אפיון פונקציונלי Carboxylesterases הבית בקוטלי חרקים עמידים בזבובים, דומסטיקה זבוב

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר בית carboxylesterase לעוף חלבונים במבחנה עם מערכת ביטוי תא חרקים baculovirus מתווכת, מאוחר יותר פונקציונלית לאפיין את תפקידיהם פרמתרין חילוף חומרים, ובכך, היוועצות pyrethroid התנגדותם מבוססת תא MTT assay, במבחנה מטבולית מחקרים.

Abstract

בתיווך Carboxylesterase חילוף החומרים הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי בהתנגדות בקוטלי חרקים, חרקים שונים. מספר גנים carboxylesterase נמצאו למעלה מוסדר בנימה זבוב הבית עמיד, ואילו התפקידים שלהם משוחח עמידות חרקים נשארו כדי להבטיח את הזמנתכם. . תיכננו פרוטוקול עבור אפיון פונקציונלי carboxylesterases. 3 דוגמה ניסויים מוצגים: (1) בביטוי ובידוד של חלבונים carboxylesterase דרך חרק בתיווך baculovirus זחל כנימה frugiperda (Sf9) תא ביטוי מערכת; (2) MTT מבוססת-תא (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium ברומיד) cytotoxicity assay כדי למדוד את רגישות התאים חרקים כדי הטיפול בפרמתרין שונים; ומחקרים (3) במבחנה חילוף החומרים כדי לבדוק את היכולות מטבולית של carboxylesterases כלפי פרמתרין. הגן carboxylesterase MdαE7 היה שוכפלה מ בית עמיד לטוס זן ALHF, נהגו לבנות baculovirus רקומביננטי לדלקת תאים Sf9. Viabilities תא נגד שונה הטיפול בפרמתרין נמדדו עם MTT וזמינותו. הסובלנות תא משופרת של קבוצת הניסוי (MdαE7-רקומביננטי baculovirus נגוע תאים) לעומת אלו של קבוצות הבקרה (החתול-רקומביננטי baculovirus נגוע תאים ותאים GFP-רקומביננטי baculovirus נגוע) כדי פרמתרין טיפולים הציע את היכולות של MdαE7 של חילוף חומרים קוטלי חרקים, ובכך להגן על תאים מפני נזקים כימיים. חוץ מזה, חלבונים carboxylesterase היו הביע בתאים Sf9 חרקים, מבודד לנהל במבחנה מטבולית המחקר. התוצאות שלנו המצוין של משמעותי במבחנה מטבולית היעילות של MdαE7 כלפי פרמתרין, ישירות המציין את מעורבותם של carboxylesterases של חילוף חומרים קוטלי חרקים וזבובים ולכן היוועצות עמידות חרקים בבית.

Introduction

קוטל חרקים ההתנגדות היא כיום נושא מרכזי של הבית הדברת הזבוב ברחבי העולם^1,2. המאמצים כדי לקבוע המנגנון של עמידות חרקים מאפשר הבנה טובה יותר של בעיה זו, ובכך לספק אסטרטגיות הרומן ביעילות למנוע או לצמצם את התפשטות ההתנגדות פיתוח³. Carboxylesterases, בתור אחד של אנזימים דטוקסיפיקציה הגדולות, משכו המון תשומת לב על השתתפותם ב sequestering, חילוף חומרים קוטלי חרקים שונים חרקים^4,5,6. המחקר הקודם שלנו זיהה carboxylesterases מרובים בזבובים הבית ואת רמות הביטוי שלהם היו לא רק צורונים למעלה מוסדר בנימה ALH....

Protocol

1. ביטוי ובידוד חלבונים היעד עם מערכת ביטוי בתיווך Baculovirus תא חרקים

1. Directionally לשכפל הסתיימה בלאנט מוצרי ה-PCR של חלבונים היעד מהזבובים הבית.
   1. עיצוב תחל ה-PCR של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), הבית לעוף MdαE7 הגן על סמך והרצפים שלהם, את הדרישות המיוחדות של וקטור שבחרת (טבלה 1).
   2. להשתמש של פולימראז DNA thermostable, ההגהה, תחל מהשלב 1.1.1 לביצוע לתגובה PCR 150 µL (µL 30 מאגר התגובה, µL 3 dNTPs 10 מ מ, 1.5 µL של ה-DNA פולימראז, 6 µL של הבית לטוס התבנית DNA, 7.5 µL של פריימר לפנים µL 7.5 של פריימר הפוכה, עם מים µL הסופית נפח 150). חום התגובה PCR 98 ° C ל 30 s, ואחריו 35 מחזורי 98 ° C עבור 10 s, 53 ° C ל 30 s, ו-72 מעלות 6....

Results

הכדאיות תא לכיוון שונה הטיפול בפרמתרין (MTT assay)

Cytotoxicity של פרמתרין נבדק ב MdαE7-רקומביננטי baculovirus נגוע Sf9 תאים (קבוצת הניסוי) ותאים baculovirus (שסופק על-ידי ערכת baculovirus נגוע) נגוע חתול-רקומביננטי (קבוצות הבקרה). הסטייה תא משופרת כדי פרמתרין ב MdαE7 לבטא תאים חריפה לתמוך את התפקידים מטבולית של זו carboxylesterase נגד קוטלי חרקים ותאים ובכך מגן מפני נזקים כימיים. במחקר שלנו, הכדאיות תא נגד ריכוזי פרמתרין שונים (50.......

Discussion

במהלך העשורים האחרונים, מערכות ביטוי heterologous היה בשימוש נרחב כדי לבטא ולבודד כמויות גדולות של חלבונים, ובכך מאפשר נחישות הביוכימי פונקציונלי ואפיון של אנזימים במבחנה. נכון להיום, מספר מערכות מודל שונה לרבות Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae frugiperda זחל כנימה הותאמו עבור ביטוי חלבון רקומביננטי, ואת הבחירה של במבחנה מערכת חיוני לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים מעוניין^22,23.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוהה	ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ	M0491L
QIAquick	QIAGEN	28704
pENTR/D-TOPO, עם זריקה אחת TOP10 מוכשר כימית E. coli	Invitrogen by Life Technology	K240020	S.O.C בינוני ופריימרים אוניברסליים לרצף M13 נכללו בערכה זו.
ערכת PureLink HiPure Plasmid Miniprep	Invitrogen by life technology	K210002
Gateway LR Clonase II תערובת אנזים עבור ערכות BaculoDirectTM	Invitrogen by life technology	11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit	Invitrogen by life technology	12562-019	מגיב טרנספקציה של Cellfectin וגנציקלוביר נכללו בערכה זו
pENTR-CAT פלסמיד	Invitrogen על ידי Life Technology		כלול בערכת העברת DNA ליניארית של BaculoDirect C-Term, ריכוז: 0.5 ug/uL
סרום בקר עוברי מושבת בחום, מאושר	Gibco על ידי Life Technologies	10082-139
תאי Sf9 ב-Sf-900 III SFM	Gibco על ידי Life Technologies	12659017
תאי חרקים-PE LB מיצוי חלבון תאי חרקים & Lysis Buffer	G Biosciences מאת A Geno Technology Inc	786-411
Sf-900 III SFM (1&) מדיום ללא סרום ג'יבקו שלם	של Life Technologies	12658-019
מדיום החרקים של גרייס, ללא תוספת	ג'יבקו של Life Technologies	11595030
תקן אנליטי של פרמתרין (איזומרים)	SUPELCO של Solutions WithinTM	442748
מתנול (מדורג אנליטי)	סיגמא-אולדריץ'	67-56-1
אצטוניטריל (מדורג אנליטי)	Sigma-Aldrich	75-05-8
GHP Acrodisc מסנני מזרק 25 מ"מ עם 0.45 μ m ממברנת GHP (מוסמכת HPLC)	Pall Life Sciences	21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System	Waters
T100 Thermal Cycle	Bio-Rad Laboratories Inc.
Nanodrop 2000/2000c ספקטרופוטומטרים	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Cytation 5 תאים הדמיה Multi-Mode קורא	BioTek