פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

תקציר

לימודי שינויים דינמיים בתרגום חלבונים דורשים שיטות מיוחדות. כאן נבחנו שינויים בחלבונים מסונתז לאחרונה, בתגובה איסכמיה, פגיעה reperfusion באמצעות הלב העכבר perfused מבודדים בשילוב עם polysome פרופיל. כדי להבין עוד יותר את השינויים הדינמיים בתרגום חלבונים, אנחנו מאופיין mRNAs זה היו מפוצצות ריבוזומים cytosolic (polyribosomes או polysomes) וגם התאושש polysomes מיטוכונדריאלי ו לעומת התפלגות mRNA וחלבון ב יעילות גבוהה שברים (מצורף mRNA הריבוזומים רבים), נמוך-יעילות (פחות ריבוזומים מצורף) אשר כללה גם את polysomes מיטוכונדריאלי, השברים ללא תרגום. miRNAs ניתן גם לשייך mRNAs זה מתורגם, ובכך להפחית את היעילות של תרגום, שבדקנו את חלוקת miRNAs לאורך השברים. ההתפלגות של mRNAs, miRNAs חלבונים נבדק בתנאים perfused הבזליים, בקצה של 30 דקות של איסכמיה זרימה לא גלובלי, ואחרי 30 דקות של פגיעה reperfusion. כאן אנו מציגים את שיטות השתמשו כדי לבצע ניתוח זה — בפרט, הגישה אופטימיזציה של חלבון החילוץ של מעבר הצבע סוכרוז, כמו זה לא תואר קודם — ולספק תוצאות נציג.

מבוא

הלב מגיב לפציעה של איסכמיה (I), פגיעה reperfusion (R) בצורה דינמית. עם זאת, יש קצת תובנה חריפה לשינויים סינתזת חלבונים במהלך התגובה. כדי לטפל בבעיה זו, לקחנו היתרון של השיטה ומבוססת של polysome פרופיל¹ כדי לזהות שינויים בשפע חלבון המשקפים הפצה של הריבוזומים ו translational גורמים רגולטוריים מ ציטוזול כדי polysomes, ו לודיג לאחרונה מסונתז חלבונים (NSPs). בסביבה של אני / R, הגדלת סינתזת החלבון החדש מתרחש במסגרת זמן זה אינו עולה בקנה אחד עם שעתוק של mRNAs חדש²; יתר על כן, הכתבים בין רמות הביטוי mRNA ושפע חלבון כבר דווח על³. מסיבות אלה, בחרנו לנתח השינויים פרוטאום דינמי כפי שהיא משתקפת תרגום החלבון. כדי לעשות זאת, אנחנו לכמת mRNA שברים polysome, ולנתח את הרכב החלבון בשברים polysome. לבסוף, מאחר מיקרו Rna (מירס) לווסת את הזמינות של mRNAs לתרגום יכולים להפריע היעילות של חלבון תרגום^4,5, בדקנו את ההפצה של מירס בחלקים polysome, התמקדות תגובה / רבי

בחרנו להשתמש בעכבר מבודד Langendorff זלוף המודל לבין רקמת שנקטפו בתנאים הבזליים של רציף זלוף, אחרי איסכמיה זרימה לא גלובלי 30 דקות, ואחרי 30 דקות של איסכמיה ואחריו 30 דקות של פגיעה reperfusion. אנחנו solubilized את רקמת הלב ואז מופרדים polysomes מעבר הדרגתי סוכרוז, ואחריו פרוטיאומיה מבנית ניתוח וזיהוי סלקטיבי של mRNAs ושל miRNAs ע י PCR microarray, בהתאמה. שילוב זה של שיטות מייצג גישה רב-עוצמה להבנת פרוטאום דינמי, המאפשר זיהוי סימולטני של mRNA, miRNA, NSPs, כמו גם הפצה מחדש של חלבוני, miRNA ו- mRNA בין שברים nontranslating, יעילות נמוכה polysomes, יעילות גבוהה polysomes (ראה איור 1). תובנות ברגולציה דינמי של תהליך זה יורחב על ידי ניתוח נוסף של זירחון של גורמים רגולטוריים מרכזיים כגון eIF2α או mTOR. צעדים בודדים אלה מתוארים עכשיו בפירוט.

פרוטוקול

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל היו שבוצעה בהתאם המוסדיים הנחיות ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff זלוף העכבר לב

1. Langendorff זלוף העכבר לב עם איסכמיה, פגיעה reperfusion
   1. לנהל סודיום פנטוברביטל בקרום הבטן 70 מ"ג/ק"ג העכבר בוגרים (8-בת שבוע, זכר, C57BL6/j). לאשר הרדמה עמוקה על ידי חוסר משיכה שאורך צביטה.
   2. Anticoagulate עם הפרין בקרום הבטן 500 U/ק"ג.
   3. . תפתח את התיבה דרך החתך בחזה ובצלעות פתח הסרעפת וחותכים לאורך הגבול costal לציר בבית השחי הקדמי. . תעצור את הציר הקדמי בבית השחי עד forelimb כדי לפתוח לגמרי את כלוב בית החזה. לאחר מכן, להמחיש את הלב, תהדק את העורקים עם מלקחיים, במהירות לסלק את הלב. המוות הוא עקב דימום למוות. מקום בלב קר קרבס (NaCl 6.9 g/L, אשלגן כלורי 0.35 g/L, NaHCO₃ 2.1 g/L, ח'₂PO₄ 0.16 g/L, MgSO₄ 0.141 g/L, גלוקוזה, 2 g/L ו- CaCl₂ 0.373 g/L).
   4. נקרר את העורקים עם מחט וקהה, perfuse את הלב retrogradely עם פתרון קרבס במצב לחץ קבוע.
   5. לאחר ייצוב פרק זמן של 15 דקות, נושא את הלב איסכמיה גלובלית זרימה לא למשך 30 דקות ולאחריו פגיעה reperfusion למשך 30 דקות.
   6. הקציר לבבות לאחר 15 דקות בסיסית זלוף, לאחר 30 דקות איסכמיה או לאחר פגיעה reperfusion 30 דקות. לקצץ את אטריה, snap-הקפאת הרקמה של חנקן נוזלי.
   7. לאחסן ב- 80 ° C עד לשימוש

2. רקמת המגון, Solubilization, צפיפות סוכרוז שקיעת מעבר צבע

1. הכנה מעבר צבע
   1. להכין 2 פתרונות (15% ו- 50%) של סוכרוז 100 מ ל, ערבוב 4 מ"ל של NaCl 2.5 מ';
      MgCl 0.8 מ ל₂ 1.25 מ'; 1 מ"ל טריס-HCl 1 מ', pH 7.5; 15 גרם או 50 גר' סוכרוז (עבור 15% ו- 50%, בהתאמה); הנדסה גנטית מים כדי להגיע 100 מ; קסילן cyanol (0.02 נקודות mg/mL) לצבע הפתרון 15%
   2. לסנן את כל הפתרונות (0.22 מסננים מיקרומטר)
   3. היום שמעבר הצבע היא לשמש, להכין 40 מ של כל פתרון סוכרוז, להוסיף cycloheximide כל פתרון כדי להשיג את הריכוז הסופי של µg 100/mL
      1. שימוש מכונת מעבר צבע כדי להכין שילוב בין 15% ל- 50% סוכרוז הפתרונות
      2. למלא את התא השמאלי עם 5 מ של המילוי ההדרגתי 15% סוכרוז
      3. למלא את התא הנכון במעבר 50% סוכרוז
      4. לפתוח את הברז ולעבור על המשאבה להניע את שני תאים קטנים עם פגים
      5. שימוש צינור קשורה בהקשה השנייה כדי לאפשר את הפתרון סוכרוז מעורב לזרום בצינור אולטרה-צנטריפוגה עם קירות דקים. נפח הסופי יהיה בסביבות 10 מ"ל.
   4. לשמור על מעברי הצבע ב 4 ° C (לילה אם יש צורך, אבל לא יותר)
2. המגון רקמת הלב
   1. Homogenize טרי או קפוא הלב עם polytron במאגר פירוק מסוננים (שונה עבור fractionation הדרגתיות סוכרוז) המכיל 100 מ מ אשלגן כלורי, 20 מ מ טריס pH 7.5, 5 מ מ MgCl₂, 0.4% NP-40. כוללים 100 cycloheximide µg/mL כדי לשמור על מבנה polysome, 0.1 U RNase מעכב, מעכבי פרוטאז קוקטייל (1 טבליה עבור 50 מ ל).
   2. דגירה של lysate על קרח 15 דקות.
   3. צנטריפוגה ב x 18,000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי להסיר חומרים לא מסיסים ולאסוף את תגובת שיקוע.
   4. הזמינו µL 50 עבור קביעת חלבון, בידוד RNA וניתוח RNA תקינות (ראה איור 2).
   5. שכבה את תגובת שיקוע (500 – 100 µL) על מעברי הצבע ולאזן את הצינורות עם פירוק מאגר.
3. שקיעת ואוסף של שברים
   1. בצע ultracentrifugation עבור 120 דקות-37,000 סל ד ב 4 ° C ברוטור דלי מתנדנדים. לדברי היצרן, זה מקביל x 228,000 g ב- radius מקסימלי.
   2. לאסוף את כל מעבר צבע כשברים 17 (כ-600 µL כל שבר) microcentrifuge צינורות עם ניטור רציף של ספיגת-254 ננומטר (OD₂₅₄).
   3. תוכנית האספן שבר כדלקמן:
      1. למחוק את 3 דקות הראשונה של האוסף (תואם להנוזל הכלול הצינורות לפני מעבר הצבע)
      2. בין 4 ל- 19 דקות, לאסוף את השברים במהירות של 1 מ"ל לדקה בחלקים 17.
   4. למקם השברים בקרח ברגע אחד נאסף. הקפאת דגימות ב-80 מעלות צלזיוס, אם הם לא המעובדות מיד. עקיבה densitometric UV טיפוסי של מעבר הצבע כמו זה נאסף מוצג באיור1.

3. בידוד וניתוח של mRNAs Polysome, שברים Nontranslating

1. הפקת mRNA
   1. הפשרת השברים בקרח, אם הם היו קפואה לאחר אוסף
   2. µL 200 של כל שבר להעביר צינור טריים
      הערה: בשלב זה, שברים ברציפות שתיים או יותר יכול להיות איחדו ביחד. זה צריך להיעשות בזהירות לאחר ניתוח הגרף₂₅₄ OD כך polysome ו- polysome ללא שברים לא מבלבל.
   3. להוסיף 10 ng של לוציפראז RNA כמו בקרה פנימית על כל דגימה לצורך נורמליזציה.
      הערה: לוציפראז תחל צריך לשמש פקד פנימי לנרמל את התוצאות.
   4. להוסיף 700 µL של ריאגנט החילוץ RNA (תמיסת monophasic פנול, guanidine isothiocyanate; ראה טבלה של חומרים) כל שפופרת. מערבבים היטב, דגירה של הצינורות עבור 5 דקות ב RT (טמפרטורת החדר).
   5. הוסף 140 µL כלורופורם, מערבולת על Incubate ס' 15 דקות 2-3-RT.
   6. Centrifuge את הדגימות למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
   7. להעביר בזהירות מימית השלב העליון צינור חדש.
   8. מאז בתוכן הרנ א של השברים אינה גבוהה, להוסיף 10 µg של גליקוגן כנשא כל שפופרת.
   9. להוסיף אלכוהול איזופרופיל µL 350 כל שפופרת. מערבבים היטב, דגירה ב-20 ° C עבור h 1 כדי להגדיל את התשואה.
   10. צנטריפוגה למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
   11. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 700 אתנול µL 75% לשטוף בגדר RNA.
   12. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 7,500 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
   13. הסר אתנול, תנו לאוויר צניפה יבש למשך 10-15 דקות.
       הערה: ייבוש יתר בגדר RNA תמנע שלה solubilization מלאה במים.
   14. Resuspend בגדר RNA ב- 50 μL של RNase ללא הנדסה גנטית H₂O.
   15. דגירה הדגימות 10 דקות-55 מעלות צלזיוס.
   16. השתמש μL 2 של כל מדגם למדוד את האיכות והכמות של RNA שחולצו ולאחסן את השארית ב-80 מעלות צלזיוס.
2. שעתוק במהופך, qPCR
   1. השתמש 4 μL שעתוק במהופך cDNA סינתזה של קיט (ראה טבלה של חומרים) לתגובה 20 μL. הכינו את supermix על פי מספר דוגמאות. להעביר את אמצעי האחסון הדרושים כל שפופרת ולהוסיף 5 μL של הקלט RNA כל שפופרת. ניתן לתקן אמצעי אחסון זה להיות רלוונטי עבור הטווח לתנאי העבודה של פולימראז Taq.
   2. דגירה של צינורות הצנטרפוגה תרמי עם התוכנית הבאה המומלץ על ידי היצרן: 5 דקות 25 ° c, 20 דקות שעתוק במהופך למשך 20 דקות ב 46 ° C, איון רוורס טרנסקריפטאז עבור 1 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס.
   3. הפעל את qPCR עם התוכנית ממוטב עבור כל זוג של צבעי יסוד.
      הערה: כדי לזהות הנוכחות של mRNAs מסויימים בחלקים, נפח שווה של כל שבר (של RNA מבודד) יש להשתמש עבור שעתוק במהופך.
3. ניתוח של התוצאות
   1. השתמש בערך Ct של הגן מעוניין, את לוציפראז כדי לחשב את הערכים Ct דלתא
   2. אקספרס דלתא שבר כל ערך Ct כאחוז מתוך סה כ ערך mRNA הכלול כל השברים להמחיש את ההפצה של mRNA מעבר שברים שונים (טבלה 1)

4. בידוד וניתוח של miRNAs מ Polysome שברים שברים Nontranslating

1. הפקת mRNA, miRNA
   הערה: פרוטוקול זה עוקב אחר הוראות היצרן, עם כמה שינויים.
   1. להפשיר את הגליקוגן ואת הפקד ספייק-אין. לשמור על הקרח.
   2. להוסיף 700 µL של miRNA החילוץ ריאגנט µL 200 מדגם במאגר.
   3. הוסף µg 1/µL של גליקוגן, homogenize אותו בעזרת פיפטה. תקופת דגירה זה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. מוסיפים 3.5 µL של 1.6 x⁸ 10 ספייק-אין שליטה ומערבבים אותו.
   5. להוסיף 200 µL של כלורופורם, מערבולת זה במשך 15 שניות לפחות.
   6. תקופת דגירה של 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. צנטריפוגה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
   8. באמצעות פיפטה של, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ. למחוק את שלבי האמצעי והתחתון.
   9. להוסיף 1.5 x נפח של 100% אתנול תגובת שיקוע, ולערבב.
   10. העברת 700 µL של תערובת זו לעמודה החילוץ miRNA ו- centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT, להשליך הזרימה דרך; חזור על שלב זה עם דוגמה הנותרים.
   11. להוסיף 700 µL מאגר 1 לעמודה, centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
   12. להוסיף 500 µL מאגר 2 העמודה, centrifuge זה במלוא המהירות עבור 15 s ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
   13. להוסיף 500 µL של 80% אתנול העמודה, centrifuge זה במלוא המהירות למשך 2 דקות ב RT; למחוק את הזרימה דרך.
   14. להעביר את העמודה mL 2 חדש uncapped צינור, פותחים את המכסה, centrifuge זה ב RT במשך 5 דקות במהירות מלאה; למחוק את הזרימה דרך.
   15. להוסיף 16 µL של מים נטולי RNAse העמודה ואת צנטריפוגה זה מלא מהירות של 1 דקות ב- RT. שמור את eluate על הקרח או לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח עתידי.
       הערה: שני microliters של כל מדגם יכול לשמש לניתוח יתר.
2. שעתוק במהופך
   1. הכן על קרח. עבור כל תגובה RT-PCR 20 µL, להוסיף 4 µL של המאגר RT miRNA, 2 µL של חומצות גרעין, µL 9 של RNA הכולל, 2 µL של האנזים µL 3 RNAse ללא מים; לערבב את זה ואת זה ספין למטה בקצרה.
   2. הגדר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן:
      37 º C למשך 60 דקות;
      95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות;
      4 ° C החזק.
   3. להסיר את הצינורות הצנטרפוגה תרמי ולהוסיף µL 200 RNAse ללא מים. ב-20 ° C או להמשיך ה-PCR בזמן אמת.
3. PCR בזמן אמת
   הערה: פרוטוקול זה עוקב אחר עיצוב הצלחת היטב 96. מכינים את תערובת התגובה על קרח.
   1. להכין תערובת התגובה PCR ולהוסיף cDNA (מתוך miRNAs לעיל) על פי הטווח התקבלה על-ידי הפרוטוקול. ניתן להכין תגובות מרובות באצווה.
   2. להוסיף סך של 25 µL של ה-PCR מיקס + cDNA מכל קידוח.
   3. חותם את הצלחת בעזרת חותם על צלחת אופטי.
   4. Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 1,000 x g בטמפרטורת החדר.
   5. תוכנית הצנטרפוגה בזמן אמת כדלקמן:
      שלב ההפעלה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות;
      3-צעד רכיבה על אופניים: דנטורציה ב 94 ° C 15 s; חישול ב 55 ° C ל 30 s; סיומת ב 70 ° C ל 30 s (לבצע איסוף נתונים קרינה פלואורסצנטית); להוסיף 40 מחזורי;
      התכה-עיקול על פי הצנטרפוגה ברירת המחדל.
4. ניתוח השוואתי
   1. דוגמה של נורמליזציה (ראה טבלה 2):
      1. למצוא את הערך המינימלי של SCM.
      2. לנרמל את כל הערכים SCM למינימום הזה.
      3. לחסר ערך זה לפי הערכים Ct של miRNAs של עניין (MOI) הפניה ג'ין (שופט).
      4. ניתוח נתונים באמצעות הנוסחה 2^-ΔCt .

5. פרוטיאומיה מבנית ניתוח

1. מיצוי של חלבונים של שברים polysome
   1. לשלב סוכרוז שנאספו שברים שברים סופית שלוש. לסמן השברים כבד (יעילות גבוהה polysomes בחלקים במאגר 4, 5, 6 ו-7 עם הריכוז הגבוה ביותר של סוכרוז; התחתון של צינור מעבר צבע), אור (יעילות נמוכה polysomes ב שבר במאגר 8, 9, 10 ו- 11; אמצע שפופרת צבע) או ללא תרגום (שברים במאגר 12, 13, 14 ו 15 עם הריכוז הנמוך ביותר של סוכרוז; העליון של הצינור מעבר צבע). לבצע חלבון assay בשברים במאגר.
   2. להכין מלאי 100% של חומצת חומץ טריכלור (TCA) ואחסן אותו ב 4 ° C בחושך. מערבבים 0.5 מ של דגימה עם 60 µL של 100% TCA דגירה ב-20 ° C בלילה בחושך.
      הערה: השתמש 1.5 mL חלבון נמוכה השמירה צינורות (ראה טבלה של חומרים).
   3. לאחר דגירה לילה, להפשיר את הדגימה על קרח, צנטריפוגה ב 15,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להשליך תגובת שיקוע.
      הערה: µg 100 של חלבון הכולל דוגמה נותן חלבון גלוי צניפה בתחתית צינור.
   4. מראש מקררים אצטון במקפיא-20 ° C. להוסיף 0.5 מ של אצטון קר חלבון צניפה, צנטריפוגה ב 15,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להשליך תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים.
   5. האוויר יבש בגדר. Resuspend בגדר ב 360 µL מאגר טריס-HCl 50 מ מ (pH 8).
      הערה: אם יש צורך, להשתמש sonicator הדופק כדי resuspend בגדר.
   6. להוסיף 40 µL של 0.1 M dithiothreitol (ריכוז סופי 10 מ מ) דגירה -55 מעלות צלזיוס על שאכר במשך 45 דקות להוסיף 50 µL של 0.15 מ' iodoacetamide (ריכוז סופי 17 מ"מ) דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר למשך 30 דקות בחושך.
   7. להכין פתרון טריפסין: resuspend 20 µg של טריפסין ב 100 µL של 50 מ מ אמוניום ביקרבונט. להוסיף נפח המתאימים של טריפסין פתרון מדגם 1:50 (w/w) יחס טריפסין: חלבון, ודא כי ה-pH 8, דגירה על שאכר ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: להוסיף 1 מ' אמוניום ביקרבונט כדי להביא pH 8.
   8. לאחר עיכול טריפסין, מגניב המדגם, צנטריפוגה בקצרה בצנטריפוגה ספסל, להוסיף 10% חומצה פורמית pH 2-3 כדי להרוות את הפעילות טריפסין, ולהמשיך עם מדגם desalting.
      הערה: השתמש בצלחת • ממוצע-תנאי עבור מדגם desalting.
   9. במצב sorbent הבארות של 96 טוב צלחת עם 200 µL של מתנול באמצעות ואקום שלוש פעמים ולאחריו על ידי מיזוג µL 200 חומצה פורמית 0.1% שלוש פעמים. לטעון מדגם ולבצע שטיפה מדגם באמצעות µL 200 חומצה פורמית 0.1% שלוש פעמים. Elute הדגימה עם 100 µL 50% acetonitrile/0.1% חומצה פורמית פעמיים לתוך חלבון נמוכה השמירה 0.5 mL שפופרת.
      הערה: Elute המדגם לאט בהתחלה באמצעות הכבידה ואחריו ואקום נמוכה.
   10. להתאדות מדגם eluate ליובש באמצעות רכז, גם ישירות לבצע ניתוח ספקטרומטר מסה או חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
2. ניתוח ספקטרומטר מסה
   1. לשקם כל גלולה (המורכב פפטידים tryptic) ב- 50 – 100 µL, להזריק 1 µL לתוך ספקטרומטר מסה.
      הערה: מטב שיחזור ומסוג הזרקת כדי לקבל את העוצמה המקסימלית LC/MS/MS אות. במקרה שלנו, האות המרבי (סה כ יון הנוכחי; טיק) בתוך הלב של הסריקה היה בטווח של 1E8 כדי 2E9.
   2. להשתמש בעמודה מלכודת סי18 (300 µm זהות x 5 מ מ, 5 מיקרומטר, 100Å) ואחריו פפטיד הפרדה באמצעות סי18 עמודה (75 µm זהות x 250 מ מ, 2 מיקרומטר, 100Å) עם קביעת קצב זרימה-300 nL לדקה סט הטמפרטורה נימי ננו-מקור 275 מעלות צלזיוס, המתח ספריי 2 kV.
   3. להחיל מעבר צבע ליניארי של 5 – 35% B במשך 90 דקות, 35 – 95% B במשך 3 דקות, מחזיק ב- 95% B עבור 7 דקות ו- equilibration ב-5% B במשך 25 דקות (a: 0.1% חומצה פורמית/מים וב': 0.1% חומצה פורמית ב- acetonitrile). רוכשים MS2 spectra עבור היונים 15 בעוצמה הגבוהה ביותר של כל סריקה MS1 באמצעות מצב CID. עבור כל דגימה לבדיקה לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט 3 משכפל ספקטרומטר מסה.
      הערה: מיטוב ולהשתמש את הפרמטרים המתאימים לדוגמאות שלך על הכלי ספקטרומטר מסה מסוימת ותנאים ניסיוני. התנאים/הפרמטרים שהוזכרו בסעיף 5.2. היו בשימוש וממוטב במעבדה שלנו.
3. זיהוי חלבונים/כימות
   1. אחרי ניתוח ספקטרומטר מסה, להמיר את קבצי raw ספקטרה mzXML תואם את הקבצים באמצעות תוכנת MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
   2. להגיש את הקבצים שעברו המרה לתוך SEQUEST מנוע חיפוש עם קריטריוני החיפוש, למשל, UniProtKB/שוויצרי-פרוט העכבר מסד (וברקוד שנסקרו קנונית); תקציר אנזים למחצה באמצעות טריפסין (לאחר KR /-); עם אדמירל שלא נענתה עד 2; טווח המוני קודמן: 400 עד 4,500 אמו; השינוי סטטי: carbamidomethyl (ג) 57.021465 אמו; רגישות מסה פפטיד: 50 דפים לדקה; קטע המוני מסוג: monoisotopic.
      הערה: אחרים חלבון מסד נתונים חיפוש מנועי ונתונים צינורות ניתן להשתמש. אם משתמש מסד הנתונים עבור למשל עכברוש, אשר תושלם פחות מאשר מסדי נתונים עבור האדם של עכבר, ייתכן שיהיה עליך לחפש נגד העכבר (או האדם) מסדי נתונים כדי להגדיל פרוטאום כיסוי. במקרה זה, יתירות בשמות חלבון יהיה צורך להסירו.
   3. ביצוע ניתוח שלאחר חיפוש. הגדר את מסנני לתצוגת הנתונים. לדוגמה, הגדר הסתברות המינימלי חלבון (חלבון מפתן) 95% או 99%, קרי, יוצג רק את החלבונים שעבורם ניתוח סטטיסטי מרמז על 95% או 99% ההסתברות להיות נוכח במדגם. להגדיר את המסנן על הסף פפטיד (למשל, 95%), קרי, הסתברות המינימלי שישמש לקביעת אם קשת מזהה פפטיד. בחר את המספר המינימלי של פפטידים שיקבעו אם חלבון קיים (2 פפטידים מינימום לזיהוי חלבון מומלצת).
   4. הערכת חלבונים מזוהה עבור כמות/איכות. ודא כי פפטידים proteotypic משמשים על כימות. אם isoform מזוהה להבטיח שזה בסיסים על תצפיות של tryptic פפטיד המורכב מרצף חומצה אמינית ייחודית isoform ספציפיים. כל החלבונים "דומה" או היפותטי צריך לעבור השוואה כדי לראות אם התצפיות פפטידים שיתאימו חלבון ידוע.

תוצאות

ניתוח ה-mRNA
תוצאות ה-mRNA ניתן לבטא הפצת mRNA מסוים בתוך כל שבר (איור 3 א); על כימות, לשלב שברים תרגום polyribosomal, להשוות תרגומים שאינם השבר (איור 3B), מציג יחס של mRNA שפע בתרגום כדי שברים nontranslating. פרטים נוספים נרכשת על ידי בחינת שברים polysome יעילות גבוהה בנפרד מן יעילות נמוכה polysome שברים (, ונבדלת שברים nontranslating). הדבר חשוב במיוחד בעת ניתוח miRNAs, אשר הם מועשרים בשברים יעילות נמוכה (איפה הם מפ...

דיון

ניתוח הפרופיל polysome מאפשר המחקר של תרגום חלבונים על-ידי ניתוח המדינה translational של mRNA ספציפי או את כל transcriptome^6,7. זה גם לעזר רב כאשר תרגום מקומי צריך להילמד כמו synaptosomes⁸. באופן מסורתי, שיטה זו כרוכה ההפרדה של מונו - polyribosomes ואת mRNAs המשויך את הדרגה סוכרוז אשר יכול להיות בשילוב עם גנומית או פרוטיאומיה מבנית הטכניקות להשגת תוצאות המיועד^6,9. למשל, מחקר שנערך ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Pentobarbital	Vortech Phamaceuticals	9373	להמתת חסד
Heparin	Sagent	103424	המשמש במלקחיים להכנת לנגנדורף
	Fine Science Tools	91110-10	המשמש לתליית הלב
מערכת Langendorff	Radnoti + תוצרת בית	n/a	מערכת 'ארבעה לבבות' המורכבת מזכוכית מנופחת בהתאמה אישית, צינורות ואמבטיות מים
NaCl	Sigma	S7653-5KG	מאגר קרבס ושיפוע סוכרוז
KCl	Sigma	P5405	מאגר קרבס ומאגר ליזה
KH2PO42	Sigma	P-5504	מאגר קרבס
MgSO4	Sigma	M7774-500G	מאגר קרבס
גלוקוז	סיגמא	G5767	מאגר קרבס
CaCl2	Sigma	C1016-500G	מאגר קרבס
אבקת סוכרוז	Sigma	S0389-1KG	שיפוע סוכרוז
MgCl2	Sigma	208337	שיפוע סוכרוז ומאגר ליזה
Tris-base	Sigma	T1503-1KG	שיפוע סוכרוז ומאגר ליזה
קסילן ציאנול	סיגמא	X-4126	שיפוע סוכרוז
Cycloheximide	Sigma-aldrich	239763	שיפוע סוכרוז ומאגר ליזה
RNaseOUT	Life Technologies	C00019	מעכב RNAse למאגר ליזה
Igepal CA-360 (NP40)	Sigma	I3021	מאגר ליזה
מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל, רוש 5056489001
ללא EDTAצינור, דופן דקה, שקוף במיוחד, 13.2 מ"ל, 14 מ"מ x 89 מ"מ	בקמן קולטר	344059
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן	LE-80K	אולטרה-צנטריפוגה של השיפועים
רוטור	בקמן	SW41	אולטרה-צנטריפוגה של השיפועים
Biologic LP (משאבה)	Biorad	731-8300	פיצול השיפועים
BioFrac	Biorad	741-0002	פיצול השיפועים
מיקרוצנטריפוגה של Eppendorf RNA/DNA LoBind, צינור 2 מ"ל	Sigma	Z666513-100EA	שבר שיפוע ומיצוי RNA
מגיב TRIzol טכנולוגיות	חיים	AM9738	מיצוי RNA
בקרת לוציפראז מיצוי RNA	Promega	L4561	מיצוי RNA
כלורופורם	פישר מדעי	C606-4	RNA מיצוי
גליקוגן, דרגת RNA	Thermo Fisher Scientific	R0551	מיצוי RNA
איזופרופנול	Sigma	I9516	מיצוי RNA
אתנול	סיגמא	E7023-1L	מיצוי RNA
iScript cDNA ערכת סינתזה	BioRad	170-8891	שעתוק הפוך
iTaq אוניברסלי SYBR Green Supermix	BioRad	175-5122	PCR קוונטי
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	Kit לבידוד RNA כולל
miScript II RT Kit (50)	Qiagen	218161	Kit לשעתוק הפוך של miRNA
miScript Sybr Green PCR Kit (200)	Qiagen	218073	Kit לניתוח ביטוי PCR בזמן אמת של miRNAs
צנטריפוגה 5424R	Eppendorf		לצנטריפוגה של צינורות של 1.5 מ"ל או 2.0 מ"ל בטמפרטורות שונות. מהירות מקסימלית - 21130 x g
צנטריפוגה 5810R	Eppendorf		לצנטריפוגה של לוחות PCR בזמן אמת בטמפרטורות שונות. מהירות מקסימלית - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler	Bio-Rad		לשעתוק הפוך
CFX96 מערכת בזמן אמת/C1000 מגע Thermal Cycler	Bio-Rad		לניתוח PCR בזמן אמת
miRNeasy סרום/פלזמה בקרת ספייק אין	Qiagen	219610	לבקרת איכות של בידוד RNA
לוחות PCR קשיחים 96 בארות, פרופיל נמוך, קיר דק, חצאית, ירוק/שקוף	Bio-Rad	HSP9641	לניתוח PCR בזמן אמת
Microseal 'B' PCR Plate Seal Seal, דבק,	MSB1001 Bio-Rad		לאיטום לוחות PCR בזמן
אמת מחקר בתוספת פיפטה חד-ערוצית, אפור; 0.5-10 ומיקרו; L	Eppendorf	UX-24505-02	לפיפטינג
פיפטמן פיפט קלאסי, P20	גילסון	F123600G	לפיפטינג
פיפטמן פיפט קלאסי, P200	גילסון	F144565	לפיפטינג
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS פיפטה 100-1000 ומיקרו; L	Gilson	17011782	עבור פיפטינג
גליקוגן, דרגת RNA	Thermo Fisher Scientific	R0551	משפר את יעילות בידוד ה-RNA הכוללת
Posi-Click 1.7 מ"ל צינורות, צבע טבעי	Denville	C2170	בידוד ואחסון RNA; תערובת ריאגנטים
צינורות רכיבה תרמית -0.2 מ"ל כובעים בודדים, צינורות סטנדרטיים של 0.2 מ"ל עם אופטית	Denville	C18098-4 (1000910)	תגובת שעתוק הפוכה
שארפ 10 טיפים מחסום דיוק	דנוויל	P1096-FR	עבור פיפטינג
חד 20 טיפים מחסום דיוק	דנוויל	P1121	עבור פיפטינג
חד 200 טיפים מחסום מדויק	דנוויל	P1122	עבור טיפים לפיפטינג
LTS 1 מ"ל מסנן	Rainin	RT-L1000F	עבור פיפטינג
miScript מבחן פריימר ( 200)	Qiagen	(זה משתנה בהתאם ל-miRNA)	לניתוח PCR בזמן אמת
Gradient Master ver 5.3 Model 108	BioComp Instruments		להכנת שיפועי סוכרוז
חומצה טריכלורואצטית	Sigma Aldrich	T6399
אצטון	Sigma Aldrich	650501
Tris hydrochloride	Amresco	M108
דיתיותרייטול	פישר סיינטיפיק	BP172
יודואצטמיד	Gbiosciences	RC-150
ריצוף טריפסין שונה בדרגת ריצוף, חזיר	Promega	V5111
אמוניום ביקרבונט	BDH	BDH9206
חומצה פורמית, אופטימה LC/MS	פישר כימיקל	A117
מתנול, אופטימה LC/MS	פישר כימיקל	A454
אצטוניטריל, אופטימה LC/MS	פישר כימיקל	A996
חלבון LoBind צינורות 0.5 מ"ל	Eppendorf AG	22431064
חלבון LoBind צינורות 1.5 מ"ל	Eppendorf AG	22431081
HLB ומיקרו; צלחת סילוק 30 ומיקרו; m	Oasis	186001828BA
רכז SpeedVac	Thermo Scientific	Savant SPD2010
סוניקטור	Qsonica	Oasis180
צנטריפוגה	Thermo Scientific	Sorvall Legend micro 21R
LC עמוד מלכודת PepMap 100 C18	Thermo Scientific	160454
עמודת הפרדה LC PepMap RSLC C18	ספקטרומטר מסה Thermo Scientific	164536
	Thermo Scientific	Orbitrap Elite מלכודת יונים ספקטרומטר
MSConvert תוכנה	ProteoWizard Toolkit
תוכנת Sorcerer-SEQUEST	Sage-N Research, Inc.