להוסיף נפח המתאימים של טריפסין פתרון מדגם 1:50 (w/w) יחס טריפסין: חלבון, ודא כי ה-pH 8, דגירה על שאכר ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: להוסיף 1 מ' אמוניום ביקרבונט כדי להביא pH 8.
    8. לאחר עיכול טריפסין, מגניב המדגם, צנטריפוגה בקצרה בצנטריפוגה ספסל, להוסיף 10% חומצה פורמית pH 2-3 כדי להרוות את הפעילות טריפסין, ולהמשיך עם מדגם desalting.
      הערה: השתמש בצלחת • ממוצע-תנאי עבור מדגם desalting.
    9. במצב sorbent הבארות של 96 טוב צלחת עם 200 µL של מתנול באמצעות ואקום שלוש פעמים ולאחריו על ידי מיזוג µL 200 חומצה פורמית 0.1% שלוש פעמים. לטעון מדגם ולבצע שטיפה מדגם באמצעות µL 200 חומצה פורמית 0.1% שלוש פעמים. Elute הדגימה עם 100 µL 50% acetonitrile/0.1% חומצה פורמית פעמיים לתוך חלבון נמוכה השמירה 0.5 mL שפופרת.
      הערה: Elute המדגם לאט בהתחלה באמצעות הכבידה ואחריו ואקום נמוכה.
    10. להתאדות מדגם eluate ליובש באמצעות רכז, גם ישירות לבצע ניתוח ספקטרומטר מסה או חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  2. ניתוח ספקטרומטר מסה
    1. לשקם כל גלולה (המורכב פפטידים tryptic) ב- 50 – 100 µL, להזריק 1 µL לתוך ספקטרומטר מסה.
      הערה: מטב שיחזור ומסוג הזרקת כדי לקבל את העוצמה המקסימלית LC/MS/MS אות. במקרה שלנו, האות המרבי (סה כ יון הנוכחי; טיק) בתוך הלב של הסריקה היה בטווח של 1E8 כדי 2E9.
    2. להשתמש בעמודה מלכודת סי18 (300 µm זהות x 5 מ מ, 5 מיקרומטר, 100Å) ואחריו פפטיד הפרדה באמצעות סי18 עמודה (75 µm זהות x 250 מ מ, 2 מיקרומטר, 100Å) עם קביעת קצב זרימה-300 nL לדקה סט הטמפרטורה נימי ננו-מקור 275 מעלות צלזיוס, המתח ספריי 2 kV.
    3. להחיל מעבר צבע ליניארי של 5 – 35% B במשך 90 דקות, 35 – 95% B במשך 3 דקות, מחזיק ב- 95% B עבור 7 דקות ו- equilibration ב-5% B במשך 25 דקות (a: 0.1% חומצה פורמית/מים וב': 0.1% חומצה פורמית ב- acetonitrile). רוכשים MS2 spectra עבור היונים 15 בעוצמה הגבוהה ביותר של כל סריקה MS1 באמצעות מצב CID. עבור כל דגימה לבדיקה לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט 3 משכפל ספקטרומטר מסה.
      הערה: מיטוב ולהשתמש את הפרמטרים המתאימים לדוגמאות שלך על הכלי ספקטרומטר מסה מסוימת ותנאים ניסיוני. התנאים/הפרמטרים שהוזכרו בסעיף 5.2. היו בשימוש וממוטב במעבדה שלנו.
  3. זיהוי חלבונים/כימות
    1. אחרי ניתוח ספקטרומטר מסה, להמיר את קבצי raw ספקטרה mzXML תואם את הקבצים באמצעות תוכנת MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. להגיש את הקבצים שעברו המרה לתוך SEQUEST מנוע חיפוש עם קריטריוני החיפוש, למשל, UniProtKB/שוויצרי-פרוט העכבר מסד (וברקוד שנסקרו קנונית); תקציר אנזים למחצה באמצעות טריפסין (לאחר KR /-); עם אדמירל שלא נענתה עד 2; טווח המוני קודמן: 400 עד 4,500 אמו; השינוי סטטי: carbamidomethyl (ג) 57.021465 אמו; רגישות מסה פפטיד: 50 דפים לדקה; קטע המוני מסוג: monoisotopic.
      הערה: אחרים חלבון מסד נתונים חיפוש מנועי ונתונים צינורות ניתן להשתמש. אם משתמש מסד הנתונים עבור למשל עכברוש, אשר תושלם פחות מאשר מסדי נתונים עבור האדם של עכבר, ייתכן שיהיה עליך לחפש נגד העכבר (או האדם) מסדי נתונים כדי להגדיל פרוטאום כיסוי. במקרה זה, יתירות בשמות חלבון יהיה צורך להסירו.
    3. ביצוע ניתוח שלאחר חיפוש. הגדר את מסנני לתצוגת הנתונים. לדוגמה, הגדר הסתברות המינימלי חלבון (חלבון מפתן) 95% או 99%, קרי, יוצג רק את החלבונים שעבורם ניתוח סטטיסטי מרמז על 95% או 99% ההסתברות להיות נוכח במדגם. להגדיר את המסנן על הסף פפטיד (למשל, 95%), קרי, הסתברות המינימלי שישמש לקביעת אם קשת מזהה פפטיד. בחר את המספר המינימלי של פפטידים שיקבעו אם חלבון קיים (2 פפטידים מינימום לזיהוי חלבון מומלצת).
    4. הערכת חלבונים מזוהה עבור כמות/איכות. ודא כי פפטידים proteotypic משמשים על כימות. אם isoform מזוהה להבטיח שזה בסיסים על תצפיות של tryptic פפטיד המורכב מרצף חומצה אמינית ייחודית isoform ספציפיים. כל החלבונים "דומה" או היפותטי צריך לעבור השוואה כדי לראות אם התצפיות פפטידים שיתאימו חלבון ידוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח ה-mRNA
תוצאות ה-mRNA ניתן לבטא הפצת mRNA מסוים בתוך כל שבר (איור 3 א); על כימות, לשלב שברים תרגום polyribosomal, להשוות תרגומים שאינם השבר (איור 3B), מציג יחס של mRNA שפע בתרגום כדי שברים nontranslating. פרטים נוספים נרכשת על ידי בחינת שברים polysome יעילות גבוהה בנפרד מן יעילות נמוכה polysome שברים (, ונבדלת שברים nontranslating). הדבר חשוב במיוחד בעת ניתוח miRNAs, אשר הם מועשרים בשברים יעילות נמוכה (איפה הם מפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניתוח הפרופיל polysome מאפשר המחקר של תרגום חלבונים על-ידי ניתוח המדינה translational של mRNA ספציפי או את כל transcriptome6,7. זה גם לעזר רב כאשר תרגום מקומי צריך להילמד כמו synaptosomes8. באופן מסורתי, שיטה זו כרוכה ההפרדה של מונו - polyribosomes ואת mRNAs המשויך את הדרגה סוכרוז אשר יכול להיות בשילוב עם גנומית או פרוטיאומיה מבנית הטכניקות להשגת תוצאות המיועד6,9. למשל, מחקר שנערך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

HL112730 NIH P01 (סמרטוט, JVE), NIH R01 HL132075 (סמרטוט, JVE), מרכז הלב של ברברה סטרייסנד נשים (סמרטוט, JVE), דורותי, ליון פיליפ אי יו ר בקרדיולוגיה מולקולרית (סמרטוט), אריקה גלייזר ניחן כסא בריאות הלב של האישה (JVE), האקדמיה למדעים הצ'כי תמיכה מוסדית RVO: 68081715 (MS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373להמתת חסד
HeparinSagent103424המשמש במלקחיים להכנת לנגנדורף
Fine Science Tools91110-10המשמש לתליית הלב
מערכת LangendorffRadnoti + תוצרת ביתn/aמערכת 'ארבעה לבבות' המורכבת מזכוכית מנופחת בהתאמה אישית, צינורות ואמבטיות מים
NaClSigmaS7653-5KGמאגר קרבס ושיפוע סוכרוז
KClSigmaP5405מאגר קרבס ומאגר ליזה
KH2PO42SigmaP-5504מאגר קרבס
MgSO4SigmaM7774-500Gמאגר קרבס
גלוקוזסיגמאG5767מאגר קרבס
CaCl2SigmaC1016-500Gמאגר קרבס
אבקת סוכרוזSigmaS0389-1KGשיפוע סוכרוז
MgCl2Sigma208337שיפוע סוכרוז ומאגר ליזה
Tris-baseSigmaT1503-1KGשיפוע סוכרוז ומאגר ליזה
קסילן ציאנולסיגמאX-4126שיפוע סוכרוז
CycloheximideSigma-aldrich239763שיפוע סוכרוז ומאגר ליזה
RNaseOUTLife TechnologiesC00019מעכב RNAse למאגר ליזה
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021מאגר ליזה
מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל, רוש 5056489001
ללא EDTAצינור, דופן דקה, שקוף במיוחד, 13.2 מ"ל, 14 מ"מ x 89 מ"מבקמן קולטר344059
אולטרה-צנטריפוגהבקמןLE-80Kאולטרה-צנטריפוגה של השיפועים
רוטורבקמןSW41אולטרה-צנטריפוגה של השיפועים
Biologic LP (משאבה)Biorad731-8300פיצול השיפועים
BioFracBiorad741-0002פיצול השיפועים
מיקרוצנטריפוגה של Eppendorf RNA/DNA LoBind, צינור 2 מ"לSigmaZ666513-100EAשבר שיפוע ומיצוי RNA
מגיב TRIzol טכנולוגיותחייםAM9738מיצוי RNA
בקרת לוציפראז מיצוי RNAPromegaL4561מיצוי RNA
כלורופורםפישר מדעיC606-4RNA מיצוי
גליקוגן, דרגת RNAThermo Fisher ScientificR0551מיצוי RNA
איזופרופנולSigmaI9516מיצוי RNA
אתנולסיגמאE7023-1Lמיצוי RNA
iScript cDNA ערכת סינתזהBioRad170-8891שעתוק הפוך
iTaq אוניברסלי SYBR Green SupermixBioRad175-5122PCR קוונטי
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Kit לבידוד RNA כולל
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit לשעתוק הפוך של miRNA
miScript Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Kit לניתוח ביטוי PCR בזמן אמת של miRNAs
צנטריפוגה 5424REppendorfלצנטריפוגה של צינורות של 1.5 מ"ל או 2.0 מ"ל בטמפרטורות שונות. מהירות מקסימלית - 21130 x g
צנטריפוגה 5810REppendorfלצנטריפוגה של לוחות PCR בזמן אמת בטמפרטורות שונות. מהירות מקסימלית - 2039 x g
My Cycler Thermal CyclerBio-Radלשעתוק הפוך
CFX96 מערכת בזמן אמת/C1000 מגע Thermal CyclerBio-Radלניתוח PCR בזמן אמת
miRNeasy סרום/פלזמה בקרת ספייק איןQiagen219610לבקרת איכות של בידוד RNA
לוחות PCR קשיחים 96 בארות, פרופיל נמוך, קיר דק, חצאית, ירוק/שקוףBio-RadHSP9641לניתוח PCR בזמן אמת
Microseal 'B' PCR Plate Seal Seal, דבק,MSB1001 Bio-Radלאיטום לוחות PCR בזמן
אמת מחקר בתוספת פיפטה חד-ערוצית, אפור; 0.5-10 ומיקרו; LEppendorfUX-24505-02לפיפטינג
פיפטמן פיפט קלאסי, P20גילסוןF123600Gלפיפטינג
פיפטמן פיפט קלאסי, P200גילסוןF144565לפיפטינג
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS פיפטה 100-1000 ומיקרו; LGilson17011782עבור פיפטינג
גליקוגן, דרגת RNAThermo Fisher ScientificR0551משפר את יעילות בידוד ה-RNA הכוללת
Posi-Click 1.7 מ"ל צינורות, צבע טבעיDenvilleC2170בידוד ואחסון RNA; תערובת ריאגנטים
צינורות רכיבה תרמית -0.2 מ"ל כובעים בודדים, צינורות סטנדרטיים של 0.2 מ"ל עם אופטיתDenvilleC18098-4 (1000910)תגובת שעתוק הפוכה
שארפ 10 טיפים מחסום דיוקדנווילP1096-FRעבור פיפטינג
חד 20 טיפים מחסום דיוקדנווילP1121עבור פיפטינג
חד 200 טיפים מחסום מדויקדנווילP1122עבור טיפים לפיפטינג
LTS 1 מ"ל מסנןRaininRT-L1000Fעבור פיפטינג
miScript מבחן פריימר ( 200)Qiagen(זה משתנה בהתאם ל-miRNA)לניתוח PCR בזמן אמת
Gradient Master ver 5.3 Model 108BioComp Instrumentsלהכנת שיפועי סוכרוז
חומצה טריכלורואצטיתSigma AldrichT6399
אצטוןSigma Aldrich650501
Tris hydrochlorideAmrescoM108
דיתיותרייטולפישר סיינטיפיקBP172
יודואצטמידGbiosciencesRC-150
ריצוף טריפסין שונה בדרגת ריצוף, חזירPromegaV5111
אמוניום ביקרבונטBDHBDH9206
חומצה פורמית, אופטימה LC/MSפישר כימיקלA117
מתנול, אופטימה LC/MSפישר כימיקלA454
אצטוניטריל, אופטימה LC/MSפישר כימיקלA996
חלבון LoBind צינורות 0.5 מ"לEppendorf AG22431064
חלבון LoBind צינורות 1.5 מ"לEppendorf AG22431081
HLB ומיקרו; צלחת סילוק 30 ומיקרו; mOasis186001828BA
רכז SpeedVacThermo ScientificSavant SPD2010
סוניקטורQsonicaOasis180
צנטריפוגהThermo ScientificSorvall Legend micro 21R
LC עמוד מלכודת PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
עמודת הפרדה LC PepMap RSLC C18ספקטרומטר מסה Thermo Scientific164536
Thermo ScientificOrbitrap Elite מלכודת יונים ספקטרומטר
MSConvert תוכנהProteoWizard Toolkit
תוכנת Sorcerer-SEQUESTSage-N Research, Inc.
צינורות טכנולוגיות חיים אופטי מסה

מקורות

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750(2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303(2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TCAmRNA
פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.