ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Jarmila Kralova; Daniela Glatzova; Simon Borna; Tomas Brdicka

doi:10.3791/58081

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

10.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58081

⸱

30 באוקטובר 2018

Jarmila Kralova¹^,² , Daniela Glatzova¹^,²^,³ , Simon Borna¹^,² , Tomas Brdicka¹

¹Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, ²Faculty of Science, Charles University, ³Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

במאמר זה

סיכום

במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז'ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.

תקציר

תאים דנדריטי macrophages מכריע התאים היוצרים את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הם גם לשחק תפקידים חשובים אתחול של תגובה חיסונית אדפטיבית. עבודה ניסיונית עם תאים אלה הוא מאתגר למדי. שפע שלהם איברים ורקמות הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, הם לא יכולים להיות מבודדים במספרים גדולים. הם גם שקשה transfect עם cDNA בונה. במודל מאתר, הבעיות הללו ניתן חלקית להתגבר על ידי במבחנה בידול של מח העצם אבות בנוכחות M-CSF עבור מקרופאגים או GM-CSF עבור תאים דנדריטים. בדרך זו, זה ניתן לקבל כמויות גדולות של תאים אלה מבעלי חיים מעט מאוד. יתר על כן, אבות מח העצם יכול להיות transduced עם וקטורים retroviral נושאת cDNA בונה בשלבים המוקדמים של טיפוח לפני שלהם התמיינות תאי דנדריטי מח עצם נגזר ואת macrophages. לפיכך, התמרה חושית retroviral ואחריו בידול במבחנה ניתן לבטא מבנים שונים cDNA בתאים אלה. היכולת לבטא באופן משמעותי חלבונים חוץ רחמי מרחיבה את טווח ניסויים שניתן לבצע על תאים אלה, כולל תא חי הדמיה של חלבונים פלורסנט, טנדם purifications עבור interactome ניתוחים, ניתוח מבנה פונקציה, ניטור של פונקציות הסלולר עם ביולוגיים ועוד רבים אחרים. במאמר זה, אנו מתארים עבור התמרה חושית retroviral של תאים דנדריטים מאתר מח עצם נגזר ו מקרופאגים פרוטוקול מפורט עם וקטורים קידוד חלבונים מתויג fluorescently. על הדוגמה של שני חלבונים מתאם, OPAL1, PSTPIP2, נדגים את היישום המעשי cytometry זרימה, מיקרוסקופ. נדון גם את היתרונות ואת המגבלות של גישה זו.

מבוא

התאים מיאלואידית מייצגים חלק חיוני של מנגנוני ההגנה שלנו נגד פתוגנים. הם מסוגלים לחסל במהירות חיידקים, וכן תאים גוסס. בנוסף, הם גם מעורבים בוויסות התפתחות רקמת ותיקון ושמירה על הומאוסטזיס¹^,²^,³. כל התאים מיאלואידית להבדיל אבות מיאלואידית נפוצים במח העצם. בידול שלהם לערכות מורפולוגית ושאיכות ברורים רבים היא במידה רבה נשלט על ידי ציטוקינים, שילובים שונים שלהם⁴. תת-קבוצות התאים מיאלואידית ביותר כוללים גרנולוציטים neutrophilic, המקרופאגים, תאים דנדריטים. פגמים בכל אוכלוסיות אלה להוביל להשלכות מסכני גורם חמור בתפקוד של מערכת החיסון אצל בני אדם ו עכברים