Method Article

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

DOI:

10.3791/58089

⸱

November 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הנדסה גנטית ארעית של תאי גזע שיניים שחולצו מן הזקיק שיניים אנושיות. האסטרטגיה יישומית השינוי נגיפי יכול להיות בסיס לקידום מוצרים טיפוליים תאי גזע.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון להיום, מספר סוגי תאי גזע בשלבים התפתחותיים שונים הם המוקד לטיפול של מחלות ניווניות. ובכל זאת, היבטים מסוימים, כגון מוות של תאים מסיבית הראשונית ואפקטים טיפולית נמוכה, נפגעת שלהם תרגום קלינית רחבה. הנדסה גנטית של תאי גזע לפני השתלת צמחו כשיטה מבטיח כדי למטב את השפעות טיפוליות תאי גזע. עם זאת, מערכות אספקה יעילה ובטוחה ג'ין עדיין חסרים. לכן, בפיתוח שיטות מתאים עשוי לספק גישה כדי לפתור אתגרים הנוכחי טיפולים מבוססי תאי גזע.

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את החילוץ של אפיון של תאי גזע אנושי זקיק שיניים (hDFSCs) כמו גם ההנדסה הגנטית נגיפי שלהם. זקיק שיניים כמחנכת חשפה כמקור מבטיח ונגיש בקלות לשימוש בתאי גזע multipotent למבוגרים בעלי פוטנציאל התפשטות גבוה. ההליך המתואר בידוד מציג שיטה פשוטה ואמינה למסוק hDFSCs של שיני בינה מיותרות. פרוטוקול זה כוללת גם שיטות כדי להגדיר מאפייני תא גזע תאים מבודדים. עבור הנדסה גנטית של hDFSCs, אסטרטגיית ממוטבת cationic ליפיד המבוסס על תרביות תאים מוצג מבוא יעילה במיוחד microRNA המאפשר מבלי לגרום תופעות ציטוטוקסיות. מיקרו Rna הם מועמדים מתאימים תמרון תא ארעי, כמו אלה הרגולטורים translational קטנים לשלוט את גורל וההתנהגות של תאי גזע ללא הסכנה של הגנום יציב אינטגרציה. לפיכך, פרוטוקול זה מייצג שגרה יעילה ובטוחה עבור הנדסה של hDFSCs שעלולים להיות חשוב עבור מיטוב היעילות הטיפולית שלהם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זקיק שיניים האנושי הוא רופף, נגזר ectomesenchymally רקמת חיבור המקיפים את1,המתפתח השן2. לצד תפקידה לתאם osteoclastogenesis ואת פרכת בתהליך התפרצות השן, רקמה זו בנמלים תאי גזע וקדמון במיוחד עבור הפיתוח של periodontium3,4,5. לכן, זקיק שיניים נחשב כמקור חלופי כדי לקצור תאי גזע בוגרים אנושי6,7.

מספר מחקרים הדגימו כי תאי גזע אנושי זקיק שיניים (hDFSCs) מסוגלים להבדיל לתוך שושלת היוחסין חניכיים כולל תאי העצם, רצועה fibroblasts ו cementoblasts8,9,10 . יתר על כן, תאים אלה הוצגו כדי להתאים כל המאפיינים של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) כולל קיבולת עצמי המתחדש, הדבקות מפלסטיק, ביטוי של סמני פני שטח מסוים (למשל, CD73, CD90, CD105), כמו גם כמו osteogenic adipogenic, chondrogenic בידול פוטנציאליים11,12,13. מחקרים אחרים התגלה גם פוטנציאל התמיינות עצבית של hDFSCs2,14,15,16,17,18.

בשל תכונותיהם מבטיח ואת גישה נוחה, hDFSCs הפך לאחרונה הרלוונטיים רקמות-20,19,-הנדסה-21. המחקרים הראשונים התרכזו הפוטנציאל של DFSCs להתחדש העצם, חניכיים ושורשים השן19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. ידיעת היכולת neurogenic של hDFSCs, היישום שלהם כמו טיפול פוטנציאלי עבור מחלות ניווניות מאז ובדוקים31,32,33. HDFSCs זכו גם חשיבות ביחס לרגנרציה של שאר רקמות (למשל, אפיתל הקרנית)34,35. הפוטנציאל הטיפולי של hDFSC אינה מבוססת רק על הפוטנציאל בידול ישירה שלהם אלא גם על פעילותם paracrine. לאחרונה, hDFSCs הוכחו להפריש שפע של גורמים ביו, כגון מטריקס metalloproteinases (MMPs), פקטורי גדילה דמויי אינסולין (IGF), כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF), בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF), hepatocyte צמיחה פקטור (דבורה שחר), אשר לשחק תפקיד מכריע אנגיוגנזה, immunomodulation, מטריקס סלולרית נוספת שיפוץ של תהליכים תיקוני36.

עם זאת, תרגום קליני רחב של טיפול בתאי גזע הוא עדיין לקוי על ידי מספר אתגרים, כגון מוות של תאים הראשונית מסיבי נמוכה תאי גזע מיטיב אפקטים37,38. הנדסה גנטית מספקת אסטרטגיה מבטיח לטפל באתגרים אלה, ולכן יכול מאוד לשפר את היעילות הטיפולית של תאי גזע-38,-39,-40. תמרון תא ארעי, Rna (מירס) הם מועמדים מתאימים, כמו אלה הרגולטורים translational קטנים לשלוט את גורל וההתנהגות של תאי גזע ללא הסכנה של הגנום יציב אינטגרציה41,42, 43. נכון להיום, מספר מירס מועיל זוהו מקדם התפשטות תאי גזע, הישרדות, יונת, פעילות paracrine, כמו גם בידול שלהם לתוך שושלות מספר44. למשל, מיר-133a מתוכנן MSCs הראה, הישרדות מוגברת ו engraftment בלבבות עכברוש infarcted וכתוצאה מכך שיפור בתפקוד הלב בהשוואה ל- MSCs יאומתו45. באופן דומה, MSCs overexpressing מיר-146a הוצגו להפריש כמויות גבוה יותר של VEGF אשר הוביל בתורו משופרת יעילות טיפולית של רקמות איסכמי46.

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט עבור חילוץ סלקטיבי ו הנדסה גנטית של hDFSCs. למטרה זו, אנו המתואר העיכול האיסוף, אנזימטי של זקיקי שיניים האנושית, כמו גם הבידוד עוקבות של hDFSCs. על מנת לאפיין תאים בודדים, נכללו הוראות חשובות עבור האימות של מאפייני MSC בהתאם לקווים המנחים של האגודה הבינלאומית עבור טיפול הסלולרית13. בנוסף, אנו מספקים תיאור מפורט לדור של hDFSCs מיר-לאחרונה על-ידי החלת אסטרטגיה תקנים מבוססי השומנים cationic והערכת יעילות תרביות תאים, cytotoxicity.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDFSCs מבודדים מן הזקיקים שיניים של שיני בינה שחולצו הניתנים על ידי המחלקה של אורלי פה ולסת כירורגיה פלסטית במרכז הרפואי באוניברסיטת רוסטוק. ממנו כל המטופלים הושג מדעת ואישור בכתב. מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת רוסטוק (הרשאה ל'לא 2017-0158).

1. בידוד של hDFSCs

הערה: כדי למנוע זיהום חיידקי, שיני בינה צריכה לא להיות פרצה לפני חילוץ

  1. אופן ההכנה של פתרונות נדרש
    1. להכין תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) / פתרון פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (P-S-G): מערבבים 495 מ של PBS עם 5 מ של פתרון P-S-G. חנות aliquots של 50 מ ל- 4 מעלות צלזיוס.
    2. להכין hDFSC תרבות בינוני: לערבב 445 מ של הבסיס בינוני 5 מ של סוכן אנטיביוטי ו- 50 מ של סרום שור עוברית (FBS). חנות ב 4 º C.
    3. להכין Collagenase סוג אני מדמין פתרון (30 מ"ג/מ"ל): לדלל 300 מ ג מסוג Collagenase אני ב- 10 מ"ל של מדיום הבזליים בתוספת 1% הסוכן לאנטיביוטיקה. לערבב נמרצות את הפתרון. לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 µm. חנות aliquots של 500 µL של Collagenase מסוג I פתרון מניות ב-20 ° C.
    4. להכין פתרון מניות Dispase II (40 מ"ג/מ"ל): למהול 40 מ"ג של Dispase השני ב- 10 מ"ל של מדיום הבזליים בתוספת 1% הסוכן לאנטיביוטיקה. לערבב נמרצות את הפתרון. לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 µm. חנות aliquots של 500 µL של פתרון מניות Dispase II ב-20 ° C.
  2. הליך כירורגי
    1. להזריק כמות מספקת (מרבי: 2 מ ל) של הרדמה מקומית.
    2. ליצור ולהקים דש mucoperiosteal שלושה קירות. העלאת דש לשוני אינה נדרשת.
    3. להגן על ההיבט לשוני עם מעלית חידוש.
    4. בעדינות מיל buccal ו דיסטלי עצם עם צמח קוצני מתכת עגול קשה.
    5. שחרר את הרקמה של הזקיק עם מנוף פריוסט. הסר בזהירות מוחלטת השן (נבט) ואת זקיק על-ידי הוצאת הכתר (ואת זקיק) עם מלקחיים (שלישי-טוחנת) האחורי.
    6. הרקמה המתה, להשקיית השקע ביסודיות עם פתרון NaCl.
    7. החלף את הכנף mucoperiosteal עם התפרים תפר נספג (ראה טבלה של חומרים).
    8. הסר זקיק השן של חלל הפה, למקם אותם לתוך aliquot של 50 מ של פתרון PBS/P-S-G.
      הערה: ניתן לאחסן את הדגימה ב 4 ° C עד עיבוד נוסף.
  3. עיכול אנזימטי של זקיק השן
    1. לחמם hDFSC תרבות בינוני והפתרון PBS/P-S-G לטמפרטורת החדר (RT).
    2. הפשרת aliquot אחד של כל סוג Collagenase אני ופתרונות Dispase II מניות. להכין פתרון עיכול של 3 מ"ג/מ"ל Collagenase סוג אני 4 מ"ג/מ"ל Dispase השני על-ידי הוספת µL 500 של כל Collagenase מסוג I ו- Dispase II פתרון מניות עד 4 מ"ל של הבסיס בינוני המכיל 1% לאנטיביוטיקה סוכן.
    3. מקום זקיק שחולצו בצלחת פטרי סטריליות ולהוסיף 10 מ"ל של PBS/P-S-G פתרון לרחוץ את הרקמה שחולצו. חזור על שלב זה כביסה פעמיים.
    4. מינצ זקיק שחולצו לחתיכות של 1 מ מ x 1 מ"מ עם איזמל סטרילי בתוך הפטרי המכיל 10 מ"ל של פתרון PBS/P-S-G.
    5. להעביר הרקמה טחון והפתרון PBS/P-S-G מ הפטרי לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. לשטוף את צלחת פטרי עם 10 מ"ל של PBS/P-S-G פתרון ולהעביר את הפתרון לתוך הצינור אותו.
    6. Centrifuge הצינור צנטריפוגה חרוט 10 דקות ב x 353 g ב- RT וזורקים את תגובת שיקוע.
    7. הוסף 5 מ של פתרון מערכת העיכול הרקמה pelleted. מערבבים בעדינות את הפתרון ואת הרקמה. את התערובת-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 2 h בחממה חזק דגירה.
    8. צנטריפוגה מחדש להשעות בגדר שהושג ב 6 מ של hDFSC תרבות בינוני מתעכל תא/רקמות ההשעיה ב x 353 g 10 דקות ב RT. להשליך תגובת שיקוע.
    9. ההשעיה תא זרע ב- 25 ס מ2 תא תרבות את הבקבוק, דגירה תאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 20% O2.
      הערה: אם הרקמה אינו מתעכל לחלוטין, להעביר הבקבוקון התרבות התא גם הרקמה הנותרת.
    10. לשנות בינוני בקפידה 24 שעות לאחר תא זריעה. אחר כך לשנות בינוני כל שלושה ימים עד confluency.
      הערה: HDFSCs צריך להיות חסיד פלסטיק 24 שעות לאחר זריעה תא ולא ניתן להפריד בין תאים שאינם מחסידי ורכיבי דם פשוט על ידי שינוי של המדיום.
  4. קציר תאים
    1. לחמם hDFSC תרבות בינוני, PBS/P-S-G פתרון, פתרון חומצה (EDTA) טריפסין/Ethylenediaminetetraacetic RT.
    2. למחוק את תגובת שיקוע של תרבות הבקבוק ולשטוף תאים confluent עם 5 מ של פתרון PBS/P-S-G.
    3. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין/EDTA פתרון הבקבוק תרבות, תקופת דגירה של 3 דקות ב 37 º C. לעצור את תהליך העיכול על ידי הוספת 3 מ"ל של hDFSC תרבות בינוני הבקבוק תרבות.
    4. להעביר תא ההשעיה לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל ו centrifuge המתלה למשך 10 דקות ב x 353 g -RT. להשליך תגובת שיקוע מחדש להשעות את צניפה בסכום המתאים של hDFSC תרבות בינוני.
    5. לספור תאים: מערבבים בעדינות µL 10 של השעיה תא עם 10 µL של פתרון Trypan blue. החל 10 µL לתא ספירה, חישוב הסכום תא hDFSC.

2. אפיון hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. הכנה של תאים ניתוח cytometric תזרים
      1. אופן ההכנה של פתרונות נדרש
        1. להכין PBS/EDTA (2 מ מ): מערבבים 996 מיליליטר PBS עם 4 מ של EDTA (0.5 מ').
        2. הכנת מאגר מכתימים: מערבבים 995 מ של PBS/EDTA (2 מ מ) עם 5 g של BSA. לסנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן מיקרומטר 0.22 ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
        3. הכנת paraformaldehyde (PFA) מניות פתרון (4%): לדלל 4 g מחברים ב- 100 מ של PBS וחום הפתרון 80 מעלות צלזיוס. לערבב את הפתרון, התאם את ערך ה-pH 7.3. Aliquot מתקבל פתרון PFA כמויות בהתאמה (1.5 מ"ל) וחנות ב-20 ° C עד השימוש.
          התראה: כי כדורגלן אדים רעילים, להכין את הפתרון PFA בשכונה fume מאוורר.
      2. לאחר התא קציר (1.4), העברת דגימות 14 של 5 x 104 תאים לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL. Centrifuge את המתלים ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
        הערה: ביצוע העבודה הבאה לחדר מוצל למדי. לשמור תאים ריאגנטים על קרח אלא אם צוין אחרת.
      3. להשעות מחדש תאים בסכומים מסוימים של מאגר מכתימים (4 ° C) ולהוסיף ה-FcR חסימת ריאגנט (4 ° C) כמצוין בטבלה1.
      4. הוסף את הנוגדנים הבאים על הצד הפנימי של המדגם בהתאמה כמצוין בטבלה1: Allophycocyanin (APC) העכבר נגד אדם CD29; APC העכבר IgG1 κ isotype שליטה; חלבון Peridinin-כלורופיל (PerCP)-Cyanine5.5 העכבר נגד אדם CD44; עכבר PerCP-Cyanine5.5 IgG2b κ isotype שליטה; V500 העכבר נגד אדם CD45; העכבר V500 IgG1 κ isotype שליטה; Phycoerythrin (PE) העכבר נגד אדם CD73; PE העכבר IgG1 κ isotype שליטה; PerCP-Cyanine5.5 העכבר נגד אדם CD90; PerCP-Cyanine5.5 העכבר IgG1 κ isotype שליטה; עכבר CD105 נגד: אלקסה עבור חיל הים (AF) 488; שליטה שלילי IgG1 בעכבר: AF488; PE-Cyanine7 העכבר נגד אדם CD117; PE-Cyanine7 IgG1, κ isotype שליטה בעכבר. לאחר נוגדנים נוספו כל דגימה, ספין למטה נוגדנים ומערבבים בעדינות. דגירה פתרונות 10 דקות ב 4 º C.
      5. להוסיף 1 מ"ל ל- PBS (4 ° C), centrifuge את הדגימות-300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
      6. להשעות מחדש תאים µL 100 ל- PBS (4 ° C) ולהוסיף µL 33 של כדורגלן (4%). לערבב את הפתרונות, לאחסן בקירור או ב 4 ° C עד ניתוח תזרים cytometric.
    2. מדידת cytometric של תאים
      הערה: ביצוע העבודה הבאה לחדר מוצל למדי. לשמור תאים על הקרח עד המדידה.
      1. כדי לבחון את הביטוי של אנטיגנים משטח, העברת דגימות לתוך צינורות מתאימים למדידות זרימה cytometric.
      2. למדוד לפחות 2 x 104 אירועים באמצעות cytometer של זרימה. לנתח כפי שהיא מתוארת באיור 2.
  2. בידול multipotent פוטנציאל של hDFSCs
    1. השתמש זמינים מסחרית האנושי Mesenchymal תאי גזע פונקציונליים זיהוי ערכת כדי לאשר adipogenic, osteogenic, chondrogenic הפוטנציאל בידול של hDFSCs. החל החמור נגד עז AF488 נוגדנים משניים עבור צביעה של חומצת שומן מחייב חלבון 4 (FABP4), אירה קוזלוב כמו גם חמור העכבר אנטי AF488 נוגדנים משניים עבור צביעה של אוסטאוקלצין. צביעה של גרעינים, לשימוש הרכבה בינונית עם 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (דאפי).
      הערה: להכין דוגמאות ללא נוגדן ראשוני כפקדי שלילי ניתוח מיקרוסקופי.
    2. לנתח את ביטוי של חלבונים על ידי סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר. הגדרות מיקרוסקופיה: המטרה 40 x עם שמן טבילה; עירור לייזר 488 ננומטר (עבור AF488) ו 405 ננומטר (עבור דאפי).

3. תרביות תאים של hDFSCs

  1. לאחר התא קציר (1.4), זרע hDFSCs על צלחת התרבות התא. ובכן 24 24 שעןת לפני תרביות תאים.
    הערה: החל תא צפיפות הוא כ 4 x 104 תאים לכל טוב. תאים כדאי להגיע למפגש ~ 80% ביום של תרביות תאים.
    הערה: זרע מדגם תא נוסף אחד כפקד לניתוח cytometric זרימה.
  2. הכנת קומפלקסים תרביות תאים
    הערה: כדי למנוע זיהום של RNases, לנקות את סביבת העבודה ישירות לפני ההכנה של מתחמי תרביות תאים באמצעות פתרון טיהור RNase. השתמש רק חומר נטול RNase ופתרונות.
    הערה: ביצוע העבודה הבאה לחדר מוצל למדי.
    1. להכין פתרון מניות מיר (50 מיקרומטר): מחדש להשעות קודמן מתויג Cy3 מיר (5 nmol) 100 µL נוקלאז ללא מים. Aliquot מתקבל פתרון מיר מניות בכמויות המתאימות (5 µL) וחנות בחושך ב-20 ° C עד השימוש.
    2. למהול 40 pmol של מיר (0.8 µL של הפתרון מניות של מיר 50 מיקרומטר) ב- µL 66.7 של מדיום מופחת סרום. מערבבים בעדינות את הפתרון
    3. לדלל µL 0.67 של תרביות תאים מבוססת השומנים cationic ריאגנט ב µL 66.7 של מדיום מופחת סרום. לערבב בעדינות את הפתרון, תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
    4. לאחר דגירה, להוסיף הכימית תקנים מדולל מראש מיר מראש מדולל. לערבב בעדינות את הפתרון, תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.
  3. הוסף את מתחמי תקנים מוכן dropwise ישירות אל המדיום תרבות על תאים. מערבבים בעדינות במוזיקת לצלחת תרבות 24-ובכן תא אחורה וקדימה.
  4. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 20% O2 עבור 24 שעות.

4. ניתוח של תרביות תאים

הערה: ביצוע העבודה הבאה לחדר מוצל למדי.

  1. תא קציר לאחר תרביות תאים
    הערה: לאסוף את כל הפתרונות תא מדגם אחד בצינור צנטריפוגה חרוט באותה 15 מ"ל.
    1. 24 שעות לאחר תרביות תאים, לאסוף את תגובת שיקוע של דגימות צינורות צנטריפוגה בהתאמה.
    2. לשטוף תאים עם 1 מ"ל ל- PBS, להעביר PBS לתוך הצינור צנטריפוגה בהתאמה ולהוסיף 500 µL טריפסין/EDTA (RT) לתאים. דגירה פתרונות 3 דקות ב 37 º C.
    3. להפסיק trypsinization על-ידי הוספת 1 מ"ל של תרבות בינוני (RT) תאים, העברת הפתרון לתוך הצינור צנטריפוגה בהתאמה. צנטריפוגה תאים ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
      הערה: מעתה, לשמור תאים, ריאגנטים על קרח אלא אם צוין אחרת.
  2. הכנה של תאים ניתוח cytometric תזרים
    1. למחוק את תגובת שיקוע. להשעות מחדש תאים µL 100 של מאגר מכתימים (4 ° C) העברת פתרון תא לרכבת התחתית microcentrifuge 1.5 mL.
    2. להוסיף 0.5 µL של צבע תגובתית amine הדגימות כדי להבחין בין תאים חיים וגם מתים. בעדינות לערבב את הפתרון, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס.
    3. להוסיף 1 מ"ל ל- PBS (4 ° C) תאים של צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
    4. להשעות מחדש תאים µL 100 ל- PBS (4 ° C) ולהוסיף µL 33 של כדורגלן (4%). לערבב את הפתרונות, לאחסן בקירור או ב 4 ° C עד ניתוח תזרים cytometric.
  3. מדידת cytometric של תאים
    הערה: ביצוע העבודה הבאה לחדר מוצל למדי. לשמור תאים על הקרח עד המדידה.
    1. העברת דגימות לתוך צינורות מתאימים למדידות זרימה cytometric.
    2. בחן תא הכדאיות יעילות ספיגת מיר באמצעות cytometer של זרימה. למדוד לפחות 2 x 104 אירועים. השתמש את האסטרטגיה המגביל מתואר באיור4.
      הערה: להשתמש בתאים untransfected כפקד שלילי כדי לארגן את gating עבור תאים חיוביים Cy3 וכדי לחשב את מות תאים הנגרמת על ידי תרביות תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים הוראה מפורטת בידוד למסוק hDFSCs מרקמות אנושיות זקיק שיניים. בשל הגישה הקלה של זקיק שיניים במהלך ניתוח שגרתי, זה מקור מבטיח עבור החילוץ בתאי גזע בוגרים.

HDFSCs מבודד הראה כל המאפיינים שתוארו עבור ההגדרה של MSCs13. למעשה, היו תאים פלסטיק-חסיד תחת תרבות, תארה ויוצגו מורפולוגיה, כמו פיברובלסט (איור 1). זרימה cytometric ניתוחים חשף כי hDFSCs בא לידי ביטוי פאנל של א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע בוגרים הם כרגע בפוקוס לטיפול של מספר מחלות ניווניות. בפרט, עצם מח (מוניטור)-תאי גזע, לרבות תאי גזע hematopoietic (HSCs) נגזר MSCs, נמצאים תחת חקירה קלינית אינטנסיבית47. עם זאת, מוניטור קציר הוא הליך פולשני גורמות לכאב באתר של תרומה, עלול להוביל תיעודו48. לאחרונה, הרקמה שיניים כמחנכת התפתחה כמו רומן מקור נגיש עבור תאי גזע. אלה בתאי גזע שיניים היו שמוצג לפגוש כל המאפיינים MSC והראה קיבולת גבוהה תפוצת כמו תאי גזע BM-derived49. כאן, אנחנו הציגה פ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית FORUN של המרכז הרפואי האוניברסיטאי (889018) של רוסטוק וקרן לח (2016-11). בנוסף, אחה צ ר נתמכים על ידי BMBF (VIP + 00240).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוגדן CD105 אנטי אנושי לעכבר: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488Clone SN6,
נוגדן בקרה שלילית לעכבר IgG1 חד שבטי: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA928A488עכבר APC חד
שבטי אנטי אנושי CD29 נוגדן BDBiosciences559883שיבוט MAR4,
עכבר APC חד שבטי IgG1 ו-kappa; נוגדן בקרת איזוטיפBD Biosciences555751שיבוט MOPC-21,
עכבר PE חד שבטי אנטי אנושי CD73 נוגדןBD Biosciences550257שיבוט AD2,
עכבר PE חד שבטי IgG1 וקאפה; נוגדן בקרת איזוטיפBD Biosciences555749שיבוט MOPC-21,
עכבר חד-שבטי PE-Cy7 אנטי-אנושי CD117 נוגדן BDBiosciences339217שיבוט 104D2,
עכבר PE-Cy7 חד-שבטי IgG1 וקאפה; נוגדן בקרת איזוטיפBD Biosciencesשיבוט 557872MOPC-21, חד שבטי
PerCP-CY5.5 עכבר אנטי-אנושי CD44 נוגדןBD Biosciences560531שיבוט G44-26, עכבר
PerCP-Cy5.5 חד-שבטי IgG2b, κ נוגדן בקרת איזוטיפBD Biosciences558304שיבוט 27-35, חד שבטי
PerCP-CY5.5 עכבר אנטי אנושי CD90  נוגדןBD Biosciences561557שיבוט 5E10, עכבר חד-שבטי
PerCP-Cy5.5 IgG1 ו-kappa; נוגדן לבקרת איזוטיפBD Biosciences55095שיבוט MOPC-21, חד שבטי
V500 עכבר אנטי-אנושי CD45 נוגדןBD Biosciences560777שיבוט HI30, מונוקלונלי
V500 עכבר IgG1 וקאפה; נוגדן לבקרת איזוטיפBD Biosciences560787Clone X40,
מגיב חוסם FcR חד שבטי, אנושיMiltenyi Biotec130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200.5M, pH 8.0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE0.22 ומיקרו; m, רדיו מעוקר, פוליאתרסולפון
BSASigma-AldrichA7906
PFAMerck Millipore1040051000
ערכת זיהוי פונקציונלי של תאי גזע מזנכימליים אנושייםR& פתרון טיהור RNase של D SystemsSC006
RNaseZap RNase Depollution SolutionThermo Fisher ScientificAM9780
Cy3-labels precursor miR; Cy3 Colour-Labeled Pre-miR Negative Control #1Thermo Fisher ScientificAM171205 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1Thermo Fisher ScientificAM171105 nmol
מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוני; Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
מדיום סרום מופחת; Opti-MEM I סרום מופחת מדיוםתרמו פישר מדעי31985070
חמור נגד עיזים IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055חמור פוליקלונלי
נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202פוליקלונלי
; Fluoroshield עם DAPISigma-AldrichF6057-20MLהיסטולוגיה הרכבה בינונית
ELYRA PS.1 LSM 780 מיקרוסקופ קונפוקליZeiss
BD FACS LSRII ציטומטר זרימהBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
ZEN2011 תוכנהZeiss
Trypsin/EDTA (0.05%/ 0.02%)BiochromL2143ב-PBS, עם: Ca2+, Mg2+
Amine צבע מגיב ; חי/מת וסחר; ערכת כתמי תאים מתים כמעט IR ניתנת לתיקוןThermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo Fisher Scientific10010023pH: 7.4; w/o: Ca ו-Mg
P-S-G (100x)Thermo Fisher Scientific10378016
מדיום בסיסי; תערובת בינונית/תזונתית של Dulbecco F-12Thermo Fisher Scientific11039021
אנטיביוטיקה, ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
קולגנאז מסוג IThermo Fisher Scientific17100017
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
מסנן, מסנן מזרק Sterifix 0.2 ומיקרו; מבראון4099206
50  צינור צנטריפוגה חרוטי מ"לSarstedt62,547,254
צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"לSarstedt62,554,502
בקבוק תרבית תאים 75 ס"מ2Sarstedt833,910,002
בקבוק תרבית תאים, 25 ס"מ2Sarstedt833,911,002
מדיום הקפאה, Biofreeze BiochromF 2270
CryotubesThermo Fisher Scientific3772671.8 מ"ל
תמיסת טריפן כחולהSigma-AldrichT81540.4
תא ספירהפול מרינפלד
חומר הרדמה מקומי, קסילוציטין (לידוקאין הידרוכלוריד) 2% עם אפינפרין (אדרנלין) 0.001%תמיסת Mibe
NaClבראון0.9
Vicryl satures, Vicryl rapideEthicon3 - 0
; מדיום הרכבה % %

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096(2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015(2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114(2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183(2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005(2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326(2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300(2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902(2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063(2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406(2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154(2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879(2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113(2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dental Follicle Stem CellsStem Cell IsolationEnzymatic DigestionMicroRNA TransfectionCationic Lipid TransfectionFlow Cytometry AnalysisStem Cell CharacterizationMesenchymal Stromal CellsCell Culture ProtocolGenetic Modification

Related Articles