מאמר שיטה

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

DOI:

10.3791/58081

⸱

30 באוקטובר 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז'ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים דנדריטי macrophages מכריע התאים היוצרים את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הם גם לשחק תפקידים חשובים אתחול של תגובה חיסונית אדפטיבית. עבודה ניסיונית עם תאים אלה הוא מאתגר למדי. שפע שלהם איברים ורקמות הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, הם לא יכולים להיות מבודדים במספרים גדולים. הם גם שקשה transfect עם cDNA בונה. במודל מאתר, הבעיות הללו ניתן חלקית להתגבר על ידי במבחנה בידול של מח העצם אבות בנוכחות M-CSF עבור מקרופאגים או GM-CSF עבור תאים דנדריטים. בדרך זו, זה ניתן לקבל כמויות גדולות של תאים אלה מבעלי חיים מעט מאוד. יתר על כן, אבות מח העצם יכול להיות transduced עם וקטורים retroviral נושאת cDNA בונה בשלבים המוקדמים של טיפוח לפני שלהם התמיינות תאי דנדריטי מח עצם נגזר ואת macrophages. לפיכך, התמרה חושית retroviral ואחריו בידול במבחנה ניתן לבטא מבנים שונים cDNA בתאים אלה. היכולת לבטא באופן משמעותי חלבונים חוץ רחמי מרחיבה את טווח ניסויים שניתן לבצע על תאים אלה, כולל תא חי הדמיה של חלבונים פלורסנט, טנדם purifications עבור interactome ניתוחים, ניתוח מבנה פונקציה, ניטור של פונקציות הסלולר עם ביולוגיים ועוד רבים אחרים. במאמר זה, אנו מתארים עבור התמרה חושית retroviral של תאים דנדריטים מאתר מח עצם נגזר ו מקרופאגים פרוטוקול מפורט עם וקטורים קידוד חלבונים מתויג fluorescently. על הדוגמה של שני חלבונים מתאם, OPAL1, PSTPIP2, נדגים את היישום המעשי cytometry זרימה, מיקרוסקופ. נדון גם את היתרונות ואת המגבלות של גישה זו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התאים מיאלואידית מייצגים חלק חיוני של מנגנוני ההגנה שלנו נגד פתוגנים. הם מסוגלים לחסל במהירות חיידקים, וכן תאים גוסס. בנוסף, הם גם מעורבים בוויסות התפתחות רקמת ותיקון ושמירה על הומאוסטזיס1,2,3. כל התאים מיאלואידית להבדיל אבות מיאלואידית נפוצים במח העצם. בידול שלהם לערכות מורפולוגית ושאיכות ברורים רבים היא במידה רבה נשלט על ידי ציטוקינים, שילובים שונים שלהם4. תת-קבוצות התאים מיאלואידית ביותר כוללים גרנולוציטים neutrophilic, המקרופאגים, תאים דנדריטים. פגמים בכל אוכלוסיות אלה להוביל להשלכות מסכני גורם חמור בתפקוד של מערכת החיסון אצל בני אדם ו עכברים1,2,3,5, 6.

בניגוד neutrophilic גרנולוציטים, התאים הדנדריטים ומקרופגים רקמת תאים תושב, שלהם שפע באיברים החיסון הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, בידוד של טיהור של תאים דנדריטים ראשיים ו מקרופאגים לניסויים הדורשים מספר גדול של תאים אלה הוא יקר ולא לעיתים קרובות בלתי אפשרי. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקולים פותחו כדי לקבל כמויות גדולות של מקרופאגים הומוגני או תאים דנדריטים בתוך חוץ גופית. גישות אלה מבוססים על הבידול בתאי מח עצם מאתר בנוכחות ציטוקינים: מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (M-CSF) עבור מקרופאגים, גורם מגרה המושבה גרנולוציט-מקרופאג (GM-CSF) או Flt3 ליגנד עבור תאים דנדריטים7,8,9,10,11,12. התאים שנוצר על ידי שיטה זו מתוארים בדרך כלל בספרות מקרופאגים (BMDMs) נגזר מח עצם, מח עצם נגזר תאים דנדריטים (BMDCs). יש להם עוד מאפיינים פיזיולוגיים במשותף עם מקרופאגים הראשי או תאים דנדריטים מאשר עם שורות תאים המתאימים. יתרון מרכזי נוסף הוא האפשרות לקבל טופס תאים אלה גנטית שונה עכברים13. לימודי השוואתי בין פראי-סוג תאים, התאים נגזר עכברים מהונדסים לעיתים קרובות הם קריטיים עבור פונקציות הרומן שיגורי של גנים או חלבונים עניין.

ניתוח של לוקליזציה subcellular של חלבונים בתאים חיים מחייב את צימוד של תווית פלורסנט החלבון של עניין אין ויוו. זו מושגת בדרך כלל על ידי הבעת לבנות פיוז'ן מקודדים גנטית מורכב של חלבונים שנותחה מצמידים (לעיתים קרובות באמצעות מקשר קצר) כדי חלבון פלואורסצנטי (למשל., ירוק (GFP) חלבון פלואורסצנטי)14,15 , 16. הביטוי של חלבונים מתויגות fluorescently תאים דנדריטים או מקרופאגים הוא מאתגר. תאים אלה הם בדרך כלל קשה transfect שגרות תקנים סטנדרטיים, היעילות נוטים להיות נמוכה מאוד. יתר על כן, תרביות תאים הוא חולף, זה יוצר מתח סלולארית, מושגת עוצמת קרינה פלואורסצנטית לא יהיה מספיק עבור מיקרוסקופ17. על מנת לקבל שבר סביר של תאים אלה לרמה מספקת של ביטוי transgene, הזיהום של מח העצם ובתאים עם retroviral וקטורים ובידול עוקבות שלהם לתוך BMDMs או BMDCs הפך להיות מאוד יעיל הגישה. זה איפשר לניתוח של החלבונים ממוצא מיאלואידית בסביבתם יליד הסלולר, הן במצב יציב, או במהלך התהליכים הם קריטיים עבור התגובה החיסונית כגון phagocytosis, היווצרות סינפסה אימונולוגי או העברה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ביטוי יציב של חלבונים מתויגות fluorescently עניין ב מאתר מח עצם נגזר מאקרופאגים תאים דנדריטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת מומחים הרווחה של חיות ניסוי המכון לגנטיקה מולקולרית על ידי האקדמיה למדעים של הרפובליקה הצ'כית.

1. מגיב הכנה

  1. הכנת המאגר אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK). להוסיף 4.145 g של NH4קלרנית ו- 0.5 גר' KHCO3 עד 500 מ"ל של ddH2O, ולאחר מכן להוסיף 100 µL של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), לעקר את המסנן.
  2. הכנת polyethylenimine (פיי) פתרון. להוסיף 0.1 גר' פיי 90 מיליליטר ddH2O. תוך כדי ערבוב, מוסיפים 1 M HCl dropwise עד ה-pH הוא נמוך יותר מאשר 2.0. מערבבים במשך עד 3 שעות עד פיי היא התפרקה ולאחר מכן התאם pH עד 7.2 עם 1 M NaOH. לכוון את עוצמת הקול כדי 100 מ ב- ddH2O, לעקר את המסנן. להפוך את aliquots 1 – 2 מ"ל ולאחסן ב-20 ° C.
    הערה: לאחר מפשיר, פיי ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 שבועות אך צריך לא להיות מחדש קפוא.
  3. להכין supernatants התרבות תאים המכילים M-CSF או GM-CSF. Supernatants אלה יכולים להיות מראש, המאוחסן ב- 80 מעלות צלזיוס. כדי להפוך את supernatants האלה, לגדול המייצרים ציטוקינים בתאים (תאים J558 GM-CSF 18 ) או CMG 14-12 תאים עבור M-CSF 1910 ס מ פטרי במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) הנהרות. ואז להעביר כל התאים 200 מ של התקשורת T150 את הבקבוק תרביות רקמה והתרבות נוספים ארבעה ימים ב- 5% CO237 מעלות צלזיוס. לאסוף את תגובת שיקוע וסינון מעל 0.2 µm עיקור מסנן. להפוך aliquots ולאחסן אותם ב- 80 ° c
  4. להכין 100 מ של התא תרבות בינוני: DMEM בתוספת 10% חום FBS מוחלש וסלולרי תרבות supernatants מתאי מפריש GM-CSF (עבור בידול BMDC) או M-CSF (עבור בידול BMDM).
    הערה: הסכום של ציטוקינים ב supernatants אלה עשויים להשתנות, הריכוז בעבודה צריך להיקבע מדעית. בדרך כלל, 2 – 3% תגובת שיקוע של שורות תאים לייצר GM-CSF (הריכוז ההתחלתי המומלץ הוא 2%) או תגובת שיקוע 5 – 10% מ CMG 14 – 12 תאים בהפקת M-CSF (הריכוז ההתחלתי המומלץ הוא 10%) משמש. לחלופין, טהור מסחרית זמינים M-CSF-10 ng/mL ו- GM-CSF-20 ng/mL ניתן להשתמש עם תוצאות כמעט זהה לציטוקין המכילים supernatants, כלומר., ללא כל השפעה על שיעור של בידול, זיהום יעילות subcellular לוקליזציה של בונה מתויג EGFP. אנטיביוטיקה, כולל פניצילין G (100 IU/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL) ו גנטמיצין (40 µg/mL), יכול לשמש תרבית תאים בשלב כלשהו של הפרוטוקול אלא אם צויין אחרת.

2. הפקה של רטרווירוס

התראה: למרות וקטורים retroviral בטוח יחסית לעומת סוגים אחרים של וקטורים ויראלי, הם מהווים עדיין סכנה פוטנציאלית בטיחות. לכן, זה הכרחי כדי לעבוד עם ש"צריך ציוד מגן מתאים, וכדי לדבוק בכל תקנות הבטיחות ודרישות משפטיות לעבודה עם נגיפים.

  1. צלחת השעיה תא בודד של תאים אריזה פלטינה-Eco (Plat-E) ב- 10 ס מ פטרי ולטפח ב-15 מיליליטר DMEM המכיל 10% FBS עד 50-60% confluent (24 שעות). התאים תגדל ב טפט, לא היו אמורים. ליצור גושים בתרבות.
  2. פיפטה 20 µg של retroviral לבנות (למשל., הבונה לבטא את החלבון fluorescently מתויג עניין בוקטור pMSCV) ו- µg 10 של אריזות pCL-Eco וקטור20 לתוך 1 מ"ל של DMEM (ללא סרום ואנטיביוטיקה) ומערבבים בעדינות.
  3. לרכבת התחתית השנייה, להוסיף µL 75 של פיי 1 מ"ל של DMEM (ללא סרום ואנטיביוטיקה). דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ואז מערבבים יחד את התוכן של שני צינורות, דגירה נוספים 10 דקות ב- RT.
    הערה: תוספת של pCL-Eco היא אופציונלית. זה הוא קידוד עבור הקולטן נגיפי ecotropic, עשויה להגדיל את כייל וירוס.
  4. בזהירות להחליף המדיום בתאי Plat-E 8 מ של DMEMsupplemented טריים עם 2% FBS. לחמם את המדיום עד 37 ° C לפני השימוש. אל תשתמש אנטיביוטיקה במהלך תרביות תאים, מאז אנטיביוטיקה עשויה להפחית את היעילות תרביות תאים.
  5. בזהירות להוסיף (בטיפות) התערובת המבושלות 2.3 שלב על תאים Plat-E, ולאחר תקופת דגירה של 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר הדגירה, להחליף את המדיום בתאי Plat-E עבור 10 מ"ל של DMEM מראש ומחוממת המכיל 10% FBS, ולטפח את התאים עבור 24 שעות ב 37 º C. במהלך הדגירה זו, תאים Plat-E יהיה לייצר וירוס לתוך כלי התקשורת.
  7. לאחר 24 שעות, לאסוף את המדיום המכיל חלקיקים retroviral מתאי פלטינה לסביבה באמצעות פיפטה 5 מ של, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה 15מל (= "1 supernatant" המכיל חלקיקים retroviral ecotropic).
  8. כדי למנוע זיהום על ידי תאים Plat-E supernatants ויראלי, לסובב את הוירוס שנאספו ב g × 1250 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אמור לשמש הווירוס באופן מיידי בזיהום.
    הערה: Aliquots של וירוס ניתן גם לאחסן ב- 80 ° C לשימוש מאוחר יותר. עם זאת, שהתוצאה תהיה הפחתה מסוימת התמרה חושית יעילות. הימנע חוזרות הקפאה \ הפשרה של הווירוס, שכן זה מוביל וירוסים והשפלות.
  9. להוסיף 10 מ של DMEM מראש ומחוממת עם 10% FBS כדי Plat-E תאים ולטפח עבור עוד 24 שעות ב 37 º C.
  10. חזור על שלבים 2.7. ו 2.8. כדי להשיג את "supernatant 2".

3. מאתר מח עצם תא בידוד

  1. להקריב את העכבר באמצעות נקע בצוואר הרחם או שיטה אחרת שאושרו. לרסס את העכבר עם 70% אתנול.
  2. באמצעות פינצטה ומספריים, להסיר את העור, כמו גם חלק שרירי הרגליים האחוריות. בזהירות לסלק את מרחשת של מפרק הירך מבלי לשבור עצם הירך. חותכים הכפה בכלא הקרסול. לרסס את העצמות (מחובר השוקה עצם הירך) עם 70% אתנול ולהסיר את שאר השרירים באמצעות מגבת נייר.
  3. מניחים את העצמות בצלוחית 5 ס מ המכיל פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS) עם 2% FBS (PBS-FBS).  אם מכינים יותר עצמות, לשמור על צלחת פטרי על הקרח עד תטופל.
  4. לאבטחת טיפוח עקרות, בצע את כל השלבים הבאים בשכונה תרביות רקמה.
  5. להפריד בין עצם הירך לבין עצם השוקה מבלי לשבור את קצות העצם (כיפוף בברך משותפת, לחתוך בזהירות עם מספריים).
  6. לעבד את העצמות אחד אחד. לחתוך חלק מאוד קטן epiphyses (כ 1-2 מ"מ) עם מספריים תוך החזקת את העצם ב פינצטה.
  7. השתמש מחט 30 G ו- 2 או 5 מ"ל מזרק מלא PBS-FBS לרוקן את התאים במח העצם משני קצוות העצם לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. להזיז את המחט בתוך העצם במהלך שטיפה כדי להסיר את כל התאים. אם המחט מקבל סתומות, לשנות אותו.
    הערה: עצמות יש לפנות מאדום לבן במהלך שטיפה. אפשרות זו מציינת כי הרוב המכריע של התאים הוצאו מן העצם. השתמש כ- 2-3 מ"ל של PBS-FBS לכל עצם.
  8. Centrifuge התאים ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
  9. למחוק את תגובת שיקוע ואת lyse כדוריות דם אדומות על-ידי resuspending בגדר ב 2.5 מ ל ומונה מאגר למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך פירוק, לסנן את התאים במח העצם דרך מסננת תא 100 μm לתוך צינור centrifug 15 mL טריים. לשחזר את וגמישותו על-ידי הוספת 12 מ של PBS-FBS.
    הערה: לא יעלה על 5 דקות של פירוק היפוטוניק עם ACK המאגר כדי למנוע מוות של תאים.
  10. צנטריפוגה מיד ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.

4. מח עצם תאית התמיינות לתוך מח עצם נגזר מקרופאגים

  1. Resuspend בגדר של תאים במח העצם DMEM בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה (לראות את הפתק לאחר שלב 1.4. ריכוז לאנטיביוטיקה) ולספור את התאים. עבור בידול לתוך מוניטור נגזר מקרופאגים, צלחת 5 – 10 x 106 תאי מח עצם ב- 10 ס מ ללא-רקמת תרבות שטופלו (חיידקים) צלחת פטרי עם 10 מ"ל של מדיה DMEM מוכן מראש עם סרום ו M-CSF מ 1.4 שלב.
    הערה: התשואה של תאי מח עצם הינה כ 4 x 107 בשבוע 6-8-C57BL/6J עכבר זקן.
  2. תקופת דגירה התאים תא תרבות חממה של 3 ימים ב- 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: במהלך הימים הראשונים 2, התאים לא נראים חיוניים מאוד, כמו גם מספר רב של מוות תאים להציג (תאים מסוגלים להבדיל לתוך התאים מיאלואידית ותאים סופני הבדיל).
  3. לאחר 3 ימים, התרבות תאי מח העצם מתחילה להיראות חיוני, אשכולות של חלוקת תאים נוצרים. כבר ניתן לראות תאים חסיד הראשון. בשלב זה, תוספת התאים עם מדיה ציטוקין טריים.
  4. להוסיף 10 מ של מדיה DMEM מראש ומחוממת עם סרום ו M-CSF (מתוך שלב 1.4) כל 10 ס מ פטרי והחזרתו בחממה התרבות תאים. יש צורך להסיר את המדיה הישנה במהלך שלב זה.
    הערה: מח עצם מקרופאגים מובחנים באופן מלא לאחר 5-7 ימים בתרבות. הזמן הטוב ביותר עבור קציר הוא ביום 6-8, איפה רוב התאים מחסידי ו הפטרי מכוסה לגמרי.
  5. יום 5, לקחת הפטרי וחטף התרבות תאים, שיפוע המנה עד התקשורת כמעט מגיע לקצה של המנה. להוציא בזהירות 15 מ"ל של התקשורת מפני השטח סמוך לקצה, התאים נוטים להישאר במרכז המנה. להוסיף באותו אמצעי אחסון של מדיה מראש ומחוממת עם M-CSF ולמקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה.
    הערה: אם התקשורת היא aspirated לאט ובזהירות, כמעט אין תאים יאבדו. עם זאת, זה גם אפשרי centrifuge התקשורת aspirated ולהוסיף את התאים חזרה אל התרבות, כדי להבטיח כי אין שאינו חסיד (כלומר., שהיישום הבדיל) תאים אובדות.
  6. לניסויים, משמשים רק תאים חסיד (מקרופאגים). הקציר תאים, ביום 6 או 7, להסיר כל מדיה ותאים צף. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם PBS ומחוממת מראש ללא סרום.
  7. הוסף 5 מ של 0.02% EDTA ב- PBS, ולאחר תקופת דגירה של 3-5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה תרביות רקמה.
  8. באמצעות פיפטה 5 מ של, להסיר התאים המנה על ידי זרם של PBS-EDTA, מקם אותם בתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ עם 25 מ של PBS. אם יש צורך, בריכת עוד כלים ביחד.
  9. צנטריפוגה מיד ב g x 500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
  10. Resuspend בגדר מקרופאג בתקשורת DMEM ולספור את התאים. לאמת את הביטוי של סמני בידול משטח מקרופאג (CD11b ו- F4/80) על ידי cytometry זרימה.
  11. לניסויים הדורשים את התאים להיות ההשעיה, למשל., flow cytometry ניסויים, qPCR או ניתוח תספיג, להשתמש את המקרופאגים ישירות. לניסויים עם חסיד מקרופאגים, צלחת התאים בצלחת תרביות רקמה בהתאם לכיוונון ניסיוני.
  12. התאים כבר במלואם מובחנים. שמור אותם בתקשורת מתאים הניסוי המיועד או בתקשורת בהתפתחותם המקורי עם M-CSF.
    הערה: עבור עבודה עם חסיד מקרופאגים, להעביר אותם לתוך חדש צלחת לפחות 6 שעות לפני השימוש (אידיאלי לילה) כדי לאפשר הדבקה מלאה על פני השטח החדש. ניתן להסיר את השבר קטן של תאים צפים לפני הניסוי.

5. מח עצם תאית התמיינות לתוך מח עצם נגזר תאים דנדריטים

  1. בצע את הפרוטוקול עבור BMDMs עם התאמות ספציפיות עבור BMDCs המתוארים להלן צעדים 5.2 – 5.4.
  2. Resuspend בגדר שהושג של תאים במח העצם ב- DMEMsupplemented עם 10% FBS ואנטיביוטיקה ולספור את התאים (על-ידי 4.1 שלב הבא של פרוטוקול מקרופאג). עבור התמיינות של תאים דנדריטי, צלחת 1 – 1.5 x 10 תאים במח העצם7 ב 10 ס מ ללא-רקמת תרבות מטופלים פטרי (חיידקים) ב- 10 מ"ל של מדיה DMEM מוכן מראש עם סרום ו- GM-CSF (מתוך שלב 1.4.).
  3. בצע את השלבים לטפח אותו כמו פרוטוקול BMDM (צעדים 4.3-4.5. של פרוטוקול מקרופאג). השתמש DMEM מדיה עם סרום ו- GM-CSF במקום מ'-CSF. מאז עבור BMDCs הזמן הטיפוח-תרגול הוא ארוך יותר (בדרך כלל 10 – 12 ימים), להוסיף 1 – 2 בפטריה נוספים במרווחים 3 יום (על ידי הסרת את תגובת שיקוע, הוספת מדיה חדשה של טיפוח כפי שמתואר בשלב 4.5.).
  4. חלק זה של הפרוטוקול הוא כמעט זהה החלק המתאים של פרוטוקול מקרופאג (צעדים 4.6-4.12. של פרוטוקול מקרופאג). לניסויים להשתמש רק תאים חסיד. יום 10-12, לאסוף את התאים באמצעות EDTA, לספור, צלחת אותם על משטח חדש. ודא את הביטוי של סמנים משטח התמיינות של תאים דנדריטים (F4/80 CD11c +, CD11b +,-) מאת cytometry זרימה.

6. הייצור של BMDMs ו BMDCs ביטוי מתויג EGFP חלבון עניין

  1. Resuspend בגדר של תאים במח העצם ב 3.10 שלב. ב- DMEM בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה ולספור את התאים. בשביל הזיהום, להשתמש 2-5 x 106 מוניטור תאים לכל טוב של תרביות רקמה 6-ובכן שטופלו לצלחת.
  2. צלחת תאי 1 מ"ל של התקשורת DMEM מוכן לכל, שיושלם עם M-CSF עבור בידול לתוך BMDMs, או עם GM-CSF עבור בידול BMDCs. להשאיר את התאים עבור 4-6 h חממה תרביות רקמה עם 5% CO2 ב 37 º C.
  3. להוסיף 2 מ"ל של וירוס שנאספו טרי ("supernatant 1") בתוספת polybrene (12 µg/mL, הריכוז הסופי 8 µg/mL לאחר תוספת לתאים).
    הערה: aliquot הקפוא של תגובת שיקוע המכיל וירוס יכול לשמש גם, אבל היעילות יהיו נמוכים.
  4. Centrifuge את הצלחת ב g x 1,250 במשך 90 דקות ב 30 ° C (עם איטי האצה והאטה). לאחר מכן, תקופת דגירה של 4 שעות עם 5% CO2 ב 37 º C.
  5. אופציונלי: להחליף 2 מ"ל של תרבות התקשורת עם טרי בינוני המכיל בהתאמה ציטוקין (M-CSF או GM-CSF) והתרבות עם 5% CO2 ב 37 º C. ביום השני, להסיר 2 מ"ל של תרבות התקשורת וחזור על התהליך כל זיהום (שלב 6.3 – 6.4) עם 2 מ"ל של וירוס שנאספו טרי ("supernatant 2").
    הערה: שלב זה עשוי להגביר את היעילות זיהום. שיפור אחרי שהזיהום השנייה תלויה על החלבון בתא היעד וסוג, מניסיוננו יכול להשתנות מעלייה 30% יעילות לשיפור אין בכלל.
  6. לאסוף התאים הלא-חסיד, להעביר את שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, ספין-500 g x עבור 5 דקות (4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
  7. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של תרבות התקשורת עם M-CSF או GM-CSF, למקם את התאים 10 ס מ ללא-מיקרוביולוגיות שטופלו פטרי, תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. מספר אופטימלי של תאים עבור תבשיל 10 ס מ הוא 5 – 10 x 106 עבור מקרופאגים BM-derived ו 10 – 15 x 106 עבור BM-derived תא דנדריטי.
    הערה: מנות קטנות או צלחות יכול לשמש, אך מספרי הטלפון הנייד חייב להיות מותאם בהתאם.
  8. בצע את macrophage, פרוטוקול טיפוח ובידול תא דנדריטי שמתואר בשלב 4 ו- 5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתות מתאם חלבונים הם חלבונים קטנים בדרך כלל ללא כל פעילות אנזימטיות. ברשותם בתחומים שונים של אינטראקציה או מוטיבים, אשר לתווך קשירה לחלבונים אחרים המעורבים אותות, כולל טירוזין kinases, phosphatases, ligases אוביקוויטין ואחרים21. עבור ההדגמה של הפונקציונליות של פרוטוקול זה נבחרו התאים מיאלואידית מתאמים PSTPIP2 ו- OPAL1. PSTPIP2 הוא חלבון טוב מאופיין מעורב ברגולציה של תגובה דלקתית22. זה חלבון cytoplasmic אשר יכול גם להיות גויסו ממברנות הסלולר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביטוי של חלבונים עניין בתאי המטרה היא צעד מפתח בסוגים רבים של מחקרים ביולוגיים. תאים דנדריטים מאקרופאגים הבדיל קשים transfect על ידי תרביות תאים סטנדרטית וטכניקות retroviral התמרה חושית. דילוג על תרביות תאים תאים אלה עם retroviral התמרה חושית של אבות מח עצם, ואחריו בידול כאשר הם נושאים כבר הבונה הרצוי, הוא שלב קריטי המאפשר הביטוי של cDNAs חוץ רחמי אלה סוגי תאים. דוגמה של שימוש מוצלח של שיטה זו ניתן למצוא בפרסום האחרונה שלנו25. כאן, אנו מספקים פרוטוקול חסכוני להשגת יציבה ביטוי של הבונה של בחירה הנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הצ'כית המדע קרן (GACR) (פרויקט מספר 16-07425S), על ידי צ'ארלס אוניברסיטת גרנט סוכנות (גאוק) (מספר הפרוייקט 923116) ועל -ידי מוסדיים מימון מן המכון של הגנטיקה המולקולרית, האקדמיה למדעים הצ'כי הרפובליקה (RVO 68378050).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMThermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב15028
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific, וולת'ם, MA, ארה"ב10270לתמיכה במדיה
KHCO3Lachema, ברנו, צ'כיהN/A
NH4ClSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)A9434
פניציליןBB Pharma AS, פראג, צ'כיהN/APENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL 'BIOTIKA
StreptomycinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, ארה"ב)S9137אבקת מלח סטרפטומיצין סולפט
GentamicinDr. Kulich Pharma, Hradec Krá lové, צ'כיהN/A
פוליאתילנימין, ליניארי, MW 25,000Polyscience, וורינגטון, פנסילבניה, ארה"ב23966
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, קנילוורת', ניו ג'רזי, ארה"ב)H9268
EDTASigma-Aldrich (Merck, קנילוורת', ניו ג'רזי, ארה"ב)E5134
PBSהוכן בבית על ידי מתקן המדיה של IMG ASCR, פראג, צ'כיהN/A
APC נגד עכברים/נוגדן CD11b אנושי, שיבוט M1/70BioLegend (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)101212ניתוח ציטומטריית זרימה
PE נגד עכבר F4/80 נוגדן, שיבוט BM8BioLegend (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)123110ניתוח ציטומטריית זרימה
APC נגד עכבר CD11c נוגדן, שיבוט N418BioLegend (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב)117310ניתוח ציטומטריית זרימה
M-CSFPeproTech (רוקי היל, ניו ג'רזי, ארה"ב)315-02
GM-CSFPeproTech (רוקי היל, ניו ג'רזי, ארה"ב)315-03
Hoechst 33258Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"H1398שימוש בניתוח ציטומטריית זרימה ב-1-2 ומיקרו; גרם/מ"ל
ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960(2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766(2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Platinum Eco packagingM CSFGM CSF

מאמרים קשורים